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微生物發(fā)酵工程實驗指導 - 質(zhì)量工程

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微生物發(fā)酵工程實驗指導 - 質(zhì)量工程

微生物發(fā)酵工程實驗指導王金華實驗規(guī)則1、實驗前必須預習實驗指導書。若經(jīng)提問發(fā)現(xiàn)沒有預習者,須在教師指定的時間內(nèi)預習完畢,方得參加實驗。2、實驗前須認真檢查儀器、試劑、用具及實驗材料。如有破損、短缺應立即報告指導教師,經(jīng)同意后方可調(diào)換和補充。對玻璃器皿須做好清洗工作。3、實驗過程中不得隨便挪動外組的儀器、用具和實驗材料。不得隨意撥動儀器開關(guān)或電源開關(guān),須按實驗要求進行。4、實驗材料、藥品的使用,應在不影響實驗結(jié)果的前提下注意節(jié)約,杜絕浪費。5、實驗室應保持肅靜,不得談笑喧嘩,不許搞其他動作,以免影響他人實驗。6、清洗儀器、用具、材料時,須將固形物倒入指定容器內(nèi),不得直接倒入水槽,以免造成水管堵塞。7、實驗過程中,須按操作規(guī)程仔細操作,注意觀察試驗結(jié)果,應及時記錄。不得抄寫他人的實驗實習記錄,否則,須重做。如有疑問,應向指導教師詢問清楚后方可進行。8、實驗完畢后,須將玻璃儀器、用具等清洗干凈,按原來的位置擺設放置。如有破損須報告指導教師,并填寫儀器損壞登記簿。9、在進行實驗過程中,不得隨意食用原料和加工品。10、實驗結(jié)束后,由值日生負責打掃實驗室,保持室內(nèi)整潔,注意關(guān)上水、電、窗、門。實驗一 培養(yǎng)基的配制及滅菌一、實驗目的要求掌握不同類型微生物培養(yǎng)基的配方及其制備方法。二、儀器設備及原材料高壓滅菌鍋,250ml三角瓶,紗布,牛皮紙,瓊脂,其他化學藥品三、常用培養(yǎng)基的配方及制備1、細菌常用培養(yǎng)基(1)LB培養(yǎng)基 蛋白胨 1.0%酵母膏 0.5%NaCl 1.0%可溶性淀粉 0.5%瓊脂 2.0%pH 7.0 滅菌20min。(2)MRS(乳酸菌分離) 牛肉膏0.5%酵母膏0.5%蛋白胨1%葡萄糖1%乳糖0.5%NaCl 0.5% 瓊脂2% pH6.8 固體培養(yǎng)基加瓊脂2%;半固體培養(yǎng)基加瓊脂0.75%2、酵母菌常用培養(yǎng)基(1)麥芽糖培養(yǎng)基 蛋白胨1%麥芽糖2% 酵母膏0.5%瓊脂2%自然pH 滅菌20min。 3、霉菌常用培養(yǎng)基PDA(馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基) 去皮馬鈴薯200g切成小塊,加水1000ml煮沸30min出汁,三層紗布過濾,濾液中加入2%蔗糖,補充水至終體積1000ml,加瓊脂2%,自然pH。滅菌20min。四、實驗中出現(xiàn)的問題及討論 1、配制培養(yǎng)基操作過程中的問題。 2、培養(yǎng)基滅菌操作過程中的問題。 3、培養(yǎng)基滅菌后出現(xiàn)的異常現(xiàn)象,分析原因,討論解決方法。實驗二 酸奶的釀制及乳酸菌的分離一、實驗目的要求1、學習并掌握酸奶制作的基本原理和方法。2、學習并掌握從酸奶中分離和純化乳酸菌的方法。二、基本原理酸奶是以牛乳為主要原料,接入一定量乳酸菌,經(jīng)發(fā)酵后制成的一種具有較高營養(yǎng)價值和特殊風味的發(fā)酵乳制品飲料。通過乳酸菌發(fā)酵牛奶中的乳糖產(chǎn)生乳酸,當產(chǎn)酸到一定程度時,乳酸使牛奶中酪蛋白(約占全乳的29,占乳蛋白的85)變性凝固而使整個奶液呈凝乳狀態(tài)。