微生物發(fā)酵工程實驗指導(dǎo) - 質(zhì)量工程

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1、微生物發(fā)酵工程實驗指導(dǎo) 王金華 實驗規(guī)則 1、實驗前必須預(yù)習(xí)實驗指導(dǎo)書。若經(jīng)提問發(fā)現(xiàn)沒有預(yù)習(xí)者，須在教師指定的時間內(nèi)預(yù)習(xí)完畢，方得參加實驗。 2、實驗前須認(rèn)真檢查儀器、試劑、用具及實驗材料。如有破損、短缺應(yīng)立即報告指導(dǎo)教師，經(jīng)同意后方可調(diào)換和補充。對玻璃器皿須做好清洗工作。 3、實驗過程中不得隨便挪動外組的儀器、用具和實驗材料。不得隨意撥動儀器開關(guān)或電源開關(guān)，須按實驗要求進(jìn)行。 4、實驗材料、藥品的使用，應(yīng)在不影響實驗結(jié)果的前提下注意節(jié)約，杜絕浪費。 5、實驗室應(yīng)保持肅靜，不得談笑喧嘩，不許搞其他動作，以免影響他人實驗。 6、清洗儀器、用具、材料時，須將固形物倒入指定容

2、器內(nèi)，不得直接倒入水槽，以免造成水管堵塞。 7、實驗過程中，須按操作規(guī)程仔細(xì)操作，注意觀察試驗結(jié)果，應(yīng)及時記錄。不得抄寫他人的實驗實習(xí)記錄，否則，須重做。如有疑問，應(yīng)向指導(dǎo)教師詢問清楚后方可進(jìn)行。 8、實驗完畢后，須將玻璃儀器、用具等清洗干凈，按原來的位置擺設(shè)放置。如有破損須報告指導(dǎo)教師，并填寫儀器損壞登記簿。 9、在進(jìn)行實驗過程中，不得隨意食用原料和加工品。 10、實驗結(jié)束后，由值日生負(fù)責(zé)打掃實驗室，保持室內(nèi)整潔，注意關(guān)上水、電、窗、門。 實驗一 培養(yǎng)基的配制及滅菌 一、實驗?zāi)康囊? 掌握不同類型微生物培養(yǎng)基的配方及其制備方法。 二、儀器設(shè)備及原材料 高壓滅菌鍋，250

3、ml三角瓶，紗布，牛皮紙，瓊脂，其他化學(xué)藥品 三、常用培養(yǎng)基的配方及制備 1、細(xì)菌常用培養(yǎng)基 （1）LB培養(yǎng)基 蛋白胨 1.0% 酵母膏 0.5% NaCl 1.0% 可溶性淀粉 0.5% 瓊脂 2.0% pH 7.0 ℃滅菌20min。 （2）MRS（乳酸菌分離） 牛肉膏0.5% 酵母膏0.5% 蛋白胨1% 葡萄糖1% 乳糖0.5% NaCl 0.5% 瓊脂2% pH6.8 固體培養(yǎng)基加瓊脂2%；半固體培養(yǎng)基加瓊脂0.75% 2、酵母菌常用培養(yǎng)基 （1）麥芽糖

4、培養(yǎng)基 蛋白胨1% 麥芽糖2% 酵母膏0.5% 瓊脂2% 自然pH ℃滅菌20min。 3、霉菌常用培養(yǎng)基 PDA（馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基） 去皮馬鈴薯200g切成小塊，加水1000ml煮沸30min出汁，三層紗布過濾，濾液中加入2%蔗糖，補充水至終體積1000ml，加瓊脂2%，自然pH?！鏈缇?0min。 四、實驗中出現(xiàn)的問題及討論 1、配制培養(yǎng)基操作過程中的問題。 2、培養(yǎng)基滅菌操作過程中的問題。 3、培養(yǎng)基滅菌后出現(xiàn)的異?，F(xiàn)象，分析原因，討論解決方法。 實驗二 酸奶的釀制及乳酸菌的分離 一、實驗?zāi)康囊? 1、學(xué)習(xí)并掌握酸奶制作

5、的基本原理和方法。 2、學(xué)習(xí)并掌握從酸奶中分離和純化乳酸菌的方法。 二、基本原理 酸奶是以牛乳為主要原料，接入一定量乳酸菌，經(jīng)發(fā)酵后制成的一種具有較高營養(yǎng)價值和特殊風(fēng)味的發(fā)酵乳制品飲料。通過乳酸菌發(fā)酵牛奶中的乳糖產(chǎn)生乳酸，當(dāng)產(chǎn)酸到一定程度時，乳酸使牛奶中酪蛋白(約占全乳的2．9％，占乳蛋白的85％)變性凝固而使整個奶液呈凝乳狀態(tài)。同時，通過發(fā)酵還可形成酸奶特有的香味和風(fēng)味(與形成乙醛、丁二酮等有關(guān))，并具有清新爽口的味覺。由于酸奶中含有乳酸菌的菌體及代謝產(chǎn)物，因而對腸道內(nèi)的致病菌有一定的抑制作用；對人體的腸胃消化道疾病也有良好的治療效果。 三、器材 1、乳酸菌種：自市售各種酸奶中分離

