《生物化學(xué)實驗ⅰ》word版

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1、生物化學(xué)實驗Ⅰ 實驗一 糖的制備、定性及含量分析（4課時） 一、 實驗?zāi)康? 1. 學(xué)會糖的制備； 2. 利用糖的呈色反應(yīng)來粗略的定性糖類； 3. 糖的含量測定 4. 學(xué)會使用分光光度計。 二、 實驗原理 　　還原糖溶于水，非還原糖被酸水解后一般也溶于水，故可用水提取。而原料中的蛋白質(zhì)可用調(diào)PH值的方法除去或用沉淀劑，糖的進一步純化可采用乙醇沉淀糖。 糖的呈色反應(yīng)有：Molisch反應(yīng)、Fehling反應(yīng)、Benedict反訴反應(yīng)等多種呈色反應(yīng)?？纱致缘亩ㄐ?，較精確則是TCL（單糖，多糖需水解）、GC、HPLC、IR、UV、GC/HPLC－MS來定性。本實驗用Mol

2、isch反應(yīng)粗略的定性。 還原糖的測定是糖定量測定的基本方法，對沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進行測定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計）。還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計，在540nm波長下測定光密度值，查對標準曲線并計算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時，每斷裂一個糖苷鍵需加入一分子水，所以在計算多糖含量時應(yīng)乘以0.9。 三、 實驗材料、主要儀器和試劑 1．

3、 實驗材料 小麥面粉或羅望子；精密pH試紙。 2． 主要儀器 （1）具塞玻璃刻度試管：20mL×11 （2）大離心管：50mL×2 （3）燒杯：100mL×1 （4）三角瓶：100mL×1 （5）容量瓶：100mL×3 （6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1 （7）恒溫水浴鍋 （8）沸水浴 （9）離心機 （10）電子天平 （11）分光光度計 3． 試劑 （1）1mg/mL葡萄糖標準液 準確稱取80℃烘至恒重的分析純葡萄糖100mg，置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，混勻，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩? （

4、2）3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑 將6.3g DNS和262mL 2M NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，貯于棕色瓶中備用。 （3）碘-碘化鉀溶液：稱取5g碘和10g碘化鉀，溶于100mL蒸餾水中。 （4）酚酞指示劑：稱取0.1g酚酞，溶于250mL 70%乙醇中。 （5）6M HCl和6M NaOH各100mL。 （6）Molisch試劑：α－萘酚2g溶于95%乙醇并定容100ml，現(xiàn)配現(xiàn)用 （7）冰醋酸、亞硫酸氫鈉 四、 操作步驟 1．羅望子多糖的制備工藝流程如下；

5、 2．羅望子多糖的制備步驟 (1)原料的處理：先將羅望子種子外層紅褐色的種皮用機械或化學(xué)方法除凈，然后用粉碎機將白色的種仁粉碎至60一80目，得到白色的羅望于種仁粉。 (2)煮沸：取10g種仁粉，加入30倍的清水，充分攪拌均勻(為了防止加水后種仁粉結(jié)團，可先加入少量水，先將種仁粉調(diào)成糊狀，然后再加入剩余的水)，用冰醋酸溶液調(diào)節(jié)pH值，使水溶液的pH值控制在4．2—5．6之間，攪拌加熱至微拂，煮沸20一30min，得到一粘稠的漿狀液。 (3)靜置沉降；在漿狀液中加入原體積50％的熱水稀釋漿狀液，攪拌均勻后靜置沉淀8—12h，讓漿狀液中的蛋白質(zhì)顆粒等雜質(zhì)充分沉降

6、?；蛴秒x心機離心5min,5000r. (4)分離過濾：將靜置沉降后的上清液抽出，下層混思漿狀液用離心或壓濾的方法分離除去沉降物，合并上清液和濾液，得到乳白色漿液。 (5)濃縮：在乳白色漿液中加入少量NaOH稀溶液，將其PH值回調(diào)至中性，再加入少量亞硫酸氫鈉溶液漂白，然后加熱濃縮至粘稠的半流體狀時停止加熱。 (6)烘干粉碎，將粘稠的半流體漿倒入白色淺瓷盤中，放入干燥箱中在70℃一80℃的溫度下進行熱風(fēng)干燥，即得到片狀羅望子多糖，最后用粉碎機將片狀的羅望子多糖粉碎，即可得到灰白色的粉狀羅望子多糖。 3、糖的定量 （1）． 制作葡萄糖標準曲線 取7支20mL具塞

7、刻度試管編號，按表1分別加入濃度為1mg/mL的葡萄糖標準液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑，配成不同葡萄糖含量的反應(yīng)液。 表1 葡萄糖標準曲線制作 管 號 1mg/mL葡萄糖標準液 （mL） 蒸餾水 （mL） DNS （mL） 葡萄糖含量 （mg） 光密度值 （OD540nm） 0 0 2 1.5 0 ? 1 0.2 1.8 1.5 0.2 ? 2 0.4 1.6 1.5 0.4 ? 3 0.6 1.4 1.5 0.6 ? 4 0.8 1.2 1.5 0.8 ? 5 1.0 1.0 1

8、.5 1.0 ? 6 1.2 0.8 1.5 1.2 ? 將各管搖勻，在沸水浴中準確加熱5min，取出，冷卻至室溫，用蒸餾水定容至20mL，加塞后顛倒混勻，在分光光度計上進行比色。調(diào)波長540nm，用0號管調(diào)零點，測出1~6號管的光密度值。以光密度值為縱坐標，葡萄糖含量（mg）為橫坐標，在坐標紙上繪出標準曲線。 （2）． 樣品中還原糖和總糖的測定 A 還原糖的提取 準確稱取3.00g羅望子，放入100mL燒杯中，先用少量蒸餾水調(diào)成糊狀，然后加入50mL蒸餾水，攪勻，置于50℃恒溫水浴中保溫20min，使還原糖浸出。將浸出液（含沉淀）轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，于4 000r

9、/min下離心5min，沉淀可用20mL蒸餾水洗一次，再離心，將二次離心的上清液收集在100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，作為還原糖待測液。 B 總糖的水解和提取 準確稱取1.00g羅望子，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸餾水及10mL 6M HCl，置沸水浴中加熱水解30min（水解是否完全可用碘-碘化鉀溶液檢查）。待三角瓶中的水解液冷卻后，加入1滴酚酞指示劑，用6mol/LNaOH中和至微紅色，用蒸餾水定容在100mL容量瓶中，混勻。將定容后的水解液過濾，取濾液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容，混勻，作為總糖待測液。 C 制備羅望子多糖的含量測定 取上述實驗制

