蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)ppt課件

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第四章 蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì),1,重點(diǎn)與難點(diǎn),熱力學(xué)相關(guān)函數(shù)：熵、焓、熱容量 蛋白質(zhì)折疊相關(guān)作用力 蛋白質(zhì)的折疊過(guò)程,2,第一節(jié) 熱力學(xué)函數(shù)與蛋白質(zhì)構(gòu)象,3,一、熱力學(xué)函數(shù)與熱力學(xué)平衡,·內(nèi)能：組成物體的所有分子的無(wú)規(guī)則運(yùn)動(dòng)的動(dòng)能與分子間相互作用的勢(shì)能之和。,4,焓(enthalpy)：是一個(gè)系統(tǒng)的熱力學(xué)參數(shù)。,它描述的是體系的一個(gè)狀態(tài)性質(zhì)，焓的變化是系統(tǒng)在等壓可逆過(guò)程中所吸收的熱量的度量。用符號(hào)H表示，即 H=E+pV E為系統(tǒng)內(nèi)能，p為其壓強(qiáng)，V則為體積,5,熵（S）是度量體系混亂度的熱力學(xué)函數(shù) 從微觀的角度來(lái)看，熵具有統(tǒng)計(jì)意義，它是體系微觀狀態(tài)數(shù)(或無(wú)序程度)的一種量度。 熵值小，對(duì)應(yīng)比較有秩序的狀態(tài) 熵值大，對(duì)應(yīng)比較無(wú)秩序的狀態(tài),6,內(nèi)能(E)和焓(H)是體系自身的性質(zhì)，要認(rèn)識(shí)它們，需憑借體系和環(huán)境間熱量和功的交換從外界的變化來(lái)推斷體系E和H的變化值。 熵也是如此，體系在一定狀態(tài)下有一定的值，當(dāng)體系發(fā)生變化時(shí)要用可逆變化過(guò)程中的熱溫熵來(lái)衡量它的變化值。,7,?吉布斯自由能(Gibbs free energy,G):亦稱吉布斯函數(shù)，它是定溫定壓下系統(tǒng)的狀態(tài)函數(shù)?？梢杂霉奖硎緸椋?G=H-TS=E+pV-TS 其中，T為絕對(duì)溫度；S為體系的熵 注意:吉布斯自由能是體系的性質(zhì)，它的大小只決定于體系的始態(tài)和終態(tài)，而與變化的途徑無(wú)關(guān)(即與可逆與否無(wú)關(guān))。,8,二、熱容量,熱容量:指系統(tǒng)在某一過(guò)程中，溫度升高（或降低）1℃所吸收（或放出）的熱量。熱容量的單位是J/K。 系統(tǒng)的熱容量與狀態(tài)的轉(zhuǎn)變過(guò)程有關(guān)，與它所包含的物質(zhì)的質(zhì)量成正比，不同過(guò)程的熱容量不同。 系統(tǒng)吸收的熱量為正值，釋放的熱量為負(fù)值 使用微分掃描量熱儀直接測(cè)定熱容量變化,9,三、van’t Hoff 焓,? Van’t Hoff 規(guī)則 ：荷蘭科學(xué)家范特霍夫 提出, 溫度每升高10 K, 反應(yīng)速度增加2-4倍,,,10,當(dāng)溶液中的活性狀態(tài)N與失活狀態(tài)U處于平衡時(shí)，平衡常數(shù)K=[U]/[ N] 取決于兩種自由能之差?G=GU－GN 。 自有能差?G也可以用焓差?H=HU－HN和 熵差?S=SU－SN 表示為： ?G = ?H－T?S 于是： －RT·lnK = ?H0－T?S0 由此看出，平衡常數(shù)對(duì)溫度的依賴關(guān)系可以用來(lái)估計(jì)?H的大小。H0和S0 分別表示標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的焓和熵。 所以 lnK = －?H0/ RT+?S0/R 即 lnK =（－?H0/ R）（1/T）+?S0/R,11,以lnK的實(shí)驗(yàn)值對(duì)1/T作圖，可以得到一條直線，這條線上任何點(diǎn)上的斜率為 Van't Hoff焓（△H0）與R之比。