6、 保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Strep． tococcus thermophilus) 2、培養(yǎng)基： （1）發(fā)酵培養(yǎng)基：市售鮮奶或用奶粉進(jìn)行配制 （2）分離乳酸菌培養(yǎng)基：（任選一種）培養(yǎng)基→平板→劃線 MRS分離培養(yǎng)基 3、優(yōu)質(zhì)全脂奶粉（內(nèi)含脂肪28%，蛋白質(zhì)27%，乳糖37%，礦物質(zhì)6%，水分2%），白砂糖，蒸餾水。 4、酸奶發(fā)酵瓶，封口膜，保鮮膜，不銹鋼鍋，鐵勺，塑料漏斗，無菌移液管（帶棉花），脫脂棉，牙簽，培養(yǎng)皿，恒溫水浴鍋，培養(yǎng)箱，冰箱等、溫度計 四、操作步驟 全脂乳粉、砂糖、水 混合均勻 預(yù)熱

7、(60-70℃) 均質(zhì)(15-18MPa) 滅菌(85-90℃，5-8min) 冷卻(43-45℃) 接種 分裝 封口 菌種 活化 母發(fā)酵劑 生產(chǎn)發(fā)酵劑 保溫發(fā)酵(42-43℃，3-6h) 酸奶瓶 清洗 開水燙洗消毒 冷藏(2～5℃) 成 品 1、酸奶的制作 ⑴調(diào)配與均質(zhì) 按1:7（:100ml）的比例加水（水質(zhì)要求：

8、PH6.5～7.3，硬度≤10度（德國度）），在45～50℃下把奶粉配制成復(fù)原牛奶，并加入10%白砂糖及適量（0.4-3.0%）穩(wěn)定劑變性淀粉（使制成的酸奶口感飽滿，粘度高，抗機械剪切力強，使酸乳在輸送過程中保持良好狀態(tài)），高速混料，水合45 ～60min，防止氣泡產(chǎn)生。或用市售鮮牛奶加5%蔗糖調(diào)勻也可。 ⑵裝瓶 在250ml的酸奶發(fā)酵瓶中裝入牛奶200ml，裝瓶量80%。 ⑶滅菌 將裝有牛奶的發(fā)酵瓶置于80℃恒溫水浴鍋中用巴氏滅菌法10磅滅菌15min，或于90℃水浴中滅菌5min。 ⑷冷卻 將已滅菌的牛奶冷卻到40-45℃。 ⑸接種 用無菌移液管以5-8%的

9、接種量將市售酸奶接種入冷卻至40-45℃的牛奶中，并充分搖勻。 ⑹培養(yǎng) 把接種后的發(fā)酵瓶置于40-42℃溫箱中培養(yǎng)4-12h。當(dāng)乳酸酸度升高到0.8%，pH降低到4.2-4.4時，凝乳完全形成并有少量乳清析出，表面有小顆粒（視情況而定，培養(yǎng)過程中切勿搖動，以防乳塊散掉，不易重結(jié)）。 ⑺冷藏后熟 酸奶在發(fā)酵形成凝塊后，取出置1-7℃的低溫下冷藏12-24h，后熟，以獲得酸奶的特有風(fēng)味和口感。 ⑻品味 品嘗自己制作的酸奶，判斷其感官品質(zhì)是否達(dá)到要求，若達(dá)不到要求，分析其原因。 酸奶質(zhì)量的評定以品嘗為標(biāo)準(zhǔn)，通常有色澤、凝塊狀態(tài)，表層光潔度、酸度及香味、無異味等各項指標(biāo)。感官

10、檢驗試驗方法 ① 色澤和組織狀態(tài)：取適量試樣于50mL燒杯中，在自然光下觀察色澤和組織狀態(tài)。 ② 滋味和氣味：取適量試樣于50mL燒杯中，先聞氣味，然后用溫開水漱口，再品嘗樣品的滋味。 品嘗時發(fā)現(xiàn)有異味則可判定污染了雜菌。 ⑼貯存 產(chǎn)品的貯存溫度為2℃~6℃。 2、酸奶中乳酸菌的分離純化 ⑴倒平板培養(yǎng)基：將分離用培養(yǎng)基完全融化并冷卻到45℃左右倒平板，冷凝空白培養(yǎng)后備用。 ⑵稀釋：將待分離的酸奶進(jìn)行適當(dāng)稀釋，取一定稀釋度的菌液做平板分離。 ⑶分離純化：乳酸菌的分離可采用新鮮酸奶進(jìn)行平板涂布分離，或直接用接種環(huán)蘸取酸奶作劃線分離。分離后，置于37℃下培養(yǎng)以獲得單菌落。

