《生物化學實驗》word版

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1、 〔Ⅰ〕 理論部分 1. 緒論 歡迎同學們到生物化學實驗室來！對于大多數(shù)學生來說，這不是第一次做化學實驗，但是我們相信，生物化學實驗一定是大家最感興趣、最激動人心的實驗，當然也是花費最大、最辛苦的實驗。同學們在過去幾年中所學到的各種實驗技術(shù)和操作技能，在這些實驗中將會經(jīng)常用到，當然更重要的是要學會一些新的、在生物化學的科學研究中最常用的實驗方法。同學們在生物化學實驗方面要取得好成績，在很大程度上，取決于你們對這些專門化實驗技術(shù)的熟練掌握和對生物化學原理的深入了解。 當同學們進行實驗時，無疑將會與以前做的各種實驗進行比較。在生物

2、化學實驗中，大家會發(fā)現(xiàn)，極少有像無機化學和有機化學實驗那樣進行化學反應(yīng)和分離出“克”數(shù)量級的產(chǎn)物。同學們將進行的是“毫克”和“微克”數(shù)量級的研究，并且在多數(shù)情況下，生物分子是溶解在溶液中的，而且往往看不到所研究的物質(zhì)，但是將會看到動態(tài)的生物化學過程和由生物分子引起的生物化學變化。實驗中所用到的各種技術(shù)和方法，將起到“眼睛”的作用，用以對各種生物化學過程進行監(jiān)測。 同學們通過生物化學實驗應(yīng)該做到： ⑴ 學習設(shè)計一個實驗的基本思路，掌握各個實驗的基本原理，學會嚴密地組織自己的實驗，合理地安排實驗步驟和時間。 ⑵ 訓練實驗的動手能力，學會熟練地使用各種生物化學實驗儀器，包括各種天平、各種分光光

3、度計、各種離心機、自動部分收集器、恒流泵、核酸蛋白檢測儀、冰凍干燥機、酸度計、電導率儀、高速分散器、各種電泳裝置和搖床等等。 ⑶ 學會準確翔實地記錄實驗現(xiàn)象和數(shù)據(jù)的技能，提高實驗報告的寫作能力，能夠整齊清潔地進行所有的實驗，培養(yǎng)嚴謹細致的科學作風。 ⑷ 掌握生物化學的各種基本實驗方法和實驗技術(shù)，尤其是各種電泳技術(shù)和層析枝術(shù)，為今后參加科研工作打下堅實的基礎(chǔ)。 預祝同學們以優(yōu)異的成績跨進這一新的科學殿堂，成為攀登生物科學高峰的新的勇士！ 1.1 生物化學實驗技術(shù)發(fā)展簡史 生物科學在20世紀有驚人的發(fā)展，其中生物化學與分子生物學的進展尤為迅速，這樣一門最具活力和生

4、氣的實驗科學，在21世紀必將成為帶頭的學科，這主要有賴于生物化學與分子生物學實驗技術(shù)的不斷發(fā)展和完善。這里我們簡單回顧一下生物化學實驗技術(shù)的發(fā)展歷史。 20年代： 微量分析技術(shù)導致了維生素、激素和輔酶等的發(fā)現(xiàn)。瑞典著名的化學家T.Svedberg奠基了“超離心技術(shù)”，1924年制成了第一臺5000×g（5000 r/min～8000 r/min）相對離心力的超離心機(相對離心力“RCF”的單位可表示為“×g”)，開創(chuàng)了生化物質(zhì)離心分離的先河，并準確測定了血紅蛋白等復雜蛋白質(zhì)的分子量，獲得了1926年的諾貝爾化學獎。 30年代： 電子顯微鏡技術(shù)打開了微觀世界，使我們能夠看到細