10、備的羅望子多糖8mg，加入去離子水10ml。 D 顯色和比色 取5支20mL具塞刻度試管，編號，按表2所示分別加入待測液和顯色劑，空白調(diào)零可使用制作標準曲線的0號管。加熱、定容和比色等其余操作與制作標準曲線相同。 表2 樣品還原糖測定 管 號 還原糖待測液 （mL） 總糖待測液 （mL） 多糖待測液 （mL） 蒸餾水 （mL） DNS （mL） 光密度值 （OD540nm） 查曲線葡萄糖量 （mg） 7 0.5 ? 1.5 1.5 ? ? 8 0.5 ? 1.5 1.5 ? ? 9 ? 1 1 1.5

11、? ? 10 ? 1 1 1.5 ? ? 11 1 1 1.5 12 1 1 1.5 4、糖的鑒定 Molisch反應(yīng)：取（1）、（2）的提取液各1ml,加入2滴molisch試劑、搖勻。傾斜試管加1ml濃硫酸，之后小心堅直。注意不要振搖。在糖溶液與濃硫酸兩液間出現(xiàn)紫環(huán)，證明有糖的存在。為鑒定糖類最常用的顏色反應(yīng) 五、 結(jié)果與計算： 計算出7、8號管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值及11、12管光密度值的平均值，在標準曲線上分別查出相應(yīng)的還原糖毫克數(shù)，按下式計算出樣品中還原糖和總糖的百

12、分含量。 ? 還原糖（%）= 查曲線所得葡萄糖毫克數(shù)× 提取液總體積 測定時取用體積 ×100 樣品毫克數(shù) ? 總糖（%）= 查曲線所得水解后還原糖毫克數(shù)×稀釋倍數(shù) ×0.9×100 樣品毫克數(shù) 羅望子多糖（%）= 查曲線所得水解后還原糖毫克數(shù)×稀釋倍數(shù) ×0.9×100 樣品毫克數(shù) 六、附 注 1． 離心時對稱位置的離心管必須配平。 2． 標準曲線制作與樣品測定應(yīng)同時進行顯色，并使用同一空白調(diào)零點和比色。 3． 面粉中還原糖含量較少，計算總糖時可將其合并入多糖一起考慮。 七、思考題 1．3,5-二硝基水楊酸比色法

13、是如何對總糖進行測定的? 2．如何正確繪制和使用標準曲線? 參考答案 1．植物中的總糖包括單糖、寡糖和多糖，單糖是還原糖，可直接測定。而沒有還原性的寡糖和多糖，需用高濃度的酸在加熱的條件下水解成有還原性的單糖，還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成一定比例關(guān)系，利用分光光度計，在540nm波長下測定光密度值，查對標準曲線并計算，可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時，每斷裂一個糖苷鍵需要加入一分子水，所以在計算多糖含量時應(yīng)乘以0.9。 2．標準曲線應(yīng)在坐

14、標紙上繪制，橫坐標軸距坐標紙底邊1.5~2cm，標示出刻度和葡萄糖的毫克數(shù)；縱坐標軸距坐標紙左邊1.5~2cm，標示刻度和光密度值；曲線為過原點的直線，測定點均勻分布在直線的兩側(cè)；標準曲線只能在測試條件完全相同的情況下，用于確定樣品中的物質(zhì)含量。對于重復(fù)的測定，應(yīng)取吸光度的平均值查標準曲線；測定數(shù)據(jù)不應(yīng)記在標準曲線上。 實驗二 糖的硅膠G薄層層析（4課時） 一、實驗?zāi)康模? 1.理解薄層層析原理， 2.掌握薄層層析技術(shù)， 3.學(xué)會糖的較為精確的定性。 二、實驗原理： 硅膠G是一種添加了粘合劑的硅膠粉，約含12％一13％的石膏，它可以把一些物質(zhì)從溶液中吸附于自身的表

15、面上，利用它對各種物質(zhì)的吸附能力不同，再用適當?shù)娜軇┫到y(tǒng)展層，使不同的物質(zhì)得以分開．使用顯色劑顯色，得到不同的Rf值。糖在硅膠G薄層上的移動速度與糖的分子量和羥基數(shù)有關(guān)，經(jīng)過適當?shù)娜軇┱归_后，糖在薄層上的移動速度是戊糖＞己糖＞雙糖＞三糖。 三、實驗材料、主要儀器和試劑 1． 實驗材料 　　　硅膠G、多糖 2．主要儀器 　　　帶密封蓋的層析缸、硅膠G板、毛細管、100℃的烘箱、電吹風(fēng)機、試管及試管架。 3．試劑 （1）糖標準溶液：木糖、葡萄糖、果糖和蔗糖10mg／m1水溶液。 （2）樣品液：多糖的水解液。 （3）展開劑：①乙酸乙酯：乙酸：水＝2：1：1；②氯仿：甲醇＝60：

16、40(V／V)。 （4）顯色劑：①25％一50％硫酸；②二苯胺1g，苯胺1ml和85％磷酸5ml溶于50mI丙酮中。 四、操作步驟 1．將硅膠G板于l00℃烘箱活化后冷卻至室溫，用毛細管點樣，點樣位置為從硅膠板下端1．5cm、兩側(cè)2—3cm，每個樣品點相距1一1．5cm，斑點直徑2mm。點一次吹干一次。 2．將展層劑于層析缸中平衡。數(shù)分鐘后，將硅膠板放入。 3．當展層劑移至距上端2—3cm時，取出硅膠板吹干，均勻噴上顯色劑，于100℃顯色。 4．15—30min后從烘箱取出，測量Rf值c 五、結(jié)果與計算： 　　　 六、[思考] 1．薄層層折與其他層析法比較

17、有哪些優(yōu)點? 實驗三　　氨基酸的薄層層析分離和鑒定（4課時） 一、實驗?zāi)康? 1．理解薄層層析原理， 2．掌握薄層層析技術(shù)， 3．學(xué)會氨基酸的較為精確的定性。 二、實驗原理 薄層層析法是一種檢驗微量物質(zhì)的快速準確的分析分離手段。它是將某種吸附劑在一塊玻璃板（或硬質(zhì)塑料板等）上鋪成均勻的薄層，把要分離鑒定的樣品溶液點在薄層板的一端，在密閉的層析缸內(nèi)用適宜的溶劑（即展開劑）展開，從而進行層析分析的方法。 吸附劑對被吸附化合物的吸附能力有強弱之分，這與吸附劑本身的性質(zhì)和被吸附化合物的性質(zhì)是有關(guān)的。當被測樣品隨著展開劑在吸附劑上前進時，由于不同化合物具有不同的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，展開劑對它們

18、的洗脫力和它們在吸附劑上的吸附、解吸附的性能也就有所不同，因而在吸附劑上移動的距離也就不會相同，這樣就達到了分離的目的。 在薄層層析中為了獲得良好的分離效果必須選擇適當?shù)奈絼┖驼归_劑。吸附劑含水較多時吸附能力就會大為減弱，因此使用吸附劑時一般要先進行加熱去水的活化處理。在薄層層析中所用的吸附劑種類很多，用得最廣泛的是氧化鋁和硅膠?；衔锉晃絼┪胶?，要選擇適宜的溶劑進行展開。展開劑是一種或兩種以上溶劑按一定比例組成的溶劑系統(tǒng)。溶劑的選擇通常是根據(jù)被測物中各成份的極性、溶解度以及吸附劑活性和分離效果等因素來考慮，否則會影響吸附劑活性和分離效果。 觀察層析結(jié)果時，如果化合物本身有顏色，可直