,Van’t Hoff焓主要用于兩態(tài)轉(zhuǎn)變模型的分析,12,四、蛋白質(zhì)構(gòu)象與熱運(yùn)動(dòng),構(gòu)象:由于單鍵基本自由旋轉(zhuǎn)以及鍵角有一定的柔性，一種具有相同結(jié)構(gòu)和構(gòu)型的分子在空間里可采取多種形態(tài)，分子所采取的特定形態(tài)稱為構(gòu)象。 構(gòu)象角:圍繞單鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱為構(gòu)象角,它決定了多肽鏈的一個(gè)結(jié)構(gòu) 。,13,熱運(yùn)動(dòng):是指蛋白質(zhì)溶液中所有分子的不停運(yùn)動(dòng)，包括了分子相對(duì)于容器的運(yùn)動(dòng)和分子內(nèi)部各部分之間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)。 熱運(yùn)動(dòng)在溶液中和多肽鏈的各部分之間傳播，主要是通過(guò)多肽鏈各部分之間和多肽鏈與溶液分子之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 體系達(dá)到熱力學(xué)平衡時(shí)，在空間的一定范圍內(nèi)和一定間隔內(nèi)的平均熱運(yùn)動(dòng)能量不再發(fā)生變化，蛋白質(zhì)處于天然態(tài) 。,14,五、熱力學(xué)參數(shù)在分子水平上的解釋,從分子的相互作用來(lái)理解蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性 為了使蛋白質(zhì)折疊起來(lái)，就需要通過(guò)多肽鏈各部分間相互作用所引起的內(nèi)能的減少來(lái)抵消構(gòu)象熵減少帶來(lái)的自由能增加。,G=H-TS=E+pV-TS,15,熵是水溶液中形成疏水基團(tuán)間結(jié)合的主要熱動(dòng)力學(xué)驅(qū)動(dòng)力。,穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力：氫鍵、范德華力、疏水作用力和鹽鍵（離子鍵）及共價(jià)二硫鍵。,16,1．靜電相互作用,蛋白質(zhì)的折疊態(tài)與退折疊態(tài)的空間結(jié)構(gòu)不同，在水溶液中，表現(xiàn)為同一個(gè)可電離基團(tuán)附近環(huán)境的有效介電常數(shù)的變化，于是它們的pka值也不同。 殘基pka值的移動(dòng)很小，但蛋白質(zhì)大分子可電離集團(tuán)相當(dāng)多，小pka值移動(dòng)的大量積累對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性很重要。 靜電相互作用對(duì)折疊穩(wěn)定性潛在的重要性,17,2．范德華相互作用,范德華力（van der Waals interaction） 在物質(zhì)的聚集態(tài)中，分子間存在著一種較弱的吸引力，當(dāng)兩個(gè)不帶電荷的原子非常靠近時(shí)，它們的電子云相互作用，核周?chē)娮游恢玫碾S機(jī)變化可能產(chǎn)生一個(gè)瞬間電偶。該電偶能夠誘導(dǎo)鄰近的原子產(chǎn)生一個(gè)短暫的反向電偶。這兩個(gè)電偶之間會(huì)產(chǎn)生微弱的引力,從而拉近兩個(gè)原子核。這種微弱的吸引力即為范德華力 。,18,范德華力組成： 取向力 :當(dāng)極性分子相互接近時(shí)，它們的固有偶極將同 極相斥而異極相吸，定向排列，產(chǎn)生分子間的作用力 誘導(dǎo)力 :當(dāng)極性分子與非極性分子相互接近時(shí)，非極性分子在 極性分子的固有偶極作用下，發(fā)生極化，產(chǎn)生誘導(dǎo)偶 極，然后誘導(dǎo)偶極與固有偶極相互吸引而產(chǎn)生分子間作 用力 色散力 :非極性分子之間，由于組成分子的正、負(fù)微粒不斷運(yùn) 動(dòng)，產(chǎn)生瞬間正、負(fù)電荷重心不重合，而出現(xiàn)瞬時(shí)偶 極。瞬時(shí)偶極之間的相互作用力 。,19,3.氫鍵（Hydrogen Bonding）,由電負(fù)性原子與氫形成的基團(tuán)如（N-H和O-H）具有很大的偶極矩，成鍵電子云分布偏向負(fù)電性大的原子，因此氫原子核周?chē)碾娮臃植季蜕?