凱氏定氮法在測量大豆蛋白的不確定度分析畢業(yè)論文.doc

河南工業(yè)職業(yè)技術(shù)學院畢業(yè)論文題目：凱氏定氮法在測量大豆蛋白的不確定度分析摘 要目 錄摘 要1 緒 論1.1 本課題的來源、目的及意義1.2 課題背景及國內(nèi)外研究現(xiàn)狀2 凱氏定氮法2.1 概述2.2 凱氏定氮法的特點3 凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的幾個問題3.1凱氏定氮法的原理和過程3.2 凱氏定氮法測定的蛋白質(zhì)粗蛋白3.3 蒸餾時堿的用量及溶液顏色的變化3.3.1堿的用量3.3.2溶液顏色的變化3.4 硼酸吸收液顏色的變化3.5討論4 凱氏定氮法中各試劑對消化時間的影響 4.1 概述4.2 儀器與試劑4.3試驗方法4.4 結(jié)果與討論5 凱氏定氮法消化裝置的改進5.1 概述5.2消化的原裝置5.3 改進后的新裝置 6 凱氏定氮法測定大豆中粗蛋白不確定分析6.1 原理和方法6.2 不確定度分量及計算6.3 討論7 凱氏定氮法測定大豆蛋白質(zhì)的不確定度分析7.1 原理7.2 蛋白質(zhì)計算數(shù)學模型7.3擴展不確定度分析7.4最后結(jié)果表示8 凱氏定氮法測定大豆蛋白質(zhì)含量的方法8.1 概述8.2 試劑與儀器8.3操作方法8.4方法與討論9 大豆中蛋白質(zhì)測定應注意的事項探討9.1 取樣9.2 消化9.3蒸餾9.4滴定9.5結(jié)果計算10 結(jié)束語10.1 本文總結(jié)10.2 展望未來致 謝參考文獻畢業(yè)設計任務書1 緒 論1.1 本課題的來源、目的及意義蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)占有特殊的地位，它和核酸是構(gòu)成原生質(zhì)的主要成分，是生命現(xiàn)象的物質(zhì)基礎。食物中的蛋白質(zhì)是人體中氮的唯一來源。具有糖類和脂肪不可替代的作用。作為生命的物質(zhì)基礎之一，蛋白質(zhì)在催化生命體內(nèi)各種反應進行、調(diào)節(jié)代謝、抵御外來物質(zhì)入侵及控制遺傳信息等方面都起著至關重要的作用。蛋白質(zhì)的分離與定性、定量分析是生物化學和其他生物學科、食品檢驗、臨床檢驗、疾病診斷、生物藥物分離提純和質(zhì)量檢驗中最重要的工作。蛋白質(zhì)是由a一氨基酸以酰胺鍵(肽鍵)相結(jié)合形成的結(jié)構(gòu)極其復雜的高分子化合物，是生物體中的主要含氮物質(zhì)。蛋白質(zhì)與細胞結(jié)構(gòu)、酶、激素、病毒、免疫、物質(zhì)轉(zhuǎn)運和遺傳等密切相關，蛋白質(zhì)測定方法一般可分為間接方法和直接方法。間接方法是通過測定樣品中蛋白質(zhì)的含氮量進行推算蛋白質(zhì)含量的方法。直接方法則是根據(jù)蛋白質(zhì)的物理和化學性質(zhì)，直接測定蛋白質(zhì)含量的方法。蛋白質(zhì)是生物體中含量最高，功能最重要的生物大分子，與生命的起源和進化都密切相關，因此蛋白質(zhì)也是生命科學中極為重要的研究對象。關于蛋白質(zhì)的分析研究，一直是化學家及生物學家極為關注的問題，其含量的測定在生化分析和臨床分析中具有重要意義，研究和開發(fā)新的、高靈敏度的蛋白質(zhì)測定方法是生物化學研究的一個活躍領域。測定蛋白質(zhì)的方法不斷發(fā)展，主要有凱氏定氮法(國際經(jīng)典測定方法)、分光光度法、電化學法、滴定法、高壓液相色譜法、電泳法、免疫法等。了解各種蛋白質(zhì)測定方法的原理和技術(shù)特點，對在實際工作中選擇適宜的分析方法具有重要的指導意義。 1.2 課題背景及國內(nèi)外研究現(xiàn)狀蛋白質(zhì)是食品檢驗中經(jīng)常進行檢測的項目。