11、 ⑷觀察菌落特征：經(jīng)2-3d培養(yǎng)，待菌落長成后，仔細(xì)觀察并區(qū)別不同類型的乳酸菌。酸奶中的各種乳酸菌在馬鈴薯汁牛奶培養(yǎng)基平板表面通常呈現(xiàn)三種形態(tài)特征的菌落： ①扁平型菌落：大小為2-3mm，邊緣不整齊，很薄，近似透明狀，染色鏡檢為細(xì)桿菌； ②半球狀隆起菌落：大小為1-2mm，隆起成半球狀，高約0.5mm，邊緣整齊且四周可見酪蛋白水解透明圈，染色鏡檢為鏈球狀； ③禮帽形突起菌落：大小為1-2mm，邊緣基本整齊，菌落中央呈隆起狀，四周較薄，有酪蛋白透明圈，染色鏡檢呈鏈球狀。 ⑸單菌株發(fā)酵試驗：若將上述單菌落接入牛奶，經(jīng)活化增殖后再以10%的接種量接入消毒后的牛奶中，分別于37℃和45℃下培養(yǎng)

12、，各菌株的發(fā)酵液均可達(dá)到108個細(xì)胞/ml。若采用兩種菌株混合培養(yǎng)，則含菌量?？杀对?。 ⑹品嘗：單株發(fā)酵成的酸奶與混菌發(fā)酵成的酸奶相比較，其香味和口感都比較差。兩菌混合發(fā)酵又以球菌和桿菌等量混合接種所發(fā)酵成的酸奶為佳。 桿菌→產(chǎn)酶→分解蛋白質(zhì)→氨基酸 球菌→產(chǎn)酸→蛋白質(zhì)變性→凝結(jié)成塊 ↓醇 酯化→香味 在制備酸奶時，保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的混合物在40～50℃乳中發(fā)酵2~3h即可達(dá)到所需的凝乳狀態(tài)與酸度，而任何單一菌株的發(fā)酵時間都在10h以上，其原因就是因為保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌之間存在互生現(xiàn)象。保加利亞乳桿菌在發(fā)酵的初期分解酪蛋白而形成氨基酸和多肽，促進(jìn)了嗜熱鏈球菌的

13、生長，隨著嗜熱鏈球菌的增加，酸度增加，抑制了嗜熱鏈球菌的生長。嗜熱鏈球菌生長過程中，乳脲活動產(chǎn)生CO2、甲酸刺激保加利亞乳桿菌生長。發(fā)酵的初期嗜熱鏈球菌生長的快；發(fā)酵1小時后與保加利亞乳桿菌的比例為(3---4):1。 3、感官特性 ?????? 應(yīng)符合表1的規(guī)定。 表1 項? 目 純酸牛乳 調(diào)味酸牛乳、果料乳牛乳 色澤 呈均勻一致的乳白色或微黃色 呈均勻一致的乳白色，或調(diào)味乳、果料應(yīng)有的色澤 滋味和氣味 具有酸牛乳固有的滋味和氣味 具有調(diào)味酸牛乳或果料酸牛乳應(yīng)有的滋味和氣味 組織狀態(tài) 組織細(xì)膩、均勻，允許有少量浮清析出；果料酸牛乳有果塊或果粒

14、4、衛(wèi)生指標(biāo) ?????? 應(yīng)符合表2的規(guī)定。 表2 項? 目 純酸牛乳 調(diào)味酸牛乳 果料酸牛乳 苯甲酸，g/kg???????????????????????? ≤ 山梨酸，g/kg???????????????????????? 不得檢出 硝酸鹽（以NaNO3計），mg /kg????? ???≤ 亞硝酸鹽（以NaNO2計），mg/kg??????? ≤ 黃曲霉毒素M1， μg /kg??????????????? ≤ 大腸菌群，MPN/100Ml??????????????? ≤ 90 致病菌（指腸道致病菌和致病性

15、球菌） 不得檢出 五、實驗報告 1、將各批混菌發(fā)酵的酸奶品評結(jié)果記錄于下表中。 批次 品 評 項 目 凝乳 情況 乳清 淅出 狀態(tài)稀薄粘度 表面 氣泡沫 表面 光澤 口感 酸度 香味 異味 發(fā)粘 pH 結(jié)論 1 2 3 4 2、將單菌和混菌發(fā)酵的酸奶品評結(jié)果記錄于下表中。 單菌及混菌比例 品 評 項 目 pH 結(jié)論 凝乳情況 口感 香味