，正電荷的氫?質(zhì)子)就在外側(cè)裸露。這一正電荷氫核遇到另一個(gè)電負(fù)性強(qiáng)的原子時(shí)，就產(chǎn)生靜電吸引，即氫鍵。,20,,在生物相中最常見(jiàn)的氫鍵是羥基（-OH）和氨基（-NH）之間，其穩(wěn)定性遞減次序大約是OHNXONHN-NHO，這種鍵可以發(fā)生在分子間、分子內(nèi)或者二者的結(jié)合。,21,氫鍵對(duì)蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定作用只能來(lái)自于水-水氫鍵+鏈內(nèi)氫鍵，和水-肽鏈氫鍵兩種情況下的自由能之差。蛋白質(zhì)中有許多種氫鍵。,22,氫鍵在蛋白折疊過(guò)程中的作用,杜克大學(xué)（Duke University）的化學(xué)家們通過(guò)改變蛋白質(zhì)關(guān)鍵部位的單個(gè)原子，發(fā)現(xiàn)了相對(duì)作用力較弱的氫鍵在使線形蛋白折疊成能發(fā)揮生物活性的最穩(wěn)定結(jié)構(gòu)中有重要作用,PANS,2006,23,4.疏水效應(yīng)（hydrophobic effect）,疏水效應(yīng):水介質(zhì)中球狀蛋白質(zhì)的折疊總是傾向于把疏水殘基埋藏在分子的內(nèi)部。 蛋白質(zhì)溶液系統(tǒng)的熵增加（熵變化?S為正值）是疏水作用的主要?jiǎng)恿Α?24,疏水作用是疏水基團(tuán)或疏水側(cè)鏈出自避開(kāi)水的需要而被迫接近。要使疏水氨基酸R基團(tuán)排除水而埋在內(nèi)部，至少需要兩層二級(jí)結(jié)構(gòu)。兩種簡(jiǎn)單形式，β-α-β環(huán)（β-α-βloop）和α-α角（α-αcorner）。,25,,A,B,吲哚與苯環(huán)邊對(duì)面T型接觸,惡唑環(huán)與苯環(huán)面對(duì)面平行接觸,疏水作用的方向傾斜性實(shí)例圖,26,5.二硫鍵,二硫鍵(共價(jià)鍵) 為了確定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，須在2-巰基乙醇、二硫蘇糖類、巰基乙酸等硫化合物與尿素等變性劑同時(shí)存在下將二硫鍵打開(kāi) RNA酶復(fù)性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二硫鍵對(duì)肽鏈的正確折疊不是必要的，但它對(duì)穩(wěn)定折疊態(tài)結(jié)構(gòu)作出貢獻(xiàn)。,27,6.鹽橋或離子鍵,鹽橋或離子鍵又稱鹽鍵，它是正電荷與負(fù)電荷之間的一種靜電相互作用。 鹽鍵的形成既是靜電相互作用的過(guò)程也是熵增的結(jié)果。,28,第二節(jié) 突變、穩(wěn)定性和折疊,一、體外突變技術(shù) 概念:體外突變技術(shù)是用酶學(xué)方法和化學(xué)方法剪切或合成DNA ，將突變導(dǎo)入到克隆化的基因中，再將改變的基因重新克隆到生物體中分析該基因的功能變化的一項(xiàng)技術(shù)。 分類: 隨機(jī)突變 定點(diǎn)突變 3.應(yīng)用:研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系 。,29,4.具體事例： 改進(jìn)α-抗胰蛋白酶 α-抗胰蛋白酶與嗜中性白細(xì)胞彈性硬蛋白酶結(jié)合形成復(fù)合物,將后者在Met358和Ser359之間切斷,30,,提高重組干擾素的專一活性 β- IFN 基因在E.coli中表達(dá),產(chǎn)物的抗病毒活性為天然糖基化蛋白的10% 3個(gè)Cys Cys31-Cys141 Cys17 Ser17,,31,提高T4溶菌酶的熱穩(wěn)定性,T4 溶菌酶(Cys54 -Cys97) Ile3 Cys3 -Cys97 熱穩(wěn)定性 Cys21 Cys142 穩(wěn)定性 酶活性,,,,,,,,32,磷酸丙糖異構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)改造提高其穩(wěn)定性,高溫：Asn Asp Gln Glu 失活 Asn14 、Asn78 Thr或Ile 熱穩(wěn)定性,,,,,33,二、突變與熱穩(wěn)定性,,,,1.