5、胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和生物大分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。 40年代： 層析技術(shù)大發(fā)展，兩位英國科學家Martin和Synge發(fā)明了分配色譜（層析），他們獲得了1952年的諾貝爾化學獎。由此，層析技術(shù)成為分離生化物質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)。 “電泳技術(shù)”是由瑞典的著名科學家Tisellius所奠基，從而開創(chuàng)了電泳技術(shù)的新時代，他因此獲得了1948年的諾貝爾化學獎。 50年代： 自1935年Schoenheimer和Rittenberg首次將放射性同位素示蹤用于碳水化合物及類脂物質(zhì)的中間代謝的研究以后，“放射性同位素示蹤技術(shù)”在50年代有了大的發(fā)展，為各種生物化學代謝過程的闡明起了決定性的作用。

6、 60年代： 各種儀器分析方法用于生物化學研究，取得了很大的發(fā)展，如HPLC技術(shù)、紅外、紫外、圓二色等光譜技術(shù)、NMR核磁共振技術(shù)等。自1958年Stem，Moore和Spackman設(shè)計出氨基酸自動分析儀，大大加快了蛋白質(zhì)的分析工作。1967年Edman和Begg制成了多肽氨基酸序列分析儀，到1973年Moore和Stein設(shè)計出氨基酸序列自動測定儀，又大大加快了對多肽一級結(jié)構(gòu)的測定，十多年間氨基酸的自動測定工作得到了很大的發(fā)展和完善。 1962年，美國科學家Watson和英國科學家Crick因為在1953年提出的DNA分子反向平行雙螺旋模型而與英國科學家Wilkins分享了當

7、年的諾貝爾生理醫(yī)學獎，后者通過對DNA分子的X-射線衍射研究證實了Watson和Crick的DNA模型，他們的研究成果開創(chuàng)了生物科學的歷史新紀元。在X-射線衍射技術(shù)方面，英國物理學家Perutz對血紅蛋白的結(jié)構(gòu)進行X-射線結(jié)構(gòu)分析, Kendrew測定了肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)，成為研究生物大分子空間立體結(jié)構(gòu)的先驅(qū)，他們同獲1962年諾貝爾化學獎。 此外，在60年代，層析和電泳技術(shù)又有了重大的進展，在1968—1972年Anfinsen創(chuàng)建了親和層析技術(shù)，開辟了層析技術(shù)的新領(lǐng)域。1969年Weber應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)測定了蛋白質(zhì)的分子量，使電泳技術(shù)取得了重大進展。 7

8、0年代： 基因工程技術(shù)取得了突破性的進展，Arber，Smith和Nathans三個小組發(fā)現(xiàn)并純化了限制性內(nèi)切酶，1972年，美國斯坦福大學的Berg等人首次用限制性內(nèi)切酶切割了DNA分子，并實現(xiàn)了DNA分子的重組。1973年，又由美國斯坦福大學的Cohen等人第一次完成了DNA重組體的轉(zhuǎn)化技術(shù)，這一年被定為基因工程的誕生年，Cohen成為基因工程的創(chuàng)始人，從此，生物化學進入了一個新的大發(fā)展時期。與此同時，各種儀器分析手段進一步發(fā)展，制成了DNA序列測定儀、DNA合成儀等。 80至90年代： 基因工程技術(shù)進入輝煌發(fā)展的時期，1980年，英國劍橋大學的生物化學家Sanger和美國哈佛大

9、學的Gilbert分別設(shè)計出兩種測定DNA分子內(nèi)核苷酸序列的方法，而與Berg共獲諾貝爾化學獎，從此，DNA序列分析法成為生物化學與分子生物學最重要的研究手段之一。他們3人在DNA重組和RNA結(jié)構(gòu)研究方面都作出了杰出的貢獻。 1981年由Jorgenson和Lukacs首先提出的高效毛細管電泳技術(shù)（HPCE），由于其高效、快速、經(jīng)濟，尤其適用于生物大分子的分析，因此受到生命科學、醫(yī)學和化學等學科的科學工作者的極大重視，發(fā)展極為迅速，是生化實驗技術(shù)和儀器分析領(lǐng)域的重大突破，意義深遠?，F(xiàn)今，由于HPCE技術(shù)的異軍突起，HPLC技術(shù)的發(fā)展重點己轉(zhuǎn)到制備和下游技術(shù)。 1984年