19、接觀察他的斑點。如本身無色，可用顯色劑顯色。不同物質(zhì)所用顯色劑是不同的。如果被測物質(zhì)是有機化合物，一般都可采用碘蒸氣進行顯色。本實驗中采用的是茚三酮顯色劑。 三、實驗材料、主要儀器和試劑 1． 實驗材料 　　　硅膠G、各種氨基酸、醬油等 2．主要儀器 　　　帶密封蓋的層析缸、載玻片、毛細管、100℃的烘箱、電吹風(fēng)機、試管及試管架。 3．試劑 （1）糖標準溶液：甘氨酸、10mg／m1水溶液。 （2）樣品液：調(diào)味品的水解液。 （3）展開劑：水:乙醇:乙酸 = 1:6:0.5　500ml （4）顯色劑：溶液：茚三酮O.2g溶于乙醇l00ml中。 方法：噴后于110oC加熱。

20、結(jié)果：呈紅紫色斑點。 四、實驗步驟 1．薄層板的制備 將10g硅膠G和15mL水在小燒杯內(nèi)迅速混合均勻，再加入5mL水繼續(xù)攪拌。將調(diào)好的糊狀物倒在洗凈干燥好的玻璃板上，用手搖晃，使其表面均勻光滑，厚度在0.25～1cm間為宜(我覺得鋪板時應(yīng)加一些粘合劑，因為展開劑中有水，板子比較松散容易掉片。我們用0.3%到0.5%的羧甲基纖維素鈉水溶液鋪板。)。在室溫下晾干后，置于烘箱內(nèi)慢慢升溫，在105～110℃下活化約半小時。取出后放于干燥器內(nèi)備用。所配制的硅膠乳狀液可制備薄層板3～5塊。 2．茚三酮顯色劑的制備 0.2%茚三酮異丙醇溶液 3．氨基酸的分離和鑒定 用毛細管分別取甘氨酸、

21、纈氨酸溶液（各約1.00mg/mL）在薄層板上一端約0.5cm處點樣。如在一塊板上點二個樣，則它們之間必須相隔一定距離；另取甘氨酸和纈氨酸混合溶液（0.5mg/L）點在另一塊薄層板上，點樣完畢。等斑點干燥后小心地將板置于盛有展開劑（水:乙醇:乙酸 = 1:6:0.5）的層析缸內(nèi)，點樣端浸入展開劑深度約0.3cm為宜。待展開劑上升了10cm以上后，可停止展開。取出薄層板，在前沿線處用大頭針輕輕穿刺薄層作出記號。等板晾干后，在110℃烘箱內(nèi)干燥大約10分鐘，然后用噴霧器均勻地噴上茚三酮顯色劑，再放入烘箱內(nèi)烘烤約15分鐘，即可顯出各析層斑點。分別測出氨基酸的R f值，并推斷它們相互混合時能否進行層析

22、分離。 五、結(jié)果與計算： 　　　 Rf= 原點到層析點中心的距離 原點到溶劑前沿的距離 六、附 注 1．在操作過程中，手必須洗凈，只能接觸薄板上層邊角；不能對著薄板說話，以防唾液掉在板上。 2．配制展層劑時，要用純?nèi)軇?，?yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，以免放置過久其成分發(fā)生變化（酯化）。 七、思考題 1．什么是分配系數(shù)？ 2．薄層層析中極性氨基酸與非極性氨基酸展層的速度哪個快一些？ 3．何為“邊緣效應(yīng)”？如何減輕或消除？ 叁考答案 1．分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達到平衡時，該溶質(zhì)在兩相溶劑中的濃度比值。在層析條件確定后分配系數(shù)是一常數(shù)，以K表示。 K=

23、 固定相中溶質(zhì)的濃度 流動相中溶質(zhì)的濃度 分配系數(shù)與溶劑和溶質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，同時受溫度、壓力的影響。所以不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同。而在恒溫恒壓條件下，某物質(zhì)在確定的層析系統(tǒng)中的分配系數(shù)為一常數(shù)。 2．層析的分離是基于氨基酸的非極性性質(zhì)。物質(zhì)的極性越?。捶菢O性越大），在有機溶劑中分配就越多，遷移率就越大；反之物質(zhì)的極性越大，遷移率越小。所以非極性氨基酸在有機溶劑中展層的速度快于極性氨基酸。 3．在用多元系統(tǒng)進行展層時，其中極性較弱的和沸點較低的溶劑（例如氯仿-甲醇系統(tǒng)中的氯仿）在薄層板的兩邊易揮發(fā)，因此，它們在薄層兩邊的濃度比在中部的濃度小，也就是說在薄層的兩邊比中部含有更多的極性較大或

24、沸點較高的溶劑，于是位于薄層兩邊的Rf值要比中間的高，即所謂“邊緣效應(yīng)”。 為減輕或消除邊緣效應(yīng)，可在層析缸的內(nèi)壁貼上浸濕了展開劑的濾紙，使層析缸內(nèi)溶劑蒸汽的飽和程度增加。 薄層層析法測定調(diào)味品中氨基酸含量 1　樣品的預(yù)處理 蛋白質(zhì)是由許多氨基酸分子通過肽鍵(—CO—NH—)縮合而成的。欲測定調(diào)味 品蛋白質(zhì)中氨基酸的組成,首先,必須將蛋白質(zhì)進行水解。水解的方法有酸性水解、離子交換水解、堿性水解及酶水解等。酸性水解法及離子交換水解法在調(diào)味品實際分析過程中使用較多。因為,在強堿性水解條件下,多數(shù)氨基酸能被分解,

25、因而堿性水解很少用;酶水解屬于一種選擇性的部分水解反應(yīng),可生成低聚肽類,使用亦受到限制。 對于調(diào)味品中的游離氨基酸,根據(jù)其易溶于水、難溶于有機溶劑的特性,可用下法進 行提取。 1.1　水提 對固體樣品,如粉末醬油,必要的話,要粉碎或磨細,用適量水浸泡,最好攪拌1～2h,過濾,殘渣再用適量水反復(fù)浸泡二次,過濾,合并水浸液,減壓濃縮至1mL(相當于1g樣品)。加二倍量甲醇或乙醇以沉淀除去蛋白質(zhì)、糖類等雜質(zhì)。過濾,將濾液減壓濃縮至小體積。通過強酸性或其它適當?shù)年栯x子交換樹脂,用1mol/L氫氧化鈉溶液或1～2mol/L氫氧化銨溶液洗脫,收集對茚三酮試劑呈陽性反應(yīng)的部分,