16、異味 桿 菌 球 菌 桿菌:球菌（1:1） 桿菌:球菌（1:4） 3、在制備酸奶時，為何混菌發(fā)酵比單一菌株發(fā)酵更優(yōu)越？ 4、雙岐桿菌的乳酸發(fā)酵途徑與明串珠菌的乳酸發(fā)酵途徑有什么不同? 實驗三 甜酒釀的制作和酒藥中糖化菌的分離 一、目的要求 1、學(xué)習(xí)并掌握甜酒釀的釀制方法，了解釀酒的基本原理。 2、進(jìn)一步了解淀粉在糖化菌——根霉、毛霉和酵母菌作用下制成甜酒釀的過程。 3、進(jìn)一步掌握微生物的分離、培養(yǎng)等基本方法和無菌操作技術(shù)。 4、加深理解根

17、霉或毛霉的形成特征。 二、基本原理 甜酒釀是將糯米經(jīng)過蒸煮糊化，接種后，在適宜的條件下（28-30℃），讓種曲中的霉菌孢子萌發(fā)菌絲體，大量繁殖后通過酒藥（根霉、毛霉和酵母菌等微生物的混合糖化發(fā)酵劑）中的根霉和毛霉等微生物所產(chǎn)淀粉酶的作用將原料中糊化后的淀粉糖化，將蛋白質(zhì)水解成氨基酸，然后酒藥中的酵母菌利用糖化產(chǎn)物生長繁殖，并通過酵解途徑將糖轉(zhuǎn)化成酒精，從而賦予甜酒釀特有的香氣、風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)。隨著發(fā)酵時間延長，甜酒釀中的糖分逐漸轉(zhuǎn)化成酒精，因而糖度下降．酒度提高，故適時結(jié)束發(fā)酵是保持甜酒釀口味的關(guān)鍵。 要初步學(xué)會和掌握釀制方法并不困難，從微生物學(xué)的觀點來看，釀制的關(guān)鍵在于：要有優(yōu)質(zhì)的酒

18、釀種曲，即種曲中應(yīng)含有糖化率高的優(yōu)質(zhì)根霉、毛霉孢子或菌絲體；應(yīng)選擇優(yōu)質(zhì)的糯米作原料；嚴(yán)格無菌操作規(guī)程，盡量避免雜菌污染；合理控制釀制條件等。 以糯米(或大米)經(jīng)甜酒藥發(fā)酵制成的甜酒釀，是我國的傳統(tǒng)發(fā)酵食品。我國釀酒工業(yè)中的小曲酒和黃酒生產(chǎn)中的淋飯酒在某種程度上就是由甜酒釀發(fā)展而來的。 三、實驗材料 酒藥（）、糯米，馬鈴薯，蔗糖 甜酒藥中糖化菌的分離培養(yǎng)基：馬鈴薯-蔗糖-瓊脂培養(yǎng)基 蒸鍋，紗布，1000ml燒杯，250ml廣口培養(yǎng)瓶，封口膜，保鮮膜，牛皮紙，天平，培養(yǎng)箱，高壓滅菌鍋、淘米盆、防水紙、繩子、涼開水，顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、解剖針、酒精燈、鑷子、培養(yǎng)皿等。

19、 四、操作步驟 （一）甜酒釀的制作 酒 藥 洗米 蒸飯 淋水 降溫 落缸搭窩 發(fā)酵 甜酒釀 1、浸米與洗米：選擇優(yōu)質(zhì)新鮮糯米，淘洗干凈后浸泡過夜，使米粒中的淀粉粒子吸水膨脹，便于蒸煮糊化，清水沖洗至水清亮，撈起瀝干。 2、隔水蒸煮：將糯米放在蒸鍋內(nèi)擱架的紗布上隔水蒸煮，15磅10-20min，常壓30min，至米飯熟透為止。要求達(dá)到熟而不糊，外硬內(nèi)軟，內(nèi)無夾心，疏松易散，透而不爛，均勻一致。 3、淋水降溫：用清潔冷水淋洗蒸熟的糯米飯，使其降溫至35℃左右，同時使飯粒松散。 4、接入種曲釀制：將

20、冷卻到35℃左右的米飯，按干糯米重量換算接種量，將0.4%的經(jīng)粉碎的根霉曲與米飯拌勻，盛于廣口培養(yǎng)瓶中，飯粒搭成中心下陷的喇叭形凹窩，以利于出汁，飯面均勻撒上少許曲粉，用封口膜及牛皮紙覆蓋于廣口培養(yǎng)瓶表面，用線包扎后置于30℃溫箱保溫培養(yǎng)48h即可食用。 釀成的甜酒釀應(yīng)是醪液清澈半透明而甜醇爽口。 5、品嘗 （二）甜酒藥中糖化菌的分離 無菌操作技術(shù)，以平板劃線法分離甜酒藥中的糖化菌 1. 每組取無菌培養(yǎng)皿兩付，先在培養(yǎng)皿中加入兩滴5000U/mL的鏈霉素液，而后用已融化的馬鈴薯-蔗糖-瓊脂培養(yǎng)基倒平板，使鏈霉素與培養(yǎng)基充分混勻，制成平板。 2. 取已被碾碎的甜酒藥粉1環(huán)在平板上劃線