同時,通過發(fā)酵還可形成酸奶特有的香味和風味(與形成乙醛、丁二酮等有關(guān)),并具有清新爽口的味覺。由于酸奶中含有乳酸菌的菌體及代謝產(chǎn)物,因而對腸道內(nèi)的致病菌有一定的抑制作用;對人體的腸胃消化道疾病也有良好的治療效果。三、器材1、乳酸菌種:自市售各種酸奶中分離 保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Strep tococcus thermophilus) 2、培養(yǎng)基:(1)發(fā)酵培養(yǎng)基:市售鮮奶或用奶粉進行配制(2)分離乳酸菌培養(yǎng)基:(任選一種)培養(yǎng)基平板劃線MRS分離培養(yǎng)基3、優(yōu)質(zhì)全脂奶粉(內(nèi)含脂肪28%,蛋白質(zhì)27%,乳糖37%,礦物質(zhì)6%,水分2%),白砂糖,蒸餾水。4、酸奶發(fā)酵瓶,封口膜,保鮮膜,不銹鋼鍋,鐵勺,塑料漏斗,無菌移液管(帶棉花),脫脂棉,牙簽,培養(yǎng)皿,恒溫水浴鍋,培養(yǎng)箱,冰箱等、溫度計四、操作步驟全脂乳粉、砂糖、水 混合均勻 預熱(60-70) 均質(zhì)(15-18MPa) 滅菌(85-90,5-8min) 冷卻(43-45) 接種 分裝 封口 菌種 活化 母發(fā)酵劑 生產(chǎn)發(fā)酵劑保溫發(fā)酵(42-43,3-6h) 酸奶瓶 清洗 開水燙洗消毒 冷藏(25) 成 品1、酸奶的制作調(diào)配與均質(zhì) 按1:7(:100ml)的比例加水(水質(zhì)要求: PH6.57.3,硬度10度(德國度),在4550下把奶粉配制成復原牛奶,并加入10%白砂糖及適量(0.4-3.0%)穩(wěn)定劑變性淀粉(使制成的酸奶口感飽滿,粘度高,抗機械剪切力強,使酸乳在輸送過程中保持良好狀態(tài)),高速混料,水合45 60min,防止氣泡產(chǎn)生?;蛴檬惺埘r牛奶加5%蔗糖調(diào)勻也可。裝瓶 在250ml的酸奶發(fā)酵瓶中裝入牛奶200ml,裝瓶量80%。滅菌 將裝有牛奶的發(fā)酵瓶置于80恒溫水浴鍋中用巴氏滅菌法10磅滅菌15min,或于90水浴中滅菌5min。冷卻 將已滅菌的牛奶冷卻到40-45。接種 用無菌移液管以5-8%的接種量將市售酸奶接種入冷卻至40-45的牛奶中,并充分搖勻。培養(yǎng) 把接種后的發(fā)酵瓶置于40-42溫箱中培養(yǎng)4-12h。當乳酸酸度升高到0.8%,pH降低到4.2-4.4時,凝乳完全形成并有少量乳清析出,表面有小顆粒(視情況而定,培養(yǎng)過程中切勿搖動,以防乳塊散掉,不易重結(jié))。冷藏后熟 酸奶在發(fā)酵形成凝塊后,取出置1-7的低溫下冷藏12-24h,后熟,以獲得酸奶的特有風味和口感。品味 品嘗自己制作的酸奶,判斷其感官品質(zhì)是否達到要求,若達不到要求,分析其原因。酸奶質(zhì)量的評定以品嘗為標準,通常有色澤、凝塊狀態(tài),表層光潔度、酸度及香味、無異味等各項指標。感官檢驗試驗方法 色澤和組織狀態(tài):取適量試樣于50mL燒杯中,在自然光下觀察色澤和組織狀態(tài)。 滋味和氣味:取適量試樣于50mL燒杯中,先聞氣味,然后用溫開水漱口,再品嘗樣品的滋味。品嘗時發(fā)現(xiàn)有異味則可判定污染了雜菌。貯存 產(chǎn)品的貯存溫度為26。2、酸奶中乳酸菌的分離純化倒平板培養(yǎng)基:將分離用培養(yǎng)基完全融化并冷卻到45左右倒平板,冷凝空白培養(yǎng)后備用。稀釋:將待分離的酸奶進行適當稀釋,取一定稀釋度的菌液做平板分離。分離純化:乳酸菌的分離可采用新鮮酸奶進行平板涂布分離,或直接用接種環(huán)蘸取酸奶作劃線分離。