測定食品中蛋白質(zhì)的含量，了解食品的質(zhì)量，為合理配膳提供數(shù)據(jù)，保證不同人群對蛋白質(zhì)的需要，掌握食品的營養(yǎng)價值和品質(zhì)的變化，以達到合理利用食品資源。近年來，人們發(fā)展了許多測定蛋白質(zhì)的方法，如雙縮脲法、分光光度法、凱氏定氮法、紫外吸收法、染料結(jié)合法、質(zhì)譜分析法等，質(zhì)譜分析是測定結(jié)果最準確的測定方法；凱氏定氮法適用范圍最廣泛，分光光度法是最為簡便快速的測定方法，但就方法的準確性、精密度以及應用程度而言，國際經(jīng)典測定方法一凱氏定氮法為首選 ，該法也是相關專業(yè)學生必須掌握的經(jīng)典試驗方法之一?，F(xiàn)在盡管有很多先進的自動或半自動凱氏定氮儀，但這些儀器不僅價格昂貴，且需專門試劑，目前尚難普及，而對大批量的學生試驗更不適合，所以凱氏定氮法適用范圍是目前分析含氮化合物最常用的方法。2 凱氏定氮法2.1概述將蛋白質(zhì)樣品在硫酸銅的催化下，用氧化性試劑消化分解轉(zhuǎn)化為銨離子，然后將含有銨試液置于蒸餾瓶中，加高濃度堿使銨離子轉(zhuǎn)化為氨，然后與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，再加熱蒸餾，用過是的標準硼酸溶液吸收氨氣，再用鹽酸標準溶液滴定H2B03，以甲基紅作為指示劑，測出含氮量，將結(jié)果乘以換算系數(shù)，計算出粗蛋白質(zhì)含量。2.2凱氏定氮法的特點測定蛋白質(zhì)最常用的方法是凱氏定氮法，它是測定試樣中總有機氮最準確和最簡單的方法之一，被國際國內(nèi)作為法定的標準檢驗方法。該法關鍵環(huán)節(jié)有濃硫酸用量、催化劑選擇、消化時間、氫氧化鈉用量和硼酸吸收液指示劑選擇等。樣品在消化時加入濃硫酸的量必須過量，一是脫水作用，將樣品中有機物脫水然后碳化成c；二是氧化作用，濃硫酸和硫酸鉀、硫酸銅一同加熱使溫度達到400 以上，碳還原硫酸生成SO3，而碳本身被氧化成CO2；三是分解作用，將蛋白質(zhì)分解，SO2還原N生成NH4 ，本身被氧化成SO3；四是吸收作用，生成的NH4 與濃硫酸反應生成(NH4)2SO4 ；五是生成的(NH4)2SO4保存在濃硫酸溶液中不至于損失 。 樣品消化過程要加入催化劑，加入硫酸鉀能夠提高分解時溶液的溫度，使溶液沸點由290提高到400 ，加入硫酸銅、氧化汞和硒粉則能促進試樣的分解，縮短消化時間。有試驗證明，用硒粉作催化劑可加快消化速率，縮短試樣消化時間，其測定結(jié)果與硫酸銅作為催化劑的傳統(tǒng)方法相當吻合I5，但硒粉使用量過多或與硫酸作用時間過久會使銨態(tài)氮成為分子氮而損失I6。雖然加入氧化汞能夠節(jié)省消化時間，但由于污染較重，多用于仲裁檢驗I7。目前包括國標方法大多加入硫酸鉀和硫酸銅混合催化劑，但眾多文獻中二者用量的比例有所不同，硫酸鉀：硫酸銅比例主要有15：1、10：1、10：09和9：1等，國標方法采用10：1比例，硫酸銅用量是影響消化時間的主要因素l9。樣品消化過程中，消化液經(jīng)過一系列改變最終轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色透明狀態(tài)，這種過程是碳化的有機物完全被氧化的，但決不表示樣品中的氮素全部轉(zhuǎn)變?yōu)镹H4 。蘇軍等研究結(jié)果表明，消化液澄清后繼續(xù)消化30 min為宜。蒸餾過程中加入40 氫氧化鈉溶液，用于中和樣品消化后剩余的濃硫酸，并使(NH4)2SO4 轉(zhuǎn)化為NH4 OH，經(jīng)加熱生成NH3逸出，被硼酸吸收。為使樣品消化液中的(NH4)2SO4 全部轉(zhuǎn)化為NH4OH，40氫氧化鈉溶液必須過量加入，用量不夠會造成測定結(jié)果偏低，用量過多則浪費試劑I4。