10、德國科學家Kohler、美國科學家Milstein和丹麥科學家Jerne由于發(fā)展了單克隆抗體技術(shù)，完善了極微量蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)而共享了諾貝爾生理醫(yī)學獎。 1985年美國加利福尼亞州Cetus公司的Mullis等發(fā)明了PCR技術(shù)（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈式反應(yīng)的DNA擴增技術(shù)，對于生物化學和分子生物學的研究工作具有劃時代的意義，因而與第一個設(shè)計基因定點突變的Smith共享1993年的諾貝爾化學獎。 除上述歷史以外，還可以列出許多生物化學發(fā)展史上的重要成就，例如： 美國哈佛大學的Folin教授和中國的吳憲教授對生物化學常用的各種

11、分析方法（血糖分析、蛋白質(zhì)含量分析、氨基酸測定等）的建立作出了歷史性的貢獻。 美國化學家Pauling確認氫鍵在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中以及生物大分子間相互作用的重要性等，他獲得了諾貝爾化學獎。 英藉德裔生物化學家Krebs，在1937年發(fā)現(xiàn)了三羧酸循環(huán)，對細胞代謝及分子生物學的研究作出了重要貢獻，他與美藉德裔生物化學家Lipmann共獲1953年諾貝爾生理醫(yī)學獎。 英國生物化學家Sanger還于1953年確定了牛胰島素中氨基酸的精確順序而獲得1958年的諾貝爾化學獎。 1959年，美藉西班牙裔科學家Uchoa發(fā)現(xiàn)了細菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了將基因內(nèi)的遺

12、傳信息通過RNA中間體翻譯成蛋白質(zhì)的過程。他和Kornberg分享了當年的諾貝爾生理醫(yī)學獎，而后者的主要貢獻在于實現(xiàn)了DNA分子在細菌細胞和試管內(nèi)的復制。 美國生物化學家Nirenberg在破譯遺傳密碼方面作出了重要貢獻，Holly闡明了酵母丙氨酸t(yī)RNA的核苷酸排列順序，后來證明所有tRNA的結(jié)構(gòu)均相似。美藉印度裔生物化學家Khorana曾合成了精確結(jié)構(gòu)的己知核酸分子，并首次人工制成酵母基因。他們3人共獲1969年諾貝爾生理醫(yī)學獎。 法國生物學家Lwoff、JAcob和生物化學家Monod由于在病毒DNA和mRNA等方面出色的大量研究工作而共獲1965年諾貝爾生理醫(yī)學獎。

13、 1988年，美國遺傳學家McClintock由于在二十世紀五十年代提出并發(fā)現(xiàn)了可移動的遺傳因子而獲得諾貝爾生理醫(yī)學獎。 1989年，美國科學家Altman和Cech由于發(fā)現(xiàn)某些RNA具有酶的功能（稱為核酶）而共享諾貝爾化學獎。 1993年，美國科學家Roberts和Sharp由于在斷裂基因方面的工作而榮獲諾貝爾生理醫(yī)學獎。 1994年，美國科學家Gilman和Rodbell由于發(fā)現(xiàn)了G蛋白在細胞內(nèi)信息傳導中的作用而分享諾貝爾生理醫(yī)學獎。 1995年，美國科學家Lewis、德國科學家Nusslein-Volhard和美國科學家Wieschaus