分離后,置于37下培養(yǎng)以獲得單菌落。觀察菌落特征:經(jīng)2-3d培養(yǎng),待菌落長成后,仔細觀察并區(qū)別不同類型的乳酸菌。酸奶中的各種乳酸菌在馬鈴薯汁牛奶培養(yǎng)基平板表面通常呈現(xiàn)三種形態(tài)特征的菌落:扁平型菌落:大小為2-3mm,邊緣不整齊,很薄,近似透明狀,染色鏡檢為細桿菌;半球狀隆起菌落:大小為1-2mm,隆起成半球狀,高約0.5mm,邊緣整齊且四周可見酪蛋白水解透明圈,染色鏡檢為鏈球狀;禮帽形突起菌落:大小為1-2mm,邊緣基本整齊,菌落中央呈隆起狀,四周較薄,有酪蛋白透明圈,染色鏡檢呈鏈球狀。單菌株發(fā)酵試驗:若將上述單菌落接入牛奶,經(jīng)活化增殖后再以10%的接種量接入消毒后的牛奶中,分別于37和45下培養(yǎng),各菌株的發(fā)酵液均可達到108個細胞/ml。若采用兩種菌株混合培養(yǎng),則含菌量??杀对?。品嘗:單株發(fā)酵成的酸奶與混菌發(fā)酵成的酸奶相比較,其香味和口感都比較差。兩菌混合發(fā)酵又以球菌和桿菌等量混合接種所發(fā)酵成的酸奶為佳。 桿菌產(chǎn)酶分解蛋白質(zhì)氨基酸球菌產(chǎn)酸蛋白質(zhì)變性凝結(jié)成塊醇酯化香味在制備酸奶時,保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的混合物在4050乳中發(fā)酵23h即可達到所需的凝乳狀態(tài)與酸度,而任何單一菌株的發(fā)酵時間都在10h以上,其原因就是因為保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌之間存在互生現(xiàn)象。保加利亞乳桿菌在發(fā)酵的初期分解酪蛋白而形成氨基酸和多肽,促進了嗜熱鏈球菌的生長,隨著嗜熱鏈球菌的增加,酸度增加,抑制了嗜熱鏈球菌的生長。嗜熱鏈球菌生長過程中,乳脲活動產(chǎn)生CO2、甲酸刺激保加利亞乳桿菌生長。發(fā)酵的初期嗜熱鏈球菌生長的快;發(fā)酵1小時后與保加利亞乳桿菌的比例為(3-4):1。3、感官特性       應符合表1的規(guī)定。 表1項  目純酸牛乳調(diào)味酸牛乳、果料乳牛乳色澤呈均勻一致的乳白色或微黃色呈均勻一致的乳白色,或調(diào)味乳、果料應有的色澤滋味和氣味具有酸牛乳固有的滋味和氣味具有調(diào)味酸牛乳或果料酸牛乳應有的滋味和氣味組織狀態(tài)組織細膩、均勻,允許有少量浮清析出;果料酸牛乳有果塊或果粒4、衛(wèi)生指標       應符合表2的規(guī)定。 表2項  目純酸牛乳調(diào)味酸牛乳果料酸牛乳苯甲酸,g/kg                         山梨酸,g/kg                         不得檢出硝酸鹽(以NaNO3計),mg /kg         亞硝酸鹽(以NaNO2計),mg/kg        黃曲霉毒素M1, g /kg                大腸菌群,MPN/100Ml                90致病菌(指腸道致病菌和致病性球菌)不得檢出五、實驗報告1、將各批混菌發(fā)酵的酸奶品評結(jié)果記錄于下表中。批次品 評 項 目凝乳情況乳清淅出狀態(tài)稀薄粘度表面氣泡沫表面光澤口感酸度香味異味發(fā)粘pH結(jié)論12342、將單菌和混菌發(fā)酵的酸奶品評結(jié)果記錄于下表中。單菌及混菌比例品 評 項 目pH結(jié)論凝乳情況口感香味異味桿 菌球 菌桿菌:球菌(1:1)桿菌:球菌(1:4)3、在制備酸奶時,為何混菌發(fā)酵比單一菌株發(fā)酵更優(yōu)越?4、雙岐桿菌的乳酸發(fā)酵途徑與明串珠菌的乳酸發(fā)酵途徑有什么不同? 