定點(diǎn)突變對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響 氨基酸的插入和刪除、寡聚化和脯氨酸取代這三因素可以穩(wěn)定個(gè)別嗜熱蛋白。 2.導(dǎo)致熱穩(wěn)定性的因素 堆積、寡聚化、氨基酸插入和刪除、脯氨酸取代、螺旋含量、螺旋傾向、極性表面積、氫鍵和鹽橋 3.突變?cè)囼?yàn)增加蛋白質(zhì)的親鹽性 例如親鹽的蘋(píng)果酸脫氫酶中的唯一的Glu替換為Arg,34,三、蛋白質(zhì)折疊,1 . 蛋白質(zhì)折疊研究的概況 ※蛋白質(zhì)折疊:蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)并沒(méi)有生物活性，結(jié)構(gòu)決定功能，一維的線型氨基酸序列轉(zhuǎn)化為具有特征三維結(jié)構(gòu)的天然蛋白質(zhì)才具有生物活性，這種自我組裝的過(guò)程被稱為蛋白質(zhì)折疊。 ※追蹤蛋白質(zhì)重折疊的全過(guò)程的實(shí)驗(yàn)方法： 快速核磁共振，快速光譜技術(shù)（熒光、圓二色譜）,35,※蛋白質(zhì)折疊技術(shù)的研究應(yīng)當(dāng)將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究與折疊過(guò)程動(dòng)力學(xué)研究相結(jié)合以促進(jìn)對(duì)蛋白質(zhì)折疊機(jī)理的認(rèn)識(shí)。 ※“新生肽的折疊”問(wèn)題與中心法則,36,2．蛋白質(zhì)折疊機(jī)制,※Anfinsen經(jīng)典的“熱力學(xué)假說(shuō)” 天然蛋白質(zhì)多肽鏈采取的構(gòu)象是在一定環(huán)境條件下熱力學(xué)上最穩(wěn)定的結(jié)果，采取天然構(gòu)象的多肽鏈和它所處的一定環(huán)境條件整個(gè)系統(tǒng)的總自由能最低。蛋白質(zhì)多肽鏈折疊的過(guò)程，也就是從眾多可能的構(gòu)象中尋找系統(tǒng)自由能最低的狀態(tài)的過(guò)程。,37,Wolynes提出粗糙能量地形面的觀點(diǎn),即折疊是在一個(gè)折疊漏斗中進(jìn)行的。蛋白質(zhì)折疊的過(guò)程就象多溪流水從具有復(fù)雜地形結(jié)構(gòu)的山坡流下一樣，而不僅是一溪流水從一單個(gè)山谷中流下。 折疊的能量漏斗模型形象地描繪了折疊過(guò)程的多路徑性,圖 能量漏斗模型,38,蛋白質(zhì)折疊過(guò)程假設(shè),※ 肽鏈中的局部肽段先形成一些構(gòu)象單元即α螺旋、β折疊和β轉(zhuǎn)角等二級(jí)結(jié)構(gòu)，然后再是二級(jí)結(jié)構(gòu)的組合、排列形成蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。 ※ 首先是肽鏈內(nèi)部的疏水作用起作用，產(chǎn)生一個(gè)塌陷過(guò)程，然后經(jīng)調(diào)整，形成不同層次的結(jié)構(gòu)。,39,不同的假設(shè)，都有一個(gè)所謂“熔球態(tài)”的中間狀態(tài),※ 熔球體：在折疊中，第一個(gè)可觀測(cè)到的中間體是未折疊多肽卷折成局部有組織的球狀態(tài)。,40,※分子伴侶與蛋白質(zhì)折疊 分子伴侶的功能 (1)可調(diào)節(jié)性地阻礙多肽鏈集聚 (2)具有折疊互補(bǔ)功能,即可使已形成的蛋白質(zhì)集聚體重折疊和恢復(fù)其水溶性 (3)可以促進(jìn)折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)降解,41,,“有幫助的肽鏈的自發(fā)折疊和組裝”,42,3.