14、由于在20世紀40～70年代先后獨立鑒定了控制果蠅體節(jié)發(fā)育基因而共享諾貝爾生理醫(yī)學獎。 我國生物化學界的先驅(qū)吳憲教授在20年代初由美回國后，在協(xié)和醫(yī)科大學生化系與汪猷、張昌穎等人一道完成了蛋白質(zhì)變性理論、血液生化檢測和免疫化學等一系列有重大影響的研究。1965年我國化學和生物化學家用化學方法在世界上首次人工合成了具有生物活性的結(jié)晶牛胰島素，1983年又通過大協(xié)作完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸的人工合成。近年來，在酶學研究、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及生物膜的結(jié)構(gòu)與功能等方面都有舉世矚目的研究成果。 由近百年來生物化學及其實驗技術(shù)的發(fā)展史可以看出，該學科的發(fā)展與實驗技術(shù)的發(fā)展密切相關(guān)，每一種新

15、的生化物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)與研究都離不開實驗技術(shù)，實驗技術(shù)每一次新的發(fā)明都大大推動了生物化學研究的進展，因而對于每一位現(xiàn)代生物科學工作者，尤其是生物化學工作者，學習并掌握各種生物化學實驗技術(shù)就是極為重要的。 1.2 實驗室規(guī)則 ⑴ 實驗前必須認真預習實驗內(nèi)容，明確本次實驗的目的和要求，掌握實驗原理，寫好實驗預習報告，否則，不能進行實驗。 ⑵ 實驗時自覺遵守實驗室紀律，保持室內(nèi)安靜，不大聲說笑和喧嘩。 ⑶ 實驗過程中要聽從教師指導，認真按照實驗步驟和操作規(guī)程進行實驗。若想改進和設(shè)計新的實驗方法，必須取得教師的同意。實驗時認真進行實驗記錄，實驗完畢及時整理數(shù)據(jù)，按時上交實

16、驗報告。 ⑷ 實驗臺面、稱量臺、藥品架、水池以及各種實驗儀器內(nèi)外都必須保持清潔整齊，藥品稱完后立即蓋好瓶蓋放回藥品架，嚴禁瓶蓋及藥勺混雜，切勿使藥品（尤其是NaOH）灑落在天平和實驗臺面上，毛刷用后必須立即掛好，各種器皿不得丟棄在水池內(nèi)。 ⑸ 配制試劑和用無離子水要注意節(jié)省，按實驗實際使用量配制，多余的重要試劑和各種有機試劑要按教師要求進行回收，昂貴的Sephadex、Sepharose凝膠和DEAE纖維素等，用后必須及時回收，不得丟棄。 ⑹ 配制的試劑和實驗過程中的樣品，尤其是保存在冰箱和冷室中的樣品，必須貼上標簽、寫上品名、濃度、姓名和日期等，放在冰箱中的易揮

17、發(fā)溶液和酸性溶液，必須嚴密封口。 ⑺ 配制和使用洗液必須極為小心，強酸強堿必須倒入廢液缶或沖稀后排放。電泳后的凝膠和各種廢物不得倒入水池，只能倒入廢物桶。 ⑻ 使用貴重精密儀器應(yīng)嚴格遵守操作規(guī)程。使用分光光度計時不得將溶液灑在儀器內(nèi)外和地面上。使用高速冷凍離心機和ＨＰＬＣ等大型儀器必須經(jīng)過考核。儀器發(fā)生故障應(yīng)立即報告教師，未經(jīng)許可不得自己隨意檢修。 ⑼ 實驗室內(nèi)嚴禁吸煙、飲水和進食， 嚴禁用嘴吸移液管和虹吸管。易燃液體不得接近明火和電爐，凡產(chǎn)生煙霧、有害氣體和不良氣味的實驗，均應(yīng)在通風條件下進行。 ⑽ 實驗完畢必須及時洗凈并放好各種玻璃儀器，插好自動部分