實驗三 甜酒釀的制作和酒藥中糖化菌的分離一、目的要求1、學習并掌握甜酒釀的釀制方法,了解釀酒的基本原理。2、進一步了解淀粉在糖化菌根霉、毛霉和酵母菌作用下制成甜酒釀的過程。3、進一步掌握微生物的分離、培養(yǎng)等基本方法和無菌操作技術(shù)。4、加深理解根霉或毛霉的形成特征。二、基本原理甜酒釀是將糯米經(jīng)過蒸煮糊化,接種后,在適宜的條件下(28-30),讓種曲中的霉菌孢子萌發(fā)菌絲體,大量繁殖后通過酒藥(根霉、毛霉和酵母菌等微生物的混合糖化發(fā)酵劑)中的根霉和毛霉等微生物所產(chǎn)淀粉酶的作用將原料中糊化后的淀粉糖化,將蛋白質(zhì)水解成氨基酸,然后酒藥中的酵母菌利用糖化產(chǎn)物生長繁殖,并通過酵解途徑將糖轉(zhuǎn)化成酒精,從而賦予甜酒釀特有的香氣、風味和豐富的營養(yǎng)。隨著發(fā)酵時間延長,甜酒釀中的糖分逐漸轉(zhuǎn)化成酒精,因而糖度下降酒度提高,故適時結(jié)束發(fā)酵是保持甜酒釀口味的關(guān)鍵。要初步學會和掌握釀制方法并不困難,從微生物學的觀點來看,釀制的關(guān)鍵在于:要有優(yōu)質(zhì)的酒釀種曲,即種曲中應含有糖化率高的優(yōu)質(zhì)根霉、毛霉孢子或菌絲體;應選擇優(yōu)質(zhì)的糯米作原料;嚴格無菌操作規(guī)程,盡量避免雜菌污染;合理控制釀制條件等。 以糯米(或大米)經(jīng)甜酒藥發(fā)酵制成的甜酒釀,是我國的傳統(tǒng)發(fā)酵食品。我國釀酒工業(yè)中的小曲酒和黃酒生產(chǎn)中的淋飯酒在某種程度上就是由甜酒釀發(fā)展而來的。三、實驗材料酒藥()、糯米,馬鈴薯,蔗糖甜酒藥中糖化菌的分離培養(yǎng)基:馬鈴薯-蔗糖-瓊脂培養(yǎng)基蒸鍋,紗布,1000ml燒杯,250ml廣口培養(yǎng)瓶,封口膜,保鮮膜,牛皮紙,天平,培養(yǎng)箱,高壓滅菌鍋、淘米盆、防水紙、繩子、涼開水,顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、解剖針、酒精燈、鑷子、培養(yǎng)皿等。四、操作步驟(一)甜酒釀的制作 酒 藥 洗米 蒸飯 淋水 降溫 落缸搭窩 發(fā)酵 甜酒釀1、浸米與洗米:選擇優(yōu)質(zhì)新鮮糯米,淘洗干凈后浸泡過夜,使米粒中的淀粉粒子吸水膨脹,便于蒸煮糊化,清水沖洗至水清亮,撈起瀝干。 2、隔水蒸煮:將糯米放在蒸鍋內(nèi)擱架的紗布上隔水蒸煮,15磅10-20min,常壓30min,至米飯熟透為止。要求達到熟而不糊,外硬內(nèi)軟,內(nèi)無夾心,疏松易散,透而不爛,均勻一致。3、淋水降溫:用清潔冷水淋洗蒸熟的糯米飯,使其降溫至35左右,同時使飯粒松散。4、接入種曲釀制:將冷卻到35左右的米飯,按干糯米重量換算接種量,將0.4%的經(jīng)粉碎的根霉曲與米飯拌勻,盛于廣口培養(yǎng)瓶中,飯粒搭成中心下陷的喇叭形凹窩,以利于出汁,飯面均勻撒上少許曲粉,用封口膜及牛皮紙覆蓋于廣口培養(yǎng)瓶表面,用線包扎后置于30溫箱保溫培養(yǎng)48h即可食用。釀成的甜酒釀應是醪液清澈半透明而甜醇爽口。5、品嘗(二)甜酒藥中糖化菌的分離無菌操作技術(shù),以平板劃線法分離甜酒藥中的糖化菌1. 每組取無菌培養(yǎng)皿兩付,先在培養(yǎng)皿中加入兩滴5000U/mL的鏈霉素液,而后用已融化的馬鈴薯-蔗糖-瓊脂培養(yǎng)基倒平板,使鏈霉素與培養(yǎng)基充分混勻,制成平板。2. 取已被碾碎的甜酒藥粉1環(huán)在平板上劃線,然后倒置于2830恒溫箱中培養(yǎng)46d。3. 