26、減壓濃縮至干,加少量水溶解,留待點樣用。 1.2　稀乙醇提 固體樣品要粉碎或磨細,加適量70%乙醇,加熱回流三次(或冷浸三次),每次1～ 2h,合并三次的乙醇提取液,減壓濃縮至小體積,最后應(yīng)無乙醇存在,然后如上通過離子 交換樹脂即得總氨基酸。 2　標準溶液與樣品溶液的制備 對于調(diào)味品中難溶于水的氨基酸,如胱氨酸、酪氨酸,須以0.1mol/L鹽酸作溶劑配制。如果應(yīng)用的標準溶液是鹽酸溶液,則樣品也必須溶于同樣的溶劑中。 對于調(diào)味品中易溶于水的氨基酸,不論配制單一的或多種的氨基酸標準溶液,均可用10%正丙醇作溶劑,制備成含每種氨基酸1mg/mL的標準溶液。氨基酸

27、標準溶液通常都是由多種氨基酸配成。此溶液在冰箱或室溫可保存2～4周。 測定多種氨基酸,通常的點樣量是0.5～2μL,亦即0.5～2μg氨基酸。欲使薄層上 各種氨基酸分離良好,斑點清晰,關(guān)鍵是要控制標準與樣品溶液的點樣量。濃度太高,不 僅會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,還會出現(xiàn)一個氨基酸斑點遮掩另一斑點的現(xiàn)象。含每種氨基酸各 0.5μg,點樣量為0.5μL的0.1mol/L鹽酸溶液被認為是薄層的適宜負荷量。

28、 天然樣品中各種氨基酸的含量是不一致的,同一樣品溶液,薄層的負荷量不同,呈現(xiàn) 的層析譜也會有差異。須防備含量較低的成份被失落,也要避免含量高的氨基酸斑點遮 掩其它斑點。 制備氨基酸有色衍生物進行薄層層析,不需顯色便可觀察到它們的層析行為。由于 操作復(fù)雜,實際上使用較少。 3　薄層層析[2] 分離調(diào)味品中的氨基酸及其衍生物的薄層一般不需活化,制得的薄層于室溫置空氣中 干燥過夜即可。氨基酸已在緩沖的或

29、非緩沖溶液的硅膠薄層上取得成功的層析結(jié)果。常 用的層析條件是:點樣0.5～2μg(含每種氨基酸),再于展開劑飽和的層析槽中(用展開劑潤 濕濾紙,環(huán)圍在層析槽內(nèi)壁)展開1～3h,展開距離10～15cm,顯色劑為水合茚三酮。 　 BrennerandNiederwieser曾測量過硅膠G薄層上丙氨酸等25種氨基酸的Rf值, 使用了下列六種溶劑系統(tǒng)(溶劑比例均為重量百分比): ①96%乙醇∶

30、水(63∶37); ②正丙醇∶水(64∶36); ③正丁醇∶醋酸∶水(60∶20∶20); ④酚∶水(75∶25)+20mg氰化鈉/100g溶劑; ⑤正丙醇∶34%氨溶液(67∶33); 　　　　　　　　　　　　 ⑥96%乙醇∶34%氨溶液(77∶23)。 MutschlerandRochelmeyer報告了賴氨酸等十三種常見氨基酸在磷酸鹽緩沖硅膠薄層(pH=6.8)上的Rf值,使用了以下三種溶劑系統(tǒng): ①70%乙醇水溶液; ②96%

31、乙醇∶25%氨溶液(4∶1); ③96%乙醇∶25%氨溶液∶水(7∶1∶2)。 前二組溶劑系統(tǒng)適用于作雙向展開。必須注意的是:在用氨性的溶劑系統(tǒng)展開后,要 將薄層放在100℃烘箱中加熱30min,驅(qū)盡氨后,才能噴水合茚三酮顯色。 Brener,Niederwieseretal.曾在硅膠薄層上,用雙向展開進行過色氨酸等氨基酸混合物層析條件與結(jié)果的系統(tǒng)研究,得出十分滿意的層析譜。他們使用的溶劑系統(tǒng)是:第一次展開,氯仿∶甲醇∶17%氨溶液(2∶2∶1);第二次展開用酚∶水(3∶1)。點樣量是含每種氨基酸0.5μg的混合氨基酸溶液。 MoffatandLy

32、tle推薦的顯色劑是由二種溶液組成:溶液Ⅰ∶50mL0.2%水合茚三酮在 無水乙醇中+10mL醋酸+2mL2,4,6三甲基吡啶。溶液Ⅱ∶1%硝酸銅(含三個結(jié)晶 水)在無水乙醇中。在薄板噴霧前,將溶液Ⅰ及溶液Ⅱ按50∶3的比例混合。薄板噴霧后,要保持100～110℃的溫度。氨基酸的呈色反應(yīng)是逐漸擴大并加深的,要留意觀察。當某些氨 基酸斑點開始呈色時,應(yīng)立即用筆尖作一記號,這樣可以在此斑點被后來逐步擴大并加深 的另外斑點遮掩時,也能被認出。斑點呈紅色。不同的氨基酸顯色的速度有差別。 Arx氏應(yīng)用雙向展開法在纖維素薄層上將羥脯氨酸、甘氨酸、賴氨酸、組氨酸、色氨酸

33、及亮氨酸完全分離開。他們用三塊纖維素薄層及四組溶劑系統(tǒng):這四組溶劑系統(tǒng)是: ①正丁醇∶丙酮∶二乙胺∶水(10∶10 ∶2∶5); ②異丙醇∶99%甲酸∶水(40∶2∶10) ③正丁醇∶丁酮∶雙環(huán)已基胺∶水(10∶10∶2∶5); ④酚∶水(75∶25)。層析槽要用3%氫氧化銨溶液飽和。 在三塊纖維素薄層上,都用六種氨基酸混合液點一個圓點,三塊薄層的第一向均用 溶劑系統(tǒng)①展開。此時六種氨基酸分成脯氨酸+甘氨酸+賴氨酸+組氨酸及色氨酸 +亮氨酸兩組。然后這三塊薄層分

34、別用溶劑系統(tǒng)②、③及④作第二項展開,這樣就可將 六種氨基酸完全分開。 4　常用的薄層及展開劑(見表1) 5　常用顯色劑 薄層層析法鑒別調(diào)味品中各種氨基酸所用的顯色劑有①茚三酮試劑;②吲哚醌試劑③1,2-萘醌-4-磺酸試劑(Folin);④8-羥基喹啉-次溴酸鈉試劑(Sakaguchi);⑤碘鉑酸試劑;⑥重氮化碘試劑;⑦2,3,5-三苯基H-四唑化氯試劑(TTC試劑);⑧重氮化對氨基苯磺酸試劑(Pauly);⑨藍光偶氮胺鹽試劑(重氮試劑);⑩對二甲氨基苯甲醛-鹽酸試劑(Ehrlich試劑);○11肉桂醛-鹽酸試劑。 6　定性[3]