21、，然后倒置于28~30℃恒溫箱中培養(yǎng)4~6d。 3. 觀察平板上的菌落形態(tài)，用接種環(huán)調(diào)取霉菌菌落的孢子或菌絲體于新鮮的馬鈴薯-蔗糖-瓊脂平板上，再進(jìn)行劃線培養(yǎng)，直至獲得純培養(yǎng)，即平板上只有一種霉菌的菌落或菌苔。 對已分離出的糖化菌進(jìn)行個體形態(tài)的觀察 1.打開皿底用低倍鏡直接觀察分離菌各部分結(jié)構(gòu)形態(tài)，如孢囊梗、孢囊、囊軸、假根、匍匐菌絲。 2.取一干凈的載玻片，滴一滴乳酚油，然后用解剖針挑取少量帶有孢囊的分離菌菌絲放在懸滴液中，將菌絲分散平鋪，然后蓋上蓋玻片，輕輕一壓，注意應(yīng)避免氣泡產(chǎn)生。 3.鏡檢：先用低倍鏡觀察菌絲有無隔膜，孢囊梗的形態(tài)，孢囊的著生方式，孢囊和囊軸的形態(tài)和大小。然

22、后換成中倍鏡觀察，繪制分離菌的形態(tài)圖，注明各部位名稱。并根據(jù)菌落和菌體形態(tài)特征，判斷出該分離菌是何種真菌。 五、實驗報告 1、實驗結(jié)果 (1)發(fā)酵期間每天觀察、記錄發(fā)酵現(xiàn)象。 (2)對產(chǎn)品進(jìn)行感官評定，將各批發(fā)酵的甜酒釀品評結(jié)果記錄于下表中。寫出品嘗體會。 批 次 品 評 項 目 結(jié)論 出汁（ml） 口感 酒度 甜味 異味 pH 1 2 3 4 2、甜酒釀制作中有哪幾類微生物參與發(fā)酵作用？各自起何種作用？ 3、成功制作甜酒釀的關(guān)鍵步驟

23、是什么？ 實驗四 檸檬酸產(chǎn)生菌的分離及檸檬酸的固體發(fā)酵 一、目的要求 1、學(xué)習(xí)從環(huán)境中選出能產(chǎn)檸檬酸的霉菌，了解從環(huán)境中獲得目的菌種的一般方法； 2、掌握檸檬酸的發(fā)酵、提取、檢測方法。 二、實驗原理 檸檬酸發(fā)酵是利用微生物在一定條件下的生命代謝活動而獲得產(chǎn)品的。不論采用何種菌株，檸檬酸發(fā)酵都是典型的好氧發(fā)酵。工業(yè)上的好氧發(fā)酵發(fā)基本上有三種，即表面發(fā)酵、固體發(fā)酵和深層發(fā)酵。前兩種方法利用空氣氣相中的氧氣，后者則是利用液體中的溶解氧。至今在檸檬酸發(fā)酵工業(yè)中，上述三種發(fā)酵工藝均并存。雖然液體深層發(fā)酵法已大量代替了固體發(fā)酵法，但處于一些廢渣的利用及投資較少的緣故，在一些地方淺

24、層固體法生產(chǎn)檸檬酸仍在使用中。適合于固體發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸的原料諸如：甘薯渣、木薯渣、蘋果渣和甘蔗渣等。 檸檬酸的固體發(fā)酵工藝分為淺層法和厚層法，均是將發(fā)酵原料、輔料及菌體放在疏松的固體支持物上，經(jīng)過微生物的代謝活動，將原料中的可發(fā)酵成分轉(zhuǎn)化為檸檬酸的過程。 1、黑曲霉發(fā)酵糖類生成檸檬酸的能力很強，其主要特征是耐酸性極強，在pH為1.6的情況下，仍能良好生長。利用這一特點，采用pH為1.6的酸性營養(yǎng)濾紙即可分離該菌種； 2、發(fā)酵產(chǎn)物中檸檬酸為多鹽有機酸，能與CaCO3形成沉淀，利用鈣鹽法即可檢測。 三、實驗材料及用品 1、樣品：霉?fàn)€的桔皮 2、菌種：黑曲霉（Aspergillus .