硼酸吸收液中混合指示劑的組成和配方有數(shù)種，如溴甲酚綠一甲基紅、甲基紅一甲基藍、甲烯藍一甲基紅等，但以0.5 溴甲酚綠乙醇溶液和0.1 甲基紅乙醇溶液混合而成的混合指示劑變色比較敏感。指示劑與硼酸吸收液的比例通常使用1：100或2：1003 凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的幾個問題3.1凱氏定氮法的原理和過程利用硫酸及催化劑與樣品加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中C、H形成CO2 和H2O逸出，而蛋白質(zhì)中的氮則轉(zhuǎn)化成(NH4)2SO4，在強堿條件下加熱蒸餾，其中NH3被硼酸吸收為(NH4)2B4O7，然后用標準的鹽酸溶液滴定，根據(jù)鹽酸的消耗量和濃度計算出氮的含量，乘以蛋白質(zhì)系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。反應式如下：2CH3 CH一C00H+13H2SO4= (NH4)2SO4+6CO2+12SOz+16H2O |NH2(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+NazSO4+2H202NH3 +4H3BO3 = (NH4)2B4O7+5H2O (NH4)zB4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3根據(jù)原理測定過程可分為消化、蒸餾吸收、滴定三個過程。 3.2凱氏定氮法測定的蛋白質(zhì)粗蛋白用濃硫酸對大豆進行消化，破壞有機物使含氮物轉(zhuǎn)化成硫酸銨，加入強堿進行蒸餾使氨逸出，用硼酸溶液吸收氨吸收液用鹽酸標準溶液滴定，測出氮含量。根據(jù)測定原理，在消化過程中除蛋白質(zhì)中的氮轉(zhuǎn)化成(NI-h)2SO4外，樣品中非蛋白質(zhì)中的氮也能轉(zhuǎn)化成(NH4)2SOs，計算氮的含量時，認為所有的氮都來源于蛋白質(zhì)，因此，測定結(jié)果比實際值偏高。所以，用凱氏定氮法測定的蛋白質(zhì)為粗蛋白。3.3蒸餾時堿的用量及溶液的變化3.3.1堿的用量蒸餾時必須加堿(可加入NaOH)，加入堿的作用一是中和硫酸，二是使溶液處于強堿性，這樣才能使(NH4)2SO4變成NH3被蒸餾吸收。那么堿的用量為多少合適呢?堿的用量取決于消化時H2SO4的用量和堿的濃度，一般經(jīng)驗認為堿的用量為中和硫酸后再加40。例如：消化時加入濃H2SO410mL，NaOH的濃渡為40，則NaOH的用量為首先計算中和10mL濃H2SO4需要40NaOH的量：H2SO4的摩爾濃渡為184molL，40NaOH摩爾濃度為10molL。化學反應式如下：2NaOH+H2SO4=Na2SO4+2HzO假如濃硫酸在消化時沒有消耗，兩者反應時2摩爾NaOH和1摩爾H2SO4反應，設需要NaOH的量為xml，則210x=118410 x=368mL再計算使溶液為強堿性時需要NaOH的量:36.840 =1472mL最后計算蒸餾時加入堿的量：368+14.72=5152mL3.3.2溶液顏色的變化消化后溶液的顏色為藍綠色，這是催化劑中硫酸銅的顏色。當加入氫氧化鈉后溶液為淺藍色，這是硫酸銅與氫氧化鈉反應后生成氫氧化銅淺藍色沉淀的緣故。當加熱蒸餾不久，溶液開始變?yōu)楹诤稚@是因為在加熱條件下氫氧化銅分解生成氧化銅黑褐色沉淀的緣故。反應式如下：2NaOH+CuSO4=Cu(OH)2 +Na2SO4Cu(OH)2=CuO+H2O3.4硼酸吸收液顏色的變化蒸餾吸收時的吸收液為硼酸，濃度為24。硼酸是一種弱酸，Ka=581010。蒸餾吸收時所用指示劑是甲基紅謨甲酚綠，其變色范圍是：pH<40 橙色；pH=51 灰色；pH>62 藍色。