觀察平板上的菌落形態(tài),用接種環(huán)調(diào)取霉菌菌落的孢子或菌絲體于新鮮的馬鈴薯-蔗糖-瓊脂平板上,再進行劃線培養(yǎng),直至獲得純培養(yǎng),即平板上只有一種霉菌的菌落或菌苔。對已分離出的糖化菌進行個體形態(tài)的觀察1.打開皿底用低倍鏡直接觀察分離菌各部分結(jié)構(gòu)形態(tài),如孢囊梗、孢囊、囊軸、假根、匍匐菌絲。 2.取一干凈的載玻片,滴一滴乳酚油,然后用解剖針挑取少量帶有孢囊的分離菌菌絲放在懸滴液中,將菌絲分散平鋪,然后蓋上蓋玻片,輕輕一壓,注意應避免氣泡產(chǎn)生。3.鏡檢:先用低倍鏡觀察菌絲有無隔膜,孢囊梗的形態(tài),孢囊的著生方式,孢囊和囊軸的形態(tài)和大小。然后換成中倍鏡觀察,繪制分離菌的形態(tài)圖,注明各部位名稱。并根據(jù)菌落和菌體形態(tài)特征,判斷出該分離菌是何種真菌。五、實驗報告 1、實驗結(jié)果(1)發(fā)酵期間每天觀察、記錄發(fā)酵現(xiàn)象。(2)對產(chǎn)品進行感官評定,將各批發(fā)酵的甜酒釀品評結(jié)果記錄于下表中。寫出品嘗體會。批 次品 評 項 目結(jié)論出汁(ml)口感酒度甜味異味pH12342、甜酒釀制作中有哪幾類微生物參與發(fā)酵作用?各自起何種作用?3、成功制作甜酒釀的關(guān)鍵步驟是什么?實驗四 檸檬酸產(chǎn)生菌的分離及檸檬酸的固體發(fā)酵一、目的要求1、學習從環(huán)境中選出能產(chǎn)檸檬酸的霉菌,了解從環(huán)境中獲得目的菌種的一般方法;2、掌握檸檬酸的發(fā)酵、提取、檢測方法。二、實驗原理檸檬酸發(fā)酵是利用微生物在一定條件下的生命代謝活動而獲得產(chǎn)品的。不論采用何種菌株,檸檬酸發(fā)酵都是典型的好氧發(fā)酵。工業(yè)上的好氧發(fā)酵發(fā)基本上有三種,即表面發(fā)酵、固體發(fā)酵和深層發(fā)酵。前兩種方法利用空氣氣相中的氧氣,后者則是利用液體中的溶解氧。至今在檸檬酸發(fā)酵工業(yè)中,上述三種發(fā)酵工藝均并存。雖然液體深層發(fā)酵法已大量代替了固體發(fā)酵法,但處于一些廢渣的利用及投資較少的緣故,在一些地方淺層固體法生產(chǎn)檸檬酸仍在使用中。適合于固體發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸的原料諸如:甘薯渣、木薯渣、蘋果渣和甘蔗渣等。檸檬酸的固體發(fā)酵工藝分為淺層法和厚層法,均是將發(fā)酵原料、輔料及菌體放在疏松的固體支持物上,經(jīng)過微生物的代謝活動,將原料中的可發(fā)酵成分轉(zhuǎn)化為檸檬酸的過程。1、黑曲霉發(fā)酵糖類生成檸檬酸的能力很強,其主要特征是耐酸性極強,在pH為1.6的情況下,仍能良好生長。利用這一特點,采用pH為1.6的酸性營養(yǎng)濾紙即可分離該菌種;2、發(fā)酵產(chǎn)物中檸檬酸為多鹽有機酸,能與CaCO3形成沉淀,利用鈣鹽法即可檢測。三、實驗材料及用品1、樣品:霉爛的桔皮2、菌種:黑曲霉(Aspergillus . niger)IFFI 23153、培養(yǎng)基和試劑:(1) 酸性蔗糖培養(yǎng)基 蔗糖15% NH4NO30.2% KH2PO40.1% MgSO47H2O 0.25% 用鹽酸調(diào)pH 121滅菌20min(2)固體發(fā)酵培養(yǎng)基 米糠:麩皮=2:1,65%水分(45ml:50g),121滅菌30min(3)0.1M NaOH溶液,1M鹽酸 (4)0.5%酚酞指示劑:酚酞,溶于100ml 