35、 眾所周知,色譜法本身并不是一種好的定性技術(shù),其所能提供的定性信息惟有保留值。對薄層色譜來說,即Rf值。顯然,利用保留值定性,由于色譜分離能力的限制而只能是相對的,所以,薄層色譜定性一般總是利用保留值與化學(xué)反應(yīng)、選擇性檢測和聯(lián)用技術(shù)相結(jié)合進行。在這方面,薄層色譜具有更多靈活性。 6.1　利用保留值定性 在特定的色譜系統(tǒng)中,化合物的Rf值是一定的,比較未知物和標準物的Rf值,能夠鑒定 未知化合物。當然,Rf值的準確測定受到多方面因素的影響。利用相對Rf值,限Rx值進行比較,可以消除一部分因素,改善測定重現(xiàn)性。實踐中為了增加通過保留值定性的可靠性,必須改變色譜系統(tǒng)的選擇性,重復(fù)測定同

36、一化合 實驗四 粗脂肪的提取、定量及碘值測定（6課時） 一、實驗?zāi)康模? 1． 熟悉植物粗脂肪的經(jīng)典測定方法和組成成分。 2． 學(xué)習(xí)和掌握索氏提取器提取的原理和方法。 3． 學(xué)習(xí)和掌握用重量分析法對粗脂肪進行定量測定。 4． 掌握測定脂肪碘值的原理和操作方法。 5． 了解測定脂肪碘值的意義。 二、實驗原理： 脂肪廣泛存在于許多植物的種子和果實中，測定脂肪的含量，可以作為鑒別其品質(zhì)優(yōu)劣的一個指標。脂肪含量的測定有很多方法，如抽提法、酸水解法、比重法、折射法、電測和核磁共振法等。目前國內(nèi)外普遍采用抽提法，其中索氏抽提法（Soxhlet extractor method）是公認

37、的經(jīng)典方法。 本實驗采用索氏抽提法中的殘余法，即用低沸點有機溶劑（乙醚或石油醚）回流抽提，除去樣品中的粗脂肪，以樣品與殘渣重量之差，計算粗脂肪含量。由于有機溶劑的抽提物中除脂肪外，還或多或少含有游離脂肪酸、甾醇、磷脂、蠟及色素等類脂物質(zhì)，因而抽提法測定的結(jié)果只能是粗脂肪。 不飽和脂肪酸碳鏈上含有不飽和鍵，可與鹵素（Cl2，Br2，I2）進行加成反應(yīng)。不飽和鍵數(shù)目越多，加成的鹵素量也越多，通常以“碘值”表示。在一定條件下，每100g脂肪所吸收碘的克數(shù)稱為該脂肪的“碘值”。碘值越高，表明不飽和脂肪酸的含量越高，它是鑒定和鑒別油脂的一個重要常數(shù)。 碘與脂肪的加成反應(yīng)很慢，而氯及溴與脂肪

38、的加成反應(yīng)快，但常有取代和氧化等副反應(yīng)。本實驗使用IBr進行碘值的測定，這種試劑穩(wěn)定，測定的結(jié)果接近理論值。溴化碘(IBr)的一部分與油脂的不飽和脂肪酸起加成作用，剩余部分與碘化鉀作用放出碘，放出的碘用硫代硫酸鈉滴定。 三、實驗材料、主要儀器和試劑 1．實驗材料 油料作物種子、中速濾紙 2．儀器： （1）索氏脂肪抽提器（圖1）或YG-Ⅱ型油分測定器 （2）干燥器(直徑15～18cm，盛變色硅膠) （3）不銹鋼鑷子（長20cm）

39、 （4）培養(yǎng)皿 （5）分析天平（感量0.001g） （6）稱量瓶 （7）恒溫水浴

40、 （8）烘箱 （9）樣品篩（60目） （10）碘瓶（或帶玻璃塞的錐形瓶） （11）棕色、無色滴定管各1支 （12）吸量管 （13）量筒 3．試劑 （1）溴化碘溶液 取12.2g碘，放入1 500mL錐形瓶內(nèi)，緩慢加入1 000mL冰乙酸（99.5%），邊加邊

41、搖，同時略溫?zé)?，使碘溶解。冷卻后，加溴約3mL。 注意：所用冰乙酸不應(yīng)含有還原性物質(zhì)。檢查方法：取2mL冰乙酸，加少許重鉻酸鉀及硫酸，若呈綠色，則證明有還原性物質(zhì)存在。 （2）0.1mol/L標準硫代硫酸鈉溶液 取結(jié)晶硫代硫酸鈉50g，溶在經(jīng)煮沸后冷卻的蒸餾水（無CO2存在）中。添加硼砂7.6g或氫氧化鈉1.6g（硫代硫酸鈉溶液在pH 9～10時最穩(wěn)定）。稀釋到2 000mL后，用標準0.1mol/L碘酸鉀溶液按下法標定： 準確量取0.1mol/L碘酸鉀溶液20mL、10％碘化鉀溶液10mL和1mol/L硫酸20mL，混合均勻。以1％淀粉溶液作指示劑，用硫代硫酸鈉

42、溶液進行標定。按下面所列反應(yīng)式計算硫代硫酸鈉溶液濃度后，用水稀釋至0.1mol/L。 （3）純四氯化碳 （4）1％淀粉溶液（溶于飽和氯化鈉溶液中） （5）10％碘化鉀溶液 （6）花生油或豬油 （7）無水乙醚或低沸點石油醚（A.R.） 四、操作步驟 1．將濾紙切成8cm×8cm，疊成一邊不封口的紙包，用硬鉛筆編寫順序號，按順序排列在培養(yǎng)皿中。將盛有濾紙包的培養(yǎng)皿移入105±2℃烘箱中干燥2h，取出放入干燥器中，冷卻至室溫。按順序?qū)⒏鳛V紙包放人同一稱量瓶中稱重（記作a）、稱量時室內(nèi)相對濕度必須低于70％。 2．包裝和干燥 在上述已稱重的濾紙包

43、中裝入3g左右研細的樣品，封好包口，放入105±2℃的烘箱中干燥3h，移至干燥器中冷卻至室溫。按順序號依次放入稱量瓶中稱重（記作b）。 3．抽提 將裝有樣品的濾紙包用長鑷子放入抽提筒中，注入一次虹吸量的1.67倍的無水乙醚，使樣品包完全浸沒在乙醚中。連接好抽提器各部分，接通冷凝水水流，在恒溫水浴中進行抽提，調(diào)節(jié)水溫在70～80℃之間，使冷凝下滴的乙醚成連珠狀（120～150滴/min或回流7次/h以上），抽提至抽取筒內(nèi)的乙醚用濾紙點滴檢查無油跡為止（約需6～12h）。抽提完畢后，用長鑷子取出濾紙包，在通風(fēng)處使乙醚揮發(fā)（抽提室溫以12～25℃為宜）。提取瓶中的乙醚另行回收。 4．稱重 待