18、收集器上的試管，保持實驗臺面和實驗柜內(nèi)的整潔。 ⑾ 每組的儀器和玻璃器皿要用油漆編號，嚴禁抄拿他組儀器，不得將器皿遺棄在分光光度計內(nèi)和其他實驗臺面上，打破了玻璃儀器要及時向教師報告，并自覺登記，學期結(jié)束時按規(guī)定進行處理。 ⑿ 每位學生要熟悉實驗室內(nèi)電閘的位置，烘箱和電爐用畢必須立即斷電，不得過夜使用， 要嚴格遵守實驗室安全用電規(guī)則和其他安全規(guī)則。 ⒀ 每日實驗完畢，值日生要認真做好實驗室的衛(wèi)生值日工作。最后離開實驗室的實驗人員，必須檢查并關(guān)好水、電、門、窗。 1.3 實驗室安全及防護知識 在生化實驗室中可以說是“五毒”俱全，即著火、爆炸、中毒、觸電

19、和割傷的危險均時刻存在。因此每一位在生化實驗室工作的人員都必須有充分的安全意識，嚴格的防范措施和豐富實用的防護救治知識，一旦發(fā)生意外能正確地進行處置，以防事故進一步擴大。 著火 生化實驗室經(jīng)常使用大量的有機溶劑，如甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等，而實驗室又經(jīng)常使用電爐等火源，因此極易發(fā)生著火事故。常用有機溶劑的易燃性列表如下： 表1—1 常見有機液體的易燃性 名 稱 沸 點/℃ 閃 點※/℃ 自燃點※※/℃ 乙 醚 34.5 －4

20、0 180 丙 酮 56 －17 538 二硫化碳 46 －30 100 苯 80 －11 乙醇（95％） 78 12 400 ※ 閃點：液體表面的蒸汽和空氣的混合物在遇明火或火花時著火的最低溫度。 ※※

21、自燃點：液體蒸汽在空氣中自燃時的溫度。 由上表可以看出：乙醚、二硫化碳、丙酮、和苯的閃點都很低，因此不得存于可能會產(chǎn)生電火花的普通冰箱內(nèi)。低閃點液體的蒸汽只需接觸紅熱物體的表面便會著火，其中二硫化碳尤其危險。 預防火災必須嚴格遵守以下操作規(guī)程： ⑴嚴禁在開口容器和密閉體系中用明火加熱有機溶劑，只能使用加熱套或水浴加熱。 ⑵廢有機溶劑不得倒入廢物桶，只能倒入回收瓶，以后再集中處理。量少時用水稀釋后排入下水道。 ⑶不得在烘箱內(nèi)存放、干燥、烘焙有機物。 ⑷在有明火的實驗臺面上不允許放置開口的有機溶劑或傾倒有機溶劑。 滅火方法：

22、 實驗室中一旦發(fā)生火災切不可驚慌失措，要保持鎮(zhèn)靜，根據(jù)具體情況正確地進行滅火或立即報火警（火警電話119）。 ⑴容器中的易燃物著火時，用滅火毯蓋滅。因己確證石棉有致癌性，故改用玻璃纖維布作滅火毯。 ⑵乙醇、丙酮等可溶于水的有機溶劑著火時可以用水滅火。汽油、乙醚、甲苯等有機溶劑著火時不能用水，只能用滅火毯和砂土蓋滅。 ⑶導線、電器和儀器著火時不能用水和二氧化碳滅火器滅火，應(yīng)先切斷電源，然后用1211滅火器（內(nèi)裝二氟一氯一溴甲烷）滅火。 ⑷個人衣服著火時，切勿慌張奔跑，以免風助火勢，應(yīng)迅速脫衣，用水龍頭澆水滅火，火勢過大時可就地臥倒打滾壓滅火焰。 爆