蛋白質(zhì)折疊研究的最新進(jìn)展,巴西圣保羅州立大學(xué),美國(guó)紐約州立石溪大學(xué),以及中科院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所電分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究人員在之前研究的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了擴(kuò)散(diffusion)在蛋白折疊動(dòng)力學(xué)方面的重要作用。 擴(kuò)散系數(shù)隨著蛋白質(zhì)天然狀態(tài)折疊級(jí)數(shù)的增加而減小，這主要是由于構(gòu)造空間約束的一種緊密狀態(tài)的塌陷造成的。它改變折疊動(dòng)力學(xué)的比率和動(dòng)力學(xué)路徑。,PNAS,43,,美國(guó)康奈爾大學(xué)和Scripps Research Institute的研究者發(fā)現(xiàn)：沿著肽鏈具有很多疏水基團(tuán)依賴自身折疊的位點(diǎn)，生成了小型的非極性疏水袋，蛋白質(zhì)沿著包含有非極性基團(tuán)或者含有不帶電荷分子的氨基酸鏈處開(kāi)始折疊，并通過(guò)這些非極性基團(tuán)的組合進(jìn)一步折疊。,PNAS，2006,44,4.蛋白質(zhì)折疊研究意義及應(yīng)用前景,※蛋白質(zhì)折疊研究意義 蛋白質(zhì)折疊機(jī)制的闡明有助于揭示生命體內(nèi)第二套遺傳密碼的理論意義。 最終闡明遺傳信息傳遞的全過(guò)程，完全建立分子生物學(xué)的中心法則。,45,應(yīng)用前景,（1）對(duì)包涵體的復(fù)性有重要幫助 （2）DNA重組和多肽合成技術(shù)的發(fā)展使我們能夠按照自己的意愿設(shè)計(jì)較長(zhǎng)的多肽鏈 （3）深入了解蛋白質(zhì)折疊與錯(cuò)誤折疊的關(guān)系對(duì)于這些疾病的致病機(jī)制的闡明以及治療方法的尋找將大有幫助 （4）蛋白質(zhì)折疊機(jī)制的闡明是我們對(duì)于蛋白質(zhì)相互作用、配體與蛋白質(zhì)的作用等結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究的基礎(chǔ) （5）提高蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的可靠性,46,第三節(jié) 蛋白質(zhì)折疊熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué),蛋白質(zhì)折疊內(nèi)容： （1）變性的蛋白質(zhì)或多肽鏈的折疊 （2）通過(guò)三聯(lián)密碼翻譯成的氨基酸序列鏈(新生肽鏈) 的折疊 蛋白質(zhì)折疊的研究方法 （1）X-射線晶體衍射 （2）同源模建方法 （3）從蛋白質(zhì)序列出發(fā)，直接預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)？,47,一、蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)研究,Anfinsen認(rèn)為,蛋白質(zhì)的折疊結(jié)構(gòu)在一定條件下是熱力學(xué)最穩(wěn)定的,即通常的自由能極小的狀態(tài)。 環(huán)境條件不同，熱力學(xué)平衡移動(dòng)的方向就不同，可以向天然態(tài)方向移動(dòng)，也可以向退折疊方向移動(dòng)，就有了平衡態(tài)的折疊和退折疊轉(zhuǎn)變過(guò)程。 通過(guò)熵函數(shù)和吉布斯自由能,簡(jiǎn)要分析蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)中所蘊(yùn)涵的熱力學(xué)基本原理,48,蛋白質(zhì)折疊研究的漏斗模型,49,1.熵效應(yīng),熵增加原理：在絕熱條件下，體系發(fā)生不可逆過(guò)程時(shí)，其熵值增大；而體系發(fā)生可逆過(guò)程時(shí)，其熵值不變；不可能發(fā)生熵值減小的過(guò)程。 疏水作用的主要?jiǎng)恿?lái)自于蛋白質(zhì)溶液體系的熵增效應(yīng)。 