25、 niger）IFFI 2315 3、培養(yǎng)基和試劑： （1） 酸性蔗糖培養(yǎng)基 蔗糖15% NH4NO30.2% KH2PO40.1% MgSO4?7H2O 0.25% 用鹽酸調(diào)pH≤ 121℃滅菌20min （2）固體發(fā)酵培養(yǎng)基 米糠:麩皮=2:1，65%水分（45ml:50g），121℃滅菌30min （3）0.1M NaOH溶液，1M鹽酸 （4）0.5%酚酞指示劑：酚酞，溶于100ml 95%乙醇中 4、器皿：白瓷托盤，保鮮膜，切刀，菜板，培養(yǎng)皿（帶濾紙），250ml三角瓶，搖床，恒溫培養(yǎng)箱，滅菌鍋，酸堿滴定管，紗布，牛皮紙 四、實驗步驟

26、（一）深層液體發(fā)酵 1、菌種分離：取霉?fàn)€桔皮（2）放入10ml三角瓶中，振蕩3～5min，然后用水稀釋5～10倍； 2、菌種純化：取稀釋液0.5～1ml放入酸性培養(yǎng)基上（稀釋液：培養(yǎng)基=1：10），搖勻，傾倒在平皿中的濾紙上，25℃培養(yǎng)2～3d即有菌落產(chǎn)生； 3、發(fā)酵：將培養(yǎng)出的霉菌接種入液體酸性蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基中（25ml/250ml三角瓶），30℃搖床培養(yǎng)2～3d，過濾收集發(fā)酵液。 （二）淺層固體發(fā)酵 1、培養(yǎng)基制備：將米糠：麩皮按照2：1的比例配料，加65%的水分（45ml:50g），拌勻后按15g/250ml分裝到三角瓶中，用紗布牛皮紙封扎瓶口，于121℃，滅菌30min。

27、2、接種：將培養(yǎng)基趁熱打散，待降溫到37℃，即可將黑曲霉孢子接種到其中，振蕩混勻。 3、發(fā)酵：培養(yǎng)溫度30-32℃，經(jīng)24h培養(yǎng)后搖瓶一次，測pH；將三角瓶放平后繼續(xù)培養(yǎng)24h左右使培養(yǎng)基結(jié)成塊狀。此時應(yīng)扣瓶使之充分通氣并散熱，測pH；再培養(yǎng)72h使瓶內(nèi)長滿豐盛的孢子即可出料，測pH。 4、產(chǎn)物檢測： （1）檸檬酸鑒定 取5ml發(fā)酵液于試管中，滴入飽和CaCO3溶液，有白色沉淀則證明產(chǎn)生檸檬酸。 （2）產(chǎn)酸量測定 取10ml發(fā)酵液（10g醅樣，加蒸餾水100ml浸泡15min后過濾得濾液），滴加0.5%酚酞指示劑2滴，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定至淡粉紅色，計算產(chǎn)酸量（標(biāo)準(zhǔn)滴定法

28、）。 五、實驗報告 1、將發(fā)酵全過程測定酸度的pH值繪制成曲線圖。 2、計算出實際實驗發(fā)酵液的產(chǎn)酸量。 3、檸檬酸固體發(fā)酵過程中應(yīng)注意哪些操作要點？ 實驗五 酒精發(fā)酵及下游處理實驗 一、實驗?zāi)康? 掌握酒精發(fā)酵工藝的具體操作。 二、實驗原理 EMP途徑 脫 羧 還 原 己糖 丙酮酸 乙醛 乙醇（酒精） 三、材料：玉米粉，糯米，高粱粉，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 器材：燒杯，玻璃棒，天平，電爐，鋼鍋，5L三角瓶

29、，恒溫箱，彈孔膠塞，發(fā)酵栓，蒸餾裝置，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，冰箱 四、工藝流程 原料 → 液化、糖化處理 → 制醪 → 發(fā)酵 → 過濾 → 濾液（測酒度） 五、實驗步驟 1、稱取原材料各1kg，將其進(jìn)行液化和糖化處理，液化的目的是使淀粉水溶性增大，糖化的目的是將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖，有利于酵母的發(fā)酵；將液化和糖化的原料分裝入2000ml的三角瓶中，裝罐系數(shù)為40-80%；測定糖度。 2、按照1.0~1.2%的比例稱取活性干酵母，將其倒入燒杯中，加入適量的水、葡萄糖、NaCl，放于30℃恒溫箱中保溫20min，進(jìn)行干性酵母活化。待酵母活化后，按10%將其接種到裝有原料的三角瓶中。 3、將接種的三角

30、瓶置于28℃的恒溫箱中進(jìn)行發(fā)酵48h，用單孔膠塞接一橡皮管，末端接發(fā)酵栓（或倒扣一個漏斗），置于裝水的燒杯中，排氣。 4、發(fā)酵結(jié)束后，測定發(fā)酵液pH、糖度。將發(fā)酵液微熱到40℃左右，降低發(fā)酵液的黏度，將其用紗布過濾，得濾液。 5、測濾液酒度，計算100g原料出酒率。 六、實驗報告 思考題 1、在發(fā)酵過程中如何控制酵母菌生長的最適溫度？ 2、原料破碎徹底與否與提高酒精得率有何關(guān)系？ 3、計算100g原料出酒率。 實驗六、釀酒葡萄成熟度的控制以及入罐發(fā)酵 一、目的與要求 成熟度是決定葡萄酒質(zhì)量的重要因素。通過測定漿果的成熟度，來了解原料的成熟質(zhì)量，確定各品