23、炸 生物化學實驗室防止爆炸事故是極為重要的，因為一旦爆炸其毀壞力極大，后果將十分嚴重。生物化學實驗室常用的易燃物蒸汽在空氣中的爆炸極限（體積％）見 表1—2。 加熱時會發(fā)生爆炸的混合物有：有機化合物～氧化銅、 濃硫酸～高錳酸鉀、 三氯甲烷～丙酮等。 常見的引起爆炸事故的原因有：①隨意混合化學藥品，并使其受熱、受摩擦和撞擊。 ②在密閉的體系中進行蒸餾、回流等加熱操作。 ③在加壓或減壓實驗中使用了不耐壓的玻璃儀器 ，或反應(yīng)過于激烈而失去控制。 ④易燃易爆氣體大量逸入室內(nèi)。 ⑤高壓氣瓶減壓伐摔壞或失靈。

24、 表1—2 易燃物質(zhì)蒸汽在空氣中的爆炸極限 名 稱 爆炸極限（體積百分數(shù)） 名 稱 爆炸極限（體積百分數(shù)） 乙醚 1.9～36.5 丙酮 2.6～13 甲醇 6.7～36.5 乙醇 3.3～19 氫氣 4.1～74.2 乙炔 3.0～82 1.3.3 中毒 生化實驗室常見的化學致癌物有：石棉、

25、砷化物、鉻酸鹽、溴乙錠等。 劇毒物有：氰化物、砷化物、乙腈 、甲醇、氯化氫、汞及其化合物等。 中毒的原因主要是由于不慎吸入、誤食或由皮膚滲入。 中毒的預防： ①保護好眼睛最重要，使用有毒或有剌激性氣體時，必須配戴防護眼鏡，并應(yīng)在通風櫥內(nèi)進行。 ②取用毒品時必須配戴橡皮手套。 ③嚴禁用咀吸移液管，嚴禁在實驗室內(nèi)飲水、進食、吸煙，禁止赤膊和穿拖鞋。 ④不要用乙醇等有機溶劑擦洗濺灑在皮膚上的藥品。 中毒急救的方法主要有：①誤食了酸和堿，不要催吐，可先立即大量飲水，誤食堿者再喝些牛奶，誤食酸者，飲水后再服Mg(OH)2乳劑，最后飲些牛奶。②吸入了毒氣，立即轉(zhuǎn)

26、移室外，解開衣領(lǐng)，休克者應(yīng)施以人工呼吸，但不要用口對口法。③ 砷和汞中毒者應(yīng)立即送醫(yī)院急救。 外傷 ⑴ 化學灼傷： ①眼睛灼傷或掉進異物：眼內(nèi)若濺入任何化學藥品，應(yīng)立即用大量水沖洗十五分鐘，不可用稀酸或稀堿沖洗。若有玻璃碎片進入眼內(nèi)則十分危險，必須十分小心謹慎，不可自取，不可轉(zhuǎn)動眼球，可任其流淚，若碎片不出，則用紗布輕輕包住眼睛急送醫(yī)院處理。若有木屑、塵粒等異物進入，可由他人翻開眼瞼，用消毒棉簽輕輕取出或任其流淚，待異物排出后再滴幾滴魚肝油。 ②皮膚灼傷： (a)酸灼傷：先用大量水洗，再用稀NaHCO3或稀氨水浸洗，最后再用水洗。

27、 (b)堿灼傷：先用大量水沖洗，再用１％硼酸或２％醋酸浸洗，最后再用水洗。 (c)溴灼傷：這很危險，傷口不易愈合，一旦灼傷，立即用20％硫代硫酸鈉沖洗，再用大量水沖洗，包上消毒紗布后就醫(yī)。 ⑵燙傷：使用火焰、蒸汽、紅熱的玻璃和金屬時易發(fā)生燙傷，應(yīng)立即用大量水沖洗和浸泡，若起水泡不可挑破，包上紗布后就醫(yī)，輕度燙傷可涂抹魚肝油和燙傷膏等。 ⑶割傷： 這是生物化學實驗室常見的傷害，要特別注意予防，尤其是在向橡皮塞中插入溫度計、玻璃管時一定要用水或甘油潤滑，用布包住玻璃管輕輕旋入，切不可用力過猛，若發(fā)生嚴重割傷時要立即包扎止血，就醫(yī)時務(wù)必檢查傷部