正常情況下，當加入該指示劑后硼酸溶液顯橙色，蒸餾時氨氣被硼酸吸收變成硼酸銨，溶液變成藍色。但實驗中常常會出現(xiàn)加入指示劑后硼酸溶液就變藍色，是因為配制硼酸溶液時混入堿性物質(zhì)或蒸餾水偏堿性。測定中應該注意。3.5討論3.51 凱氏定氮法測定的蛋白質(zhì)雖然是粗蛋白，但所有樣品中蛋白質(zhì)的測定都采用此法，因此，同樣具有真實性和可比性。3.52 蒸餾時堿的用量經(jīng)計算后準確加人，即會避免因加人量過少影響蒸餾，也會避免因加人量過多而浪費試劑。3.53 硼酸吸收液配制時應用中性蒸餾水，避免堿性物質(zhì)的混入，盛裝硼酸吸收液的容器應刷洗干凈。4 凱氏定氮法中各試劑對消化時間的影響4.1概述經(jīng)典的凱氏定氮法試樣消化階段必須有定氮催化劑與硫酸(比重184，無氮)參與，催化劑一般用CuSO5H2O、K2SO 。但由于CuSO45H O、K2SO4 和濃H2SO4 的用量不合適，一方面導致消化時間過長，降低了分析化驗人員的工作效率，使教學試驗不能在規(guī)定的時間內(nèi)完成凱氏定氮的整個過程。另一方面，過量的催化劑與硫酸造成資源浪費及環(huán)境污染。在研究經(jīng)典的凱氏定氮法中，許多人只注重CuSO5H O和K2SO4用量,而忽略濃硫酸的用量對消化時間的影響。本研究對經(jīng)典的凱氏定氮法進行了研究，對CuSO5H O、K2 S04、和濃H2SO4 的用量作L9(3)正交試驗，選擇出它們的最佳用量，使消化時間大大降低，提高了凱氏定氮的速度。試驗證明，該最佳條件對蛋白質(zhì)含量高的樣品還是蛋白質(zhì)含量低的樣品都能完成消化，這對于提高分析化驗人員的工作效率和學生教學試驗及環(huán)境保護都有很大的益處。4.2儀器與試劑(1)儀器。電子天平(AB104-N)；電熱恒溫鼓風干燥箱(Gzx-9030MBE)；控溫電爐(北京市永光明醫(yī)療儀器廠1000W 220V)；凱氏燒瓶。(2)試劑。CuS045H O(分析純天津市化學試劑一廠)；K2SO4 (分析純?nèi)R陽化工實驗廠)；H2S04(分析純?nèi)R陽市新興化工有限公司)。4.3實驗方法(1)消化。稱取02000 g發(fā)酵馬鈴薯渣(蛋白質(zhì)含量大于10)置于干燥的100 mL凱氏燒瓶中，加數(shù)粒玻璃珠，按表2添加CuS045H 0、K2S04、濃H S04，搖勻后，在凱氏燒瓶中加一小漏斗于通風櫥內(nèi)進行消化，先用小火，然后加大火力。(2)方法。以CuSO 5H20、K2SO4 和濃H2SO4 的用量為主要考慮因素，采用L9(3)正交試驗，試驗設計見表1，試驗結(jié)果見表2。表1 試驗因素水平水平 因素 因素A/KzSO4因素B/5水CuSO4因素C/HzSO413.000.135.0022.500.104.0032.000.053.00表2正交試驗結(jié)果試驗號因素A因素B因素C消化時間/ min13.000.135.0020.0023.000.104.0015.0033.000.053.0026.0042.500.134.0018.6752.500.103.0017.0062.500.055.0018.0072.000.133.0017.3382.000.105.0019.5092.000.054.0018.75R161.0056.0057.50R253.6751.5052.42R355.5862.7560.33R1/320.3318.6719.17R2/317.8917.1717.47R3/318.6720.9220.11優(yōu)水平AzBzCzR2.443.752.64優(yōu)水平組合AzBzCz主次順序BCA(3)驗證試驗。以確定的最佳條件作驗證試驗，結(jié)果所需消化時間僅為12 min。