31、種的最佳工藝成熟度，并以此決定葡萄酒類型和相應(yīng)的工藝條件。同時簡單了解葡萄酒釀制的工藝原理。 二、試劑與儀器 1.pH計、手持糖量計、托盤天平、量筒、水浴鍋、電爐、移液管、錐形瓶、容量瓶、5L玻璃瓶。 干紅葡萄酒的發(fā)酵工藝過程圖 2.斐林試劑A、B液，1%次甲基蘭，0.1mol/L氫氧化鈉溶液、1%酚酞指示劑、鄰苯二甲酸氫鉀，95%酒精，鹽酸等。 三、方法與步驟 1.采樣：從轉(zhuǎn)色期開始每隔5-7天采樣一次，對于大面積園，采用250株取樣法：每株隨機取1-2粒果實，并取300—400粒；面積較小的品種?？呻S機取5 - l0穗果實，裝入塑料袋于冰壺中，迅速帶回實驗室分析。簡單的成熟度的

32、測定可用手持糖量計測定，如果是精確的測定可在實驗室中采用斐林試劑測定。 2.百粒重與百粒體積，隨機取100粒果實，稱重，然后將其放入250ml(或500ml)量筒中，加入一定體積的水，至完全淹沒果實．讀取量筒水面的讀數(shù)，減去加入時的水量，即為百粒體積。 3.出汁率的測定；取100g分選較好的葡萄果粒，用紗布擠汁，放入小燒杯中，立即稱量；出汁率=葡萄汁重量/葡萄果實重量。 計算：在發(fā)酵結(jié)束后還需要再進(jìn)行出汁率的測定。 自流汁率(％)=W1/W2 x 100 總出汁率(％)=(W1+W2)/ Ws x 100 式中W1——葡萄漿自流汁的重量，(g)； Ws—

33、—試樣重量，(g)； W2——經(jīng)壓榨流出的葡萄汁重量，(g)。 4.可溶性固形物與pH值；用手持糖量計測定葡萄汁的可溶性固形物(％)，取20ml汁測pH值。 5.還原糖與總酸：用斐林試劑法測定還原糖，用堿滴定法測定總酸。 6.果皮色價測定：取20粒果實，洗凈擦干，撕下果皮并用吸水紙擦凈皮上所帶果肉及果汁，然后剪碎，稱取果皮用鹽酸乙醇溶液(1 mol/L鹽酸 : 95％乙醇 = 15：85)50ml浸泡，浸泡20小時左右，然后測定540nm下的吸光度，計算果皮色價(XA x 10)/W (XA——吸光度，W——果皮重量g)。 7.入罐：分選葡萄果實，剔除病蟲、生青、腐爛的果實。

34、除梗，破碎30%，入罐。 四、結(jié)果及分析 評價漿果的成熟質(zhì)量。 實驗七、干紅葡萄酒發(fā)酵的監(jiān)控 一、實驗的目的 掌握干紅葡萄酒釀造中發(fā)酵的監(jiān)控方法及相關(guān)的操作要求。 二、所需儀器及試劑： 1. 儀器： 5升、10升玻璃瓶，塑料盆，紗布、溫度計、比重計、天平、木棍、燒杯、量筒等。 2. 試劑：亞硫酸（6%）、白砂糖、酵母、KHCO3。 三、實驗內(nèi)容 1. 酵母、果膠酶的活化：采用工業(yè)專用酵母，按照200mg/L的量稱取酵母，放入三角瓶中，加入50mL蒸餾水，在40℃條件下活化20分鐘。按照20mg/L稱取果膠酶，在40℃左右活化10分鐘。 2. 裝瓶：裝量不超過瓶容

35、的75％，同時按汁量加入50～80mg/LS02攪勻，亞硫酸的濃度為6%，6%亞硫酸溶液的密度是/ml，添加量的計算（0.8ml/kg果實）：[葡萄果實kg××1000×]ml。并加入果膠酶20mg/L(或按說明書)同時取汁測糖、酸、比重、溫度。（注：添加的酵母、果膠酶以及亞硫酸的量都是以葡萄汁的量來計算）。 3.浸漬發(fā)酵：每天測兩次比重、溫度，并定期用木柄壓“帽”、用冷水噴淋或在空調(diào)室內(nèi)控溫至26～30℃。 5．當(dāng)比重降至1010～1020時，出酒，同時壓榨皮渣，混合、控溫18～20℃，進(jìn)行后發(fā)酵管理。 6. 當(dāng)相對密度降到0.993 - 0.998時（殘?zhí)?2g/L時），酒精發(fā)酵結(jié)束