95%乙醇中4、器皿:白瓷托盤,保鮮膜,切刀,菜板,培養(yǎng)皿(帶濾紙),250ml三角瓶,搖床,恒溫培養(yǎng)箱,滅菌鍋,酸堿滴定管,紗布,牛皮紙四、實驗步驟(一)深層液體發(fā)酵1、菌種分離:取霉爛桔皮(2)放入10ml三角瓶中,振蕩35min,然后用水稀釋510倍;2、菌種純化:取稀釋液0.51ml放入酸性培養(yǎng)基上(稀釋液:培養(yǎng)基=1:10),搖勻,傾倒在平皿中的濾紙上,25培養(yǎng)23d即有菌落產(chǎn)生;3、發(fā)酵:將培養(yǎng)出的霉菌接種入液體酸性蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基中(25ml/250ml三角瓶),30搖床培養(yǎng)23d,過濾收集發(fā)酵液。(二)淺層固體發(fā)酵1、培養(yǎng)基制備:將米糠:麩皮按照2:1的比例配料,加65%的水分(45ml:50g),拌勻后按15g/250ml分裝到三角瓶中,用紗布牛皮紙封扎瓶口,于121,滅菌30min。2、接種:將培養(yǎng)基趁熱打散,待降溫到37,即可將黑曲霉孢子接種到其中,振蕩混勻。3、發(fā)酵:培養(yǎng)溫度30-32,經(jīng)24h培養(yǎng)后搖瓶一次,測pH;將三角瓶放平后繼續(xù)培養(yǎng)24h左右使培養(yǎng)基結(jié)成塊狀。此時應扣瓶使之充分通氣并散熱,測pH;再培養(yǎng)72h使瓶內(nèi)長滿豐盛的孢子即可出料,測pH。4、產(chǎn)物檢測:(1)檸檬酸鑒定 取5ml發(fā)酵液于試管中,滴入飽和CaCO3溶液,有白色沉淀則證明產(chǎn)生檸檬酸。(2)產(chǎn)酸量測定 取10ml發(fā)酵液(10g醅樣,加蒸餾水100ml浸泡15min后過濾得濾液),滴加0.5%酚酞指示劑2滴,用標準NaOH溶液滴定至淡粉紅色,計算產(chǎn)酸量(標準滴定法)。五、實驗報告1、將發(fā)酵全過程測定酸度的pH值繪制成曲線圖。2、計算出實際實驗發(fā)酵液的產(chǎn)酸量。3、檸檬酸固體發(fā)酵過程中應注意哪些操作要點?實驗五 酒精發(fā)酵及下游處理實驗一、實驗目的掌握酒精發(fā)酵工藝的具體操作。二、實驗原理EMP途徑 脫 羧 還 原己糖 丙酮酸 乙醛 乙醇(酒精)三、材料:玉米粉,糯米,高粱粉,釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)器材:燒杯,玻璃棒,天平,電爐,鋼鍋,5L三角瓶,恒溫箱,彈孔膠塞,發(fā)酵栓,蒸餾裝置,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,冰箱四、工藝流程原料 液化、糖化處理 制醪 發(fā)酵 過濾 濾液(測酒度)五、實驗步驟1、稱取原材料各1kg,將其進行液化和糖化處理,液化的目的是使淀粉水溶性增大,糖化的目的是將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖,有利于酵母的發(fā)酵;將液化和糖化的原料分裝入2000ml的三角瓶中,裝罐系數(shù)為40-80%;測定糖度。2、按照1.01.2%的比例稱取活性干酵母,將其倒入燒杯中,加入適量的水、葡萄糖、NaCl,放于30恒溫箱中保溫20min,進行干性酵母活化。待酵母活化后,按10%將其接種到裝有原料的三角瓶中。3、將接種的三角瓶置于28的恒溫箱中進行發(fā)酵48h,用單孔膠塞接一橡皮管,末端接發(fā)酵栓(或倒扣一個漏斗),置于裝水的燒杯中,排氣。4、發(fā)酵結(jié)束后,測定發(fā)酵液pH、糖度。將發(fā)酵液微熱到40左右,降低發(fā)酵液的黏度,將其用紗布過濾,得濾液。5、測濾液酒度,計算100g原料出酒率。六、實驗報告 思考題1、在發(fā)酵過程中如何控制酵母菌生長的最適溫度?2、原料破碎徹底與否與提高酒精得率有何關(guān)系?3、計算100g原料出酒率。