另外，以最佳條件在學生課堂試驗中作驗證實驗，結(jié)果與本文的結(jié)論完全一致。(4)對比試驗。把本次試驗確定的最佳條件與其他資料報道的條件作對比試驗，對比結(jié)果如表3。表3 消化時間對比試驗方法試樣重/gKzSO4/gCuSO4.5HzO/g HzSO4/g消化時間/min10.200010.000.5020.0030.0020.20003.000.2020.0045.0030.20002.500.136.0025.0040.20002.500.104.0012.004.4結(jié)果與討論(1)由正交試驗結(jié)果看出，各因素對消化時間的影響是有差異的。各因素的優(yōu)水平為；CuS045Hz0 2.50 g，KzSO4 0.10 g，濃HzS04 400 mL。以最佳條件作驗證試驗，消化時間僅為12 min。(2)以消化時間為指標對試驗結(jié)果進行正交試驗極差分析，可知CuS045Hz0的用量對消化時間的影響為主要因素，濃HzS04和KzS04的用量為第二、第三主要因素。(3)由表3可知，樣品用本試驗所得結(jié)果進行消化，消化時間是方法1 和方法3 的12多，是方法2 的約14。(4)用本文所得出的CuS045Hz0、KzS04、濃HzS04用量作消化試驗，一方面可大大縮短整個凱氏定氮過程的時間，另一方面試劑用量的減少，可降低試驗成本，也降低了對環(huán)境的污染。這樣不僅能使學生課堂試驗能在規(guī)定的時間內(nèi)完成，也適合批量樣品中蛋白質(zhì)含量的消化測定，有一定的應用價值。5 凱氏定氮法消化裝置的改進1概述凱達爾法，又稱凱氏定氮法，用來測定有機物中氮的含量，是一種經(jīng)典方法。由于該法儀器設備簡單，操作方便，又能同時測定多個試樣，因而得到廣泛應用。凱達爾法配套的儀器為凱氏消化裝置、水蒸氣蒸餾裝置和滴定裝置。這些儀器中，水蒸汽蒸餾裝置、滴定裝置技術(shù)較為成熟，而凱氏消化裝置仍在不斷改進中。普通消化裝置必須在通風櫥中進行操作，這是因為實驗過程中分解產(chǎn)生的SOz和SO3會造成環(huán)境污染。湖北省輕工業(yè)學校1995年訂購10套消化裝置。該裝置中，冷凝水由A到B經(jīng)軟管到C，入水泵E。消化分解的SOz和SO3氣體由水泵E引入水槽，溶于水面避免了環(huán)境污染。但使用過程中發(fā)現(xiàn)了一下兩個新問題。（1）供水水壓波動時，A、B兩處的連接軟管很容易脹脫，造成冷凝水濺到底瓶D上，致使底瓶急冷炸裂，熱濃硫酸損壞加熱電爐，有時甚至造成實驗人員的灼燙傷。（2）底瓶D的瓶頸較短，熱濃硫酸冷凝回流時，易在此處導致氣液沖擊現(xiàn)象（上升的SOz、SO3與冷凝的濃硫酸沖擊），使得加熱不能連續(xù)進行。我們對原裝置進行了改進，克服了上述缺點，新裝置如下，其改進之如下：（1） 增大A、B兩處凸出，并適當加長，輔以套夾以防連接軟管脹脫。（2） 使冷凝管同底D的連接方式由垂直變?yōu)樗綇澢?，同時將連接冷凝管和底瓶D的玻璃管加長至30cm，以空氣冷凝為輔助措施提高冷凝效果、消除氣液沖擊現(xiàn)象。（3） 將普通電爐改為凹形電爐，增加底瓶保溫效果，縮短消化分解時間。實驗表明該裝置性能良好畢業(yè)論文成績評定表專業(yè)班級化工0801姓 名蘇慶豪論文題目凱氏定氮法在測量大豆蛋白的不確定度分析指導教師初審成績評定內(nèi)容論文選題資料利用學術(shù)造詣知識掌握科研能力論文完成情況寫作能力寫作規(guī)范總成績成績評分標準10分10分20分20分10分10分10分10分100分實際評分答辯成績評定內(nèi)容儀態(tài)儀表語言答辯效果知識掌握科研能力論文完成情況寫作能力寫作規(guī)范總成績評分標準10分10分20分20分10分10分10分10分100分實際評分評語指導教師評語：答辯小組評語：指導教師 _ 年 月 日評審教師 _ 年 月 日答辯負責人_ 年 月 日