例如,疏水作用是肌紅蛋白多肽鏈折疊的主要驅(qū)動(dòng)力, 使水介質(zhì)中球狀蛋白質(zhì)的折疊總是傾向于把疏水殘基隱藏在分子的內(nèi)部，其在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)方面占有突出的地位。,50,2.吉布斯自由能變化,※ ΔG總=ΔH鏈+ΔH溶劑- TΔS鏈- TΔS溶劑 ※ 折疊態(tài)蛋白質(zhì)與伸展態(tài)相比，是一種高度有序化的結(jié)構(gòu)，因此ΔS鏈?zhǔn)秦?fù)數(shù)，則-TΔS鏈為正值。 ※ 折疊態(tài)蛋白質(zhì)中疏水側(cè)鏈主要是通過(guò)范德華力彼此相互作用。 ※ 對(duì)于典型的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，對(duì)折疊結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性做出單項(xiàng)最大貢獻(xiàn)的是疏水殘基引起的ΔS溶劑。,51,3．折疊/退折疊轉(zhuǎn)變,蛋白質(zhì)折疊歸根結(jié)底取決于在某溫度（T）下折疊態(tài)（F）和伸展態(tài)（U）之間的吉布斯自由能差（△G）： ΔG=GF－GU=ΔH－TΔS=（HF－HU）－T（SF－SU） 在伸展態(tài)中多肽主鏈及其側(cè)鏈?zhǔn)桥c溶劑水（也稱介質(zhì)水或環(huán)境水）相互作用的，因此折疊時(shí)自由能變化（△G）的任何測(cè)量必須考慮多肽鏈和溶劑兩者對(duì)焓變化（△H）和熵變化（△S）的貢獻(xiàn)： ΔG總=ΔH鏈＋ΔH溶劑－TΔS鏈－TΔS溶劑 極性側(cè)鏈?H鏈?zhǔn)钦?，?H溶劑是負(fù)值。對(duì)蛋白質(zhì)的極性側(cè)鏈來(lái)說(shuō)，?G總接近于零，對(duì)蛋白質(zhì)折疊不作實(shí)質(zhì)性的貢獻(xiàn)。,52,幾種蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)數(shù)據(jù),※ 在不同蛋白質(zhì)中總熵變化（ΔS鏈+ΔS溶劑）和總焓變化對(duì)折疊結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性所做的貢獻(xiàn)的份額是不同的,53,,折疊結(jié)構(gòu)在生理?xiàng)l件下是自由能最低的構(gòu)象，因此多肽鏈的折疊是自發(fā)過(guò)程。,54,4.量熱法與折疊過(guò)程熱力學(xué),量熱試驗(yàn)是用一種微分掃描量熱儀直接測(cè)定熱容量的變化，還可以測(cè)定焓變、熵變。,N,U,55,二、蛋白質(zhì)折疊的動(dòng)力學(xué)研究,,※ 蛋白質(zhì)折疊 線性多肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu)最終形成具有三維 結(jié)構(gòu)特征并表現(xiàn)其生物學(xué)功能的天然蛋白質(zhì)的 復(fù)雜過(guò)程。 ※ 蛋白質(zhì)折疊的步驟,56,57,1．折疊動(dòng)力研究技術(shù)與方法,Levinthal puzzle：假定每個(gè)氨基酸殘基可能的構(gòu)象狀態(tài)數(shù)為j，一個(gè)有N+1個(gè)氨基酸殘基，N個(gè)肽單位的完全去折疊蛋白質(zhì)，其肽鏈可能獲得的構(gòu)象狀態(tài)數(shù)為j N。 例如j=8,一個(gè)有101個(gè)氨基酸殘基的較小的蛋白質(zhì)，其肽鏈的可能構(gòu)象狀態(tài)為8100（1089） 如果構(gòu)象之間的轉(zhuǎn)換速率為k，蛋白分子經(jīng)歷全部構(gòu)象的平均時(shí)間為： τ=（Nk）-1jN 例如：101個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)經(jīng)歷全部構(gòu)象的時(shí)間多于1066年。,58,,蛋白質(zhì)的折疊不是一個(gè)隨機(jī)過(guò)程，而是通過(guò)特定的動(dòng)力學(xué)途徑達(dá)到天然構(gòu)象，即動(dòng)力學(xué)上最容易達(dá)到的構(gòu)象。