實驗六、釀酒葡萄成熟度的控制以及入罐發(fā)酵一、目的與要求 成熟度是決定葡萄酒質(zhì)量的重要因素。通過測定漿果的成熟度,來了解原料的成熟質(zhì)量,確定各品種的最佳工藝成熟度,并以此決定葡萄酒類型和相應的工藝條件。同時簡單了解葡萄酒釀制的工藝原理。二、試劑與儀器1.pH計、手持糖量計、托盤天平、量筒、水浴鍋、電爐、移液管、錐形瓶、容量瓶、5L玻璃瓶。干紅葡萄酒的發(fā)酵工藝過程圖2.斐林試劑A、B液,1%次甲基蘭,0.1mol/L氫氧化鈉溶液、1%酚酞指示劑、鄰苯二甲酸氫鉀,95%酒精,鹽酸等。三、方法與步驟1.采樣:從轉(zhuǎn)色期開始每隔5-7天采樣一次,對于大面積園,采用250株取樣法:每株隨機取1-2粒果實,并取300400粒;面積較小的品種??呻S機取5 - l0穗果實,裝入塑料袋于冰壺中,迅速帶回實驗室分析。簡單的成熟度的測定可用手持糖量計測定,如果是精確的測定可在實驗室中采用斐林試劑測定。2.百粒重與百粒體積,隨機取100粒果實,稱重,然后將其放入250ml(或500ml)量筒中,加入一定體積的水,至完全淹沒果實讀取量筒水面的讀數(shù),減去加入時的水量,即為百粒體積。 3.出汁率的測定;取100g分選較好的葡萄果粒,用紗布擠汁,放入小燒杯中,立即稱量;出汁率=葡萄汁重量/葡萄果實重量。計算:在發(fā)酵結(jié)束后還需要再進行出汁率的測定。 自流汁率()=W1/W2 x 100 總出汁率()=(W1+W2)/ Ws x 100式中W1葡萄漿自流汁的重量,(g); Ws試樣重量,(g); W2經(jīng)壓榨流出的葡萄汁重量,(g)。4.可溶性固形物與pH值;用手持糖量計測定葡萄汁的可溶性固形物(),取20ml汁測pH值。5.還原糖與總酸:用斐林試劑法測定還原糖,用堿滴定法測定總酸。6.果皮色價測定:取20粒果實,洗凈擦干,撕下果皮并用吸水紙擦凈皮上所帶果肉及果汁,然后剪碎,稱取果皮用鹽酸乙醇溶液(1 mol/L鹽酸 : 95乙醇 = 15:85)50ml浸泡,浸泡20小時左右,然后測定540nm下的吸光度,計算果皮色價(XA x 10)/W (XA吸光度,W果皮重量g)。7.入罐:分選葡萄果實,剔除病蟲、生青、腐爛的果實。除梗,破碎30%,入罐。四、結(jié)果及分析評價漿果的成熟質(zhì)量。 實驗七、干紅葡萄酒發(fā)酵的監(jiān)控一、實驗的目的掌握干紅葡萄酒釀造中發(fā)酵的監(jiān)控方法及相關(guān)的操作要求。二、所需儀器及試劑:1. 儀器: 5升、10升玻璃瓶,塑料盆,紗布、溫度計、比重計、天平、木棍、燒杯、量筒等。2. 試劑:亞硫酸(6%)、白砂糖、酵母、KHCO3。三、實驗內(nèi)容1. 酵母、果膠酶的活化:采用工業(yè)專用酵母,按照200mg/L的量稱取酵母,放入三角瓶中,加入50mL蒸餾水,在40條件下活化20分鐘。按照20mg/L稱取果膠酶,在40左右活化10分鐘。2. 裝瓶:裝量不超過瓶容的75,同時按汁量加入5080mg/LS02攪勻,亞硫酸的濃度為6%,6%亞硫酸溶液的密度是/ml,添加量的計算(0.8ml/kg果實):葡萄果實kg××1000×ml。并加入果膠酶20mg/L(或按說明書)同時取汁測糖、酸、比重、溫度。(注:添加的酵母、果膠酶以及亞硫酸的量都是以葡萄汁的量來計算)。3.浸漬發(fā)酵:每天測兩次比重、溫度,并定期用木柄壓“帽”、用冷水噴淋或在空調(diào)室內(nèi)控溫至2630。5當比重降至10101020時,出酒,同時壓榨皮渣,混合、控溫1820,進行后發(fā)酵管理。6. 當相對密度降到0.993 - 0.998時(殘?zhí)?lt;2g/L時),酒精發(fā)酵結(jié)束,用KHCO3調(diào)整PH3. 