44、乙醚揮發(fā)之后，將濾紙包置于105±2℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷卻至恒重為止（記作c）。 5．準確稱取上述提取的油0.3～0.4g 2份，置于兩個干燥的碘瓶內(nèi)，切勿使油粘在瓶頸或壁上。加入10mL四氯化碳，輕輕搖動，使油全部溶解。用滴定管仔細地加入25mL溴化碘溶液，勿使溶液接觸瓶頸，塞好瓶塞，在玻璃塞與瓶口之間加數(shù)滴10％碘化鉀溶液封閉縫隙，以免碘的揮發(fā)損失。在20～30℃暗處放置30min，并不時輕輕搖動。油吸收的碘量不應(yīng)超過溴化碘溶液所含之碘量的一半，若瓶內(nèi)混合物的顏色很淺，表示油用量過多，改稱較少量的提取油，重作。 6．放置30min后，立刻小心地打開玻璃塞，使塞旁碘化鉀

45、溶液流入瓶內(nèi)，切勿丟失。用新配制的10％碘化鉀10 mL和蒸餾水50mL把玻璃塞和瓶頸上的液體沖洗入瓶內(nèi)，混勻。用0.1mol／L硫代硫酸鈉溶液迅速滴定至淺黃色。加入1％淀粉溶液約1mL，繼續(xù)滴定，將近終點時，用力振蕩，使碘由四氯化碳全部進入水溶液內(nèi)。再滴定至藍色消失為止，即達滴定終點。 另作2份空白對照，除不加油樣品外，其余操作同上。滴定后，將廢液倒入廢液缸內(nèi)，以便回收四氯化碳。計算碘值。 五、結(jié)果與計算 1．粗脂肪的含量： 粗脂肪含量（%）= b－c ×100 b－a 式中：a：稱量瓶加濾紙包重（g） b：稱量瓶加濾紙包和烘干樣重（g）

46、 c：稱量瓶加濾紙包和抽提后烘干殘渣重（g） 2．粗脂肪的碘值： 碘值= （A－B）×T×100 C 式中，A：滴定空白用去的Na2S2O3溶液的平均毫升數(shù) B：滴定碘化后樣品用去的Na2S2O3溶液的平均毫升數(shù) C：樣品的重量（g） T：1mL 0.1mol／L硫代硫酸鈉溶液相當?shù)牡獾目藬?shù) 六、附 注 （1）測定用樣品、抽提器、抽提用有機溶劑都需要進行脫水處理。這是因為：第一，抽提體系中有水，會使樣品中的水溶性物質(zhì)溶出，導(dǎo)致測定結(jié)果偏高；第二，抽提體系中有水，則抽提溶劑易被水飽和（尤其是乙醚，可飽和約2％的水），從而影響抽提效率；第三，樣品中有

47、水，抽提溶劑不易滲入細胞組織內(nèi)部，結(jié)果不易將脂肪抽提干凈。 （2）試樣粗細度要適宜。試樣粉末過粗，脂肪不易抽提干凈；試樣粉末過細，則有可能透過濾紙孔隙隨回流溶劑流失，影響測定結(jié)果。 （3）索氏抽提法測定脂肪最大的不足是耗時過長，如能將樣品先回流1～2次，然后浸泡在溶劑中過夜，次日再繼續(xù)抽提，則可明顯縮短抽提時間。 （4）YG-Ⅱ型油分測定器容量大，適合于樣品較多的選種鑒定工作使用，溫度控制在70℃左右，8h可提取完畢。 （5）必須十分注意乙醚的安全使用。抽提室內(nèi)嚴禁有明火存在或用明火加熱。乙醚中不得含有過氧化物，保持抽提室內(nèi)良好通風(fēng)，以防燃爆。乙醚中過氧化物的檢查方法是：取適量乙醚，加

48、入碘化鉀溶液，用力搖動，放置1min，若出現(xiàn)黃色則表明存在過氧化物，應(yīng)進行處理后方可使用。處理的方法是：將乙醚放入分液漏斗，先以1/5乙醚量的稀KOH溶液洗滌2～3次，以除去乙醇；然后用鹽酸酸化，加入1/5乙醚量的FeSO4或Na2SO3溶液，振搖，靜置，分層后棄去下層水溶液，以除去過氧化物；最后用水洗至中性，用無水CaCl2或無水Na2SO4脫水，并進行重蒸餾。 （6）碘瓶必須潔凈、干燥，否則油中含有水分，引起反應(yīng)不完全。 （7）加碘試劑后，如發(fā)現(xiàn)碘瓶中顏色變淺褐色時，表明試劑不夠，必須再添加10～15 mL試劑。 （8）如加入碘試劑后，液體變濁，這表明油脂在CCl4中

49、溶解不完全，可再加些CCl4。 （9）將近滴定終點時，用力振蕩是本滴定成敗的關(guān)鍵之一，否則容易滴加過頭或不足。如震蕩不夠，CCl4展會出現(xiàn)紫或紅色，此時應(yīng)用力振蕩，使碘進入水層。 （10）淀粉溶液不宜加得過早，否則滴定值偏高。 七、思考題 1．如何利用殘余法測定油料作物種子中的粗脂肪含量？ 2．測定過程中為什么需要對樣品、抽提器、抽提用有機溶劑都要進行脫水處理？ 3．在實驗過程中安全使用乙醚應(yīng)注意哪些問題？ 4．測定樣品粒子粗細有什么要求？ 5．測定碘值有何意義？液體油和固體脂碘值間有何區(qū)別？ 6．滴定過程中，淀粉溶液為何不能過早加入？ 7．滴定完畢放置一些時間后，溶液

50、應(yīng)返回藍色，否則表示滴定過量，為什么? 參考答案 1．殘余法測定油料作物種子中的粗脂肪含量，是用低沸點有機溶劑（乙醚或石油醚）回流抽提，除去樣品中的粗脂肪，以樣品與殘渣重量之差，來計算粗脂肪含量。 2．進行脫水處理的原因有三：第一，抽提體系中有水，會使樣品中的水溶性物質(zhì)溶出，導(dǎo)致測定結(jié)果偏高；第二，抽提體系中有水，則抽提溶劑易被水飽和（尤其是乙醚，可飽和約2％的水），從而影響抽提效率；第三，樣品中有水，抽提溶劑不易滲入細胞組織內(nèi)部，結(jié)果不易將脂肪抽提干凈。 3．抽提室內(nèi)嚴禁有明火存在或用明火加熱。乙醚中不得含有過氧化物，保持抽提室內(nèi)良好通風(fēng)，以防燃爆。 4．試樣粗細度要適宜。試樣粉末