,59,蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的形成,60,蛋白質(zhì)多肽鏈正確折疊原因 某些因素在蛋白質(zhì)折疊的動(dòng)力學(xué)過(guò)程中起控制作用 。 如：I型人類胰島素生長(zhǎng)因子（IGF-I） 枯草桿菌蛋白酶(subtilisin) 蛋白質(zhì)折疊動(dòng)力學(xué)控制的研究基礎(chǔ)----熱力學(xué)假說(shuō) 蛋白質(zhì)構(gòu)象的研究方法 測(cè)定溶液中的蛋白質(zhì)分子構(gòu)象 測(cè)定晶體蛋白質(zhì)分子構(gòu)象,61,測(cè)定蛋白質(zhì)構(gòu)象的各種方法,62,2.過(guò)渡態(tài),,模擬的折疊過(guò)程,過(guò)渡態(tài)理論 是否適合于描述蛋白質(zhì)分子的折疊／退折疊過(guò)程 ？,63,3．折疊中間態(tài),(1)熔球態(tài)（molten globule） ※主要特征: ①天然態(tài)二級(jí)結(jié)構(gòu)，但三級(jí)結(jié)構(gòu)卻不完整； ②它比天然態(tài)有較多的疏水區(qū)域暴露； ③當(dāng)熔球態(tài)變性到伸展態(tài)時(shí)，溫度躍遷消失。 例如Goto等發(fā)現(xiàn)，在強(qiáng)酸導(dǎo)致肽鏈完全伸展時(shí)，可以得到β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin）、細(xì)胞色素c（cytochromec）及去輔基肌紅蛋白（apo-Mb）的熔球態(tài)。,64,※蛋白質(zhì)正確折疊過(guò)程中的阻礙,①部分折疊的中間體在分子間疏水作用下而引起的聚集 ②脯氨酸殘基的異構(gòu)化 ③半胱氨酸錯(cuò)誤配對(duì)而形成的二硫鍵連接,65,折疊?。?蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列沒(méi)有改變，只是其結(jié)構(gòu)或者說(shuō)構(gòu)象有所改變也能引起疾病。 瘋牛病 朊病毒：正常蛋白的錯(cuò)誤折疊形成的致病蛋白-朊病毒蛋白(PrP)在腦組織中累積而引起的,※蛋白質(zhì)折疊病,66,67,其它常見(jiàn)的折疊病 老年性癡呆癥、囊性纖維病變、家族性高膽固醇癥、家族性淀粉樣蛋白癥、某些腫瘤、白內(nèi)障等等都是折疊病。,68,（2）快態(tài)與慢態(tài),蛋白質(zhì)退折疊態(tài)的構(gòu)象上具有多樣性: 例如牛胰核糖核酸酶在變性條件下發(fā)生退折疊，結(jié)果表明，只能觀察到兩種構(gòu)象—天然態(tài)N和伸展態(tài)U，并且它們處于快速平衡中：,,,,,,,,69,RNase的重折疊快相和慢相的雙相動(dòng)力學(xué)過(guò)程,退折疊蛋白質(zhì)中，脯氨酰異構(gòu)化是研究得較為清楚的慢反應(yīng),70,,,,,,,,,,U,,M,,N,,蛋白質(zhì)在某些變性條件下還存在平衡中的另一狀態(tài)，如α-乳清蛋白。,71,（3）二硫鍵引起的中間態(tài),二硫鍵異構(gòu)酶功能 ①具有催化蛋白質(zhì)天然二硫鍵快速形成的能力 ②特異性較低可與各種不同的肽鏈結(jié)合 二硫鍵異構(gòu)酶作用機(jī)制推測(cè) 通過(guò)與肽段結(jié)合阻止了錯(cuò)誤的折疊途徑,促進(jìn)生成正確的中間物，幫助肽鏈折疊使相應(yīng)的巰基配對(duì)，從而使正確的二硫鍵得以形成，然后催化巰基的氧化或二硫鍵的異構(gòu)而形成天然二硫鍵。,72,,巰基／二硫鍵氧化還原酶在二硫鍵生成反應(yīng)中起著氧化劑的作用 例如： 大腸桿菌中有DsbA和DsbC蛋白，真核細(xì)胞中有二硫鍵異構(gòu)酶,73,4．折疊的基本過(guò)程,折疊主要經(jīng)歷以下三種基本過(guò)程 ①接觸形成 ②螺旋-鏈環(huán)轉(zhuǎn)變 ③β發(fā)卡（β-hairpin）：是普遍存在于球狀蛋白中的一種結(jié)構(gòu)，由一條構(gòu)象伸展的多肽鏈彎曲后彼此靠近成反向平行而形成，含有10或11個(gè)氨基酸殘基，兩條等長(zhǎng)的肽段依靠1～6個(gè)氫鍵連接。,74,謝謝！,75,