2,觸發(fā)蘋果酸-乳酸發(fā)酵。7. 貯藏:滿瓶、調(diào)游離S02為2030mg/L。8. 下膠與過濾,自然澄清半年后,用明膠下膠,通過下膠實驗確定用量(5-20g/hL),然后用澄清板過濾。9. 穩(wěn)定性試驗:檢查酒的氧化、鐵、銅、色素、微生物穩(wěn)定性,若需要應進行相應的處理。10. 裝瓶:將酒冷至其冰點以上左右,在同溫條件下進行澄清、除菌過濾。并加入5-10 g/L SO2,打塞、臥放貯存。四、思考與練習 如何確定紅葡萄酒的皮渣分離時間?試驗八、葡萄酒發(fā)酵結(jié)束的理化指標的測定一、 實驗目的了解如何確定葡萄酒酒精發(fā)酵的結(jié)束,同時對葡萄酒進行分離和封裝,轉(zhuǎn)入后發(fā)酵階段。熟悉各個理化指標的測定方法。二、所需要的儀器和試劑:1. 電爐,蒸餾裝置,膠帶,酒精計(0-40%)(V/V) 2. 費林試劑,0.1N氫氧化鈉,酚酞指示劑(1%),次甲基藍指示劑,量筒,葡萄糖5g/L。三、實驗步驟:3.揮發(fā)酸的測定:揮發(fā)酸小于1g/L。4.酒度的測定:量取50mL酒樣,移入圓底燒瓶中,加入100mL蒸餾水,連接酒精蒸餾裝置,加熱蒸餾,直到蒸出的液體大約100毫升時,用蒸餾水定容至100mL,然后用酒精計測定酒精度,并且還要測定相應的溫度,記錄溫度和酒精度。四、討論1. 在酒精度的測定中需要進行校正。學會如何校正讀數(shù)。實驗九 自制葡萄酒1、將成熟的葡萄去枝,洗凈,瀝干。 2、將晾干的葡萄用粉碎機粉碎(用手捏碎)。   3、將葡萄液加入2的白糖攪拌后加蓋,葡萄只能裝到容器的2/3處,自然氣溫在20-30為最佳。然后將瓶口密封,進入發(fā)酵。   4、在瓶內(nèi)密封24h后,有泡沫出現(xiàn),汁液析出,葡萄皮浮起,每天用勺子攪動兩次,將葡萄皮壓到汁液中,讓它充分浸泡。7d后當酒液糖度<5°,酒度>11%,pH>3.2(3.5-3.7),前發(fā)酵結(jié)束這時打開蓋聞之,如有酒香氣撲鼻,即可用紗布將酒渣濾去,然后加入10的白酒和10的白糖,攪拌后進行發(fā)酵,這時酒壺應放在10-20(<25)(紅:15 少量O2,白:13 適量O2)陰涼處。   5、1-2個月后,葡萄酒成熟,酒色呈桔黃色或玫瑰色,酒濃香醇,味有點酸。此時過濾一次(要用多層紗布),方可裝入瓶(80熱水洗瓶)內(nèi),18倒放或臥放備用。   40mg/l:1L葡萄酒里需要加入6%的亞硫酸溶液0.648ml。 注意:   1)  第一次發(fā)酵期要用玻璃瓶(23天)   2)  第二次發(fā)酵期要用小口塑料壺(不要隨時打開瓶蓋) 首先準備一個大的廣口瓶或者瓦罐,長度左右的虹吸管,一把勺子。原材料是按照10kg葡萄白糖備料。先將葡萄洗干凈,晾干水分,用手捏碎放進廣口瓶內(nèi),每放一部分葡萄放一層白糖,葡萄只能裝到容器的2/3處,自然氣溫在20-30為最佳。然后將瓶口密封,但是切記不要將瓶口封的太緊,防止發(fā)酵時發(fā)生爆炸。在瓶內(nèi)密封24h后,有泡沫出現(xiàn),汁液析出,葡萄皮浮起,每天用勺子攪動兩次,將葡萄皮壓到汁液中,讓它充分浸泡。7-10d后,發(fā)酵趨于平緩,葡萄皮由深色變?yōu)闇\色,這時用虹吸管將容器內(nèi)的酒液抽出,然后用紗布將剩于葡萄皮內(nèi)的酒液擰出。按10kg原酒一個雞蛋的比例將(5-10g/hL)打到起泡,倒入酒中攪勻,下膠(明膠:5-10g/hL)。靜置15d。再用虹吸管將上面的酒液抽出,就成了晶瑩透亮的成品葡萄酒。成品葡萄酒指標:糖酸酒精顏色單寧(g/L)pH(11-12)

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