51、過粗，脂肪不易抽提干凈；試樣粉末過細，則有可能透過濾紙孔隙隨回流溶劑流失，影響測定結(jié)果。 5．不飽和脂肪酸碳鏈上含有不飽和鍵，可與鹵素（Cl2，Br2，I2）進行加成反應(yīng)．不飽和鍵數(shù)目越多，加成的鹵素量也越多，通常以“碘值”表示。在一定條件下，每100g脂肪所吸收碘的克數(shù)稱為該脂肪的“碘值”。碘值越高，表明不飽和脂肪酸的含量越高，它是鑒定和鑒別油脂的一個重要常數(shù)。因此，液體油的碘值應(yīng)高于固體脂的碘值。 6．淀粉溶液不宜加得過早，否則大量的I2與淀粉結(jié)合成藍色物質(zhì)，這一部分碘就不容易與NaS2O3反應(yīng)，由碘值計算公式可知，B值減小，因而使滴定值偏高。 7．這是由于空氣氧化I-所引起的。如果

52、溶液未變藍，說明I-被空氣氧化成I2后，繼續(xù)與Na2S2O3發(fā)生反應(yīng)，而不與淀粉反應(yīng)生成藍色，即Na2S2O3過量。 實驗五 　從牛奶中分離奶油、酪蛋白和乳糖（8） 牛奶的化學(xué)成分很復(fù)雜，至少有100多種，主要成分由水、脂肪、磷脂、蛋白質(zhì)、乳糖、無機鹽等組成。一般牛奶的主要化學(xué)成分含量為： 　　水分：87.5% 脂肪：3.5% 蛋白質(zhì)：3.4% 　　乳糖：4.6% 無機鹽：0.7% 組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸有20種，其中有8種是人體本身不能合成的，這些氨基酸稱為必需氨基酸。我們進食的蛋白質(zhì)中如果包含了所有的必需氨基酸，這種蛋白質(zhì)便叫作全蛋白。牛奶中的蛋白質(zhì)便是全蛋白

53、。 牛奶中的無機鹽也稱礦物質(zhì)。牛奶中含有Ca2+、Mg2+、K+、Fe3+等陽離子和PO43-、SO42-、Cl-等陰離子；此外還有微量元素I、Cu、Zn、Mn等。這些元素絕大部分都對人體發(fā)育生長和代謝調(diào)節(jié)起著重要作用。鈣是人體中含量最高的無機鹽，是構(gòu)成骨骼和牙齒的主要成分。人體中90%的鈣集中在牙齒和骨骼上。兒童、青少年生長發(fā)育需要充足的鈣，同樣孕婦及成人、中老年人，也需要補充鈣質(zhì)，缺乏鈣會影響牙齒和骨骼的正常發(fā)育，導(dǎo)致佝僂病。大自然中的鈣是以化合態(tài)存在的，只有被動、植物吸收后形成具有生物活性的鈣，才能更好地被人體所吸收利用。牛奶中含有豐富的活性鈣，是人類最好的鈣源之一，1升新鮮牛奶所含活

54、性鈣約1250毫克，居眾多食物之首，約是大米的101倍、瘦牛肉的75倍、瘦豬肉的110倍，它不但含量高，而且牛奶中的乳糖能促進人體腸壁對鈣的吸收，吸收率高達98%，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣的代謝，維持血清鈣濃度，增進骨骼的鈣化。吸收好對于補鈣是尤其關(guān)鍵的。故"牛奶能補鈣"這一說法是有其科學(xué)道理的。 一、實驗?zāi)康? 1．從牛乳中提取奶油、酪蛋白及乳糖。 2．對酪蛋白進行純化。 3．掌握考馬斯亮藍法測定含量 4．掌握SDS-PAGE法測定酪蛋白分子量。 二、實驗原理 牛奶含有半乳糖、蛋白質(zhì)、脂肪成份。蛋白質(zhì)主要是酪蛋白，含量約為35g/l。酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸鈣-磷酸鈣復(fù)合體膠粒存在，膠

55、粒直徑約為20～800納米，平均為100納米。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白會沉淀，加工后可制得干酪或干酪素。本實驗利用加酸，當達到酪蛋白等電點PH=4.7時，酪蛋白沉淀。再通過離心而獲得的沉淀即為酪蛋白，沉淀物中所含的脂肪通過有機溶劑抽提而去除，最終得到純白色、晶狀酪蛋白。剩下的液體為乳清，在乳清中含有乳白蛋白和乳球蛋白，還有溶解狀態(tài)的乳糖，乳清中糖類的99.8%以上是乳糖，可通過濃縮、結(jié)晶制取乳糖。 考馬斯亮藍G-250（Coomassie brilliant blue G-250）測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當它與蛋白

56、質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌鞍踪|(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G-250結(jié)合在2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質(zhì)含量，測定蛋白質(zhì)濃度范圍為0～1 000μg／mL，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法。 三、實驗材料、主要儀器和試劑 　　1． 實驗材料 牛奶、200目的尼龍布 2．主要儀器：離心機、、離心管、水浴鍋、pH計

57、、具塞試管、試管架、燒杯、量筒、微量取樣器、分光光度計 3．試劑：0.2 mol/L HAc-Na buffer、95%乙醇、乙醚、 ?。?）牛血清白蛋白標準溶液的配制：準確稱取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸餾水中，即為1 000μg／mL的原液。 （2）蛋白試劑考馬斯亮藍G-250的配制：稱取100mg考馬斯亮藍G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸餾水定容到1 000mL。此溶液在常溫下可放置一個月。 （3）乙醇 （4）磷酸（85％） 　　　　 四、操作方法 1．奶油的制備

58、： 牛奶中的脂肪含量在3．4％～3．8％之間，以極微小微明的小球懸浮于乳的液體內(nèi)，由于比重小，一般都聚集在奶的表層。 （1）從牛奶中分離生奶油：取80ml鮮奶，離心后取出上層奶油。奶油放入冰箱。 （2）24小時后從冰箱中取出奶油，攪打觀察其變化并記錄。 2．酪蛋白的制備： （1）取加熱到40℃脫脂牛奶10mL，倒人50ml離心管中，在攪拌下慢慢加入預(yù)熱到40℃、PH4．6的o．2mo1／L乙酸—乙酸鈉緩沖液10mL、用pH試紙或酸度計檢驗，混合物的最后PH應(yīng)是4．7。 （2）將上述懸浮液冷卻至室溫，離心5min(5000r／min)。棄去上清液，得酯蛋白粗制品(沉淀