36、，用KHCO3調(diào)整PH≥3. 2，觸發(fā)蘋果酸-乳酸發(fā)酵。 7. 貯藏：滿瓶、調(diào)游離S02為20～30mg/L。 8. 下膠與過濾，自然澄清半年后，用明膠下膠，通過下膠實驗確定用量(5-20g/hL)，然后用澄清板過濾。 9. 穩(wěn)定性試驗：檢查酒的氧化、鐵、銅、色素、微生物穩(wěn)定性，若需要應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的處理。 10. 裝瓶：將酒冷至其冰點以上℃左右，在同溫條件下進(jìn)行澄清、除菌過濾。并加入5-10 g/L SO2，打塞、臥放貯存。 四、思考與練習(xí) 如何確定紅葡萄酒的皮渣分離時間？ 試驗八、葡萄酒發(fā)酵結(jié)束的理化指標(biāo)的測定 一、 實驗?zāi)康? 了解如何確定葡萄酒酒精發(fā)酵的結(jié)束

37、，同時對葡萄酒進(jìn)行分離和封裝，轉(zhuǎn)入后發(fā)酵階段。熟悉各個理化指標(biāo)的測定方法。 二、所需要的儀器和試劑： 1. 電爐，蒸餾裝置，膠帶，酒精計(0-40%)(V/V) 2. 費林試劑，0.1N氫氧化鈉，酚酞指示劑（1%），次甲基藍(lán)指示劑，量筒，葡萄糖5g/L。 三、實驗步驟： 3.揮發(fā)酸的測定：揮發(fā)酸小于1g/L。 4.酒度的測定：量取50mL酒樣，移入圓底燒瓶中，加入100mL蒸餾水，連接酒精蒸餾裝置，加熱蒸餾，直到蒸出的液體大約100毫升時，用蒸餾水定容至100mL，然后用酒精計測定酒精度，并且還要測定相應(yīng)的溫度，記錄溫度和酒精度。 四、討論 1. 在酒精度的測定中需要

38、進(jìn)行校正。學(xué)會如何校正讀數(shù)。 實驗九 自制葡萄酒 1、將成熟的葡萄去枝，洗凈，瀝干。 2、將晾干的葡萄用粉碎機粉碎（用手捏碎）。 ? 3、將葡萄液加入2％的白糖攪拌后加蓋，葡萄只能裝到容器的2/3處，自然氣溫在20-30℃為最佳。然后將瓶口密封，進(jìn)入發(fā)酵。 ? 4、在瓶內(nèi)密封24h后，有泡沫出現(xiàn)，汁液析出，葡萄皮浮起，每天用勺子攪動兩次，將葡萄皮壓到汁液中，讓它充分浸泡。7d后當(dāng)酒液糖度<5°，酒度>11%，pH>3.2(3.5-3.7)，前發(fā)酵結(jié)束 這時打開蓋聞之，如有酒香氣撲鼻，即可用紗布將酒渣濾去，然后加入10％的白酒和10％的白糖，攪拌后進(jìn)行發(fā)酵，這時酒壺應(yīng)

39、放在10-20℃（<25℃）（紅：15℃ 少量O2，白：13℃ 適量O2）陰涼處。 ? 5、1-2個月后，葡萄酒成熟，酒色呈桔黃色或玫瑰色，酒濃香醇，味有點酸。此時過濾一次(要用多層紗布)，方可裝入瓶（80℃熱水洗瓶）內(nèi)，18℃倒放或臥放備用。 ? 40mg/l：1L葡萄酒里需要加入6%的亞硫酸溶液0.648ml。 注意： ??1)??第一次發(fā)酵期要用玻璃瓶(2—3天) ??2)??第二次發(fā)酵期要用小口塑料壺(不要隨時打開瓶蓋) 首先準(zhǔn)備一個大的廣口瓶或者瓦罐，長度左右的虹吸管，一把勺子。原材料是按照10kg葡萄白糖備料。 先將葡萄洗干凈，晾干水分，用手捏

40、碎放進(jìn)廣口瓶內(nèi)，每放一部分葡萄放一層白糖，葡萄只能裝到容器的2/3處，自然氣溫在20-30℃為最佳。然后將瓶口密封，但是切記不要將瓶口封的太緊，防止發(fā)酵時發(fā)生爆炸。 在瓶內(nèi)密封24h后，有泡沫出現(xiàn)，汁液析出，葡萄皮浮起，每天用勺子攪動兩次，將葡萄皮壓到汁液中，讓它充分浸泡。7-10d后，發(fā)酵趨于平緩，葡萄皮由深色變?yōu)闇\色，這時用虹吸管將容器內(nèi)的酒液抽出，然后用紗布將剩于葡萄皮內(nèi)的酒液擰出。按10kg原酒一個雞蛋的比例將（5-10g/hL）打到起泡，倒入酒中攪勻，下膠（明膠：5-10g/hL）。靜置15d。再用虹吸管將上面的酒液抽出，就成了晶瑩透亮的成品葡萄酒。 成品葡萄酒指標(biāo)： 糖 酸 酒精 顏色 單寧（g/L） pH （11-12）