59、物)。 （3）純化： 用水洗沉淀2次；向沉淀中加入20ml左右的水(用玻棒將沉淀充分打碎)，離心5min(5000r／min)，棄去上清液。 用乙醇、無水乙醚洗滌沉淀：在沉淀中加入20mL 95％乙醇，攪拌片刻(盡可能充分地把沉淀塊狀打碎)，將全部懸蝕濃轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中抽濾。用無水乙醇—無水乙醚混合液（等體積）洗沉淀2次，抽干。最后用無水乙醚洗沉淀2次，抽干。 (4)將沉淀攤開在表面皿上，風(fēng)干，得酪蛋白純品。 3. 從牛奶中分離乳糖 牛奶中的乳糖含量為4．5％，是乳中的特有產(chǎn)物。 （1）在除去酪蛋白的乳清中，加入1.5g CaCO3粉末，攪拌均勻后加熱至沸。加CaCO3的

60、目的一方面是中和溶液的酸性，防止加熱時乳糖水解，另方面又能使乳白蛋白沉淀。 （2）過濾除去沉淀，在濾液中加入1～2粒沸石，加熱濃縮至3～5ml，加入10ml 95%乙醇（注意離開火焰）和少量活性炭，攪拌均勻后在水浴上加熱至沸騰，趁熱過濾，濾液必須澄清。 （3）加塞放置過夜，乳糖結(jié)晶析出，抽濾，用95%乙醇洗滌產(chǎn)品。 （4） 乳糖成脎試驗 取自制乳糖溶于少量水中，濃度約為5%，在試管中加入1ml乳糖溶液，1ml苯肼試劑，搖勻，試管口用棉花塞住，在沸水浴中加熱，并不時振搖，加熱10～15分鐘后，取出放置冷卻，乳糖脎成結(jié)晶析出。取少量乳糖脎在顯微鏡下觀察其結(jié)晶形態(tài)，可證實為乳糖。 ①苯阱試

61、劑有毒，小心使用，勿觸及皮膚，如觸及皮膚先用稀醋酸洗，再用水洗。（選做） ?。?）旋光法測定含量（選做） 見資料中nunai 4．計算酪蛋白的質(zhì)量濃度和得率 準確稱量從牛奶中分離出的酷蛋白純品。 (1)計算酪蛋白實際的質(zhì)量濃度 實際質(zhì)量濃度以1L，牛奶中酪蛋白的質(zhì)量(g)表示。 (2)計算得率 酪蛋白得率／％＝酪蛋白實際的質(zhì)量濃度/酪蛋白的理論質(zhì)量濃度×100 式中：牛奶中酪蛋白的理論質(zhì)量濃度為35g/L 5．酪蛋白純度測定 考馬斯亮藍法 1．標準曲線制作 （1）0~100μg／mL標準曲線的制作：取6支10mL干凈的具塞

62、試管，按表1取樣。蓋塞后，將各試管中溶液縱向倒轉(zhuǎn)混合，放置2min后用1cm光經(jīng)的比色杯在595nm波長下比色，記錄各管測定的光密度OD595nm，并做標準曲線。 表1 低濃度標準曲線制作 管 號 1 2 3 4 5 6 1 000μg／mL標準蛋白液（mL） 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 蒸餾水（mL） 1.00 0.98 0.96 0.94 0.92 0.90 考馬斯亮藍G-250試劑（mL） 5 5 5 5 5 5 蛋白質(zhì)含量（μg） 0 20 40 60 80 100 OD595

63、nm ? ? ? ? ? ? （2）0~1 000μg／mL標準曲線的制作：另取6支10mL具塞試管，按表2取樣。其余步驟同（1）操作，做出蛋白質(zhì)濃度為0~1 000μg／mL的標準曲線。 表2 高濃度標準曲線制作 管 號 7 8 9 10 11 12 1 000μg／mL標準蛋白液（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸餾水（mL） 1.00 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考馬斯亮藍G-250試劑（mL） 5 5 5 5 5 5 蛋白質(zhì)含量（μg） 0 200 400 600

64、800 1 000 OD595nm ? ? ? ? ? ? 2．樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測定 （1）待測樣品制備：稱取新鮮綠豆芽下胚軸2g放入研缽中，加2mL蒸餾水研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到離心管中，再用6mL蒸餾水分次洗滌研缽，洗滌液收集于同一離心管中，放置0.5~1h以充分提取，然后在4 000r/min離心20min，棄去沉淀，上清液轉(zhuǎn)入10mL容量瓶，并以蒸餾水定容至刻度，即得待測樣品提取液。 （2）測定：另取2支10mL具塞試管，按下表取樣。吸取提取液0.1mL（做一重復(fù)），放入具塞刻度試管中，加入5mL考馬斯亮藍G-250蛋白試劑，充分混合，放置2min后用1cm光徑

65、比色杯在595nm下比色，記錄光密度OD595nm，并通過標準曲線查得待測樣品提取液中蛋白質(zhì)的含量X（μg）。以標準曲線1號試管做空白。 表3 待測液蛋白質(zhì)濃度測定 管 號 13 14 蛋白質(zhì)待測樣品提取液（mL） 0.1 0.9 5 ? ? 0.1 0.9 5 ? ? 蒸餾水（mL） 考馬斯亮藍G-250試劑（mL） OD595nm 蛋白質(zhì)含量（μg） 6. SDS-PAGE測定酪蛋白分子量 見課件SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）測定蛋白質(zhì)分子量 五、結(jié)果計算 ? X× 提取液總體積（mL） 樣品蛋白質(zhì)含量（μg / g鮮

66、重）= 測定時取樣體積（mL） 樣品鮮重（g） 式中：X為在標準曲線上查得的蛋白質(zhì)含量（μg）。 六、注意事項 1、牛奶與緩沖液要預(yù)熱 2、緩沖液要緩加緩攪 3、在濾紙上樣品的脫脂過程要攪動，不得攪破濾紙 4、實驗環(huán)境要保持空氣流通，門窗要開 　　5、酪蛋白等電點隨溫度不同而變化,等電點pH為4.6～4.8。分離酪蛋白時,邊加醋酸邊攪拌,邊測pH,同時觀察沉淀。開始快攪拌,接近等電點時,應(yīng)慢攪拌。 　　6、酪蛋白沉淀用200目的尼龍布過濾比較好,同時進行抽濾。用濾紙很難過濾;而用紗布過濾,酪蛋白容易粘在其上。 　7、用乙醇和乙醚清洗酪蛋白沉淀時,應(yīng)將酪蛋白搗碎,并在溶劑中攪拌、浸泡,充分洗凈脂肪。純凈的酪蛋白應(yīng)為白色,若發(fā)黃表明脂肪未洗干凈。 七、思考題 1.在酪蛋白制備時為什么要用醋酸緩沖液調(diào)pH到4.8？ 2.乙醚、乙醇作用是什么？ 實驗六 茶籽油、皂素及蛋白制備及測定（8課時） 一、實驗?zāi)康? 1．從茶籽中提取茶油、茶籽蛋白及茶皂素 2．對茶籽蛋白進行純化。 3．掌握考馬斯亮藍法測定含量 4． 掌握SDS-PAGE法測定