28、神經(jīng)是否被切斷。 實驗室應(yīng)準備一個完備的小藥箱，專供急救時使用。藥箱內(nèi)備有：醫(yī)用酒精、紅藥水、紫藥水、止血粉、創(chuàng)口貼、燙傷油膏（或萬花油）、魚肝油、1％硼酸溶液或2％醋酸溶液、1％碳酸氫鈉溶液、20％硫代硫酸鈉溶液、醫(yī)用鑷子和剪刀、紗布、藥棉、棉簽、繃帶等。 1.3.5 觸電： 生物化學實驗室要使用大量的儀器、烘箱和電爐等，因此每位實驗人員都必須能熟練地安全用電，避免發(fā)生一切用電事故，當50HZ的電流通過人體25mA電流時呼吸會發(fā)生困難，通過了100mA以上電流時則會致死。 ⑴防止觸電：①不能用濕手接觸電器。②電源裸露部分都應(yīng)絕緣。③壞的接頭、插頭、插座和不良導

29、線應(yīng)及時更換。④先接好線路再插接電源，反之先關(guān)電源再拆線路。⑤儀器使用前要先檢查外殼是否帶電。⑥如遇有人觸電要先切斷電源再救人。 ⑵防止電器著火：①保險絲、電源線的截面積、插頭和插座都要與使用的額定電流相匹配。②三條相線要平均用電。③生銹的電器、接觸不良的導線接頭要及時處理。 ④電爐、烘箱等電熱設(shè)備不可過夜使用。⑤儀器長時間不用要拔下插頭，并及時拉閘。⑥電器、電線著火不可用泡沫滅火器滅火。 1.4 實驗記錄與實驗報告 1.4.1 實驗記錄 詳細、準確、如實地作好實驗記錄是極為重要的，記錄如果有誤，會使整個實驗失敗，這也是培養(yǎng)學生實驗能力和嚴謹?shù)目茖W作風的

30、一個重要方面。 ⑴ 每位同學必須準備一個實驗記錄本，實驗前認真預習實驗，看懂實驗原理和操作方法，在記錄本上寫好實驗預習報告， 包括詳細的實驗操作步驟(可以用流程圖表示)和數(shù)據(jù)記錄表格等。 ⑵ 記錄本上要編好頁數(shù)，不得撕缺和涂改，寫錯時可以劃去重寫。不得用鉛筆記錄，只能用鋼筆和園珠筆。記錄本的左頁作計算和草稿用，右頁用作預習報告和實驗記錄。同組的兩位同學合做同一實驗時，兩人必須都有相同、完整的記錄。 ⑶ 實驗中應(yīng)及時準確地記錄所觀察到的現(xiàn)象和測量的數(shù)據(jù)，條理清楚，字跡端正，切不可了草以致日后無法辨認。實驗記錄必須公正客觀，不可夾雜主觀因素。 ⑷ 實驗中要記

31、錄的各種數(shù)據(jù)，都應(yīng)事先在記錄本上設(shè)計好各種記錄格式和表格，以免實驗中由于忙亂而遺漏測量和記錄，造成不可挽回的損失。 ⑸ 實驗記錄要注意有效數(shù)字，如吸光度值應(yīng)為“0.050”，而不能記成“0.05”。每個結(jié)果都要盡可能重復觀測二次以上，即使觀測的數(shù)據(jù)相同或偏差很大，也都應(yīng)如實記錄，不得涂改。 ⑹ 實驗中要詳細記錄實驗條件，如使用的儀器型號、編號、生產(chǎn)廠等；生物材料的來源、形態(tài)特征、健康狀況、選用的組織及其重量等；試劑的規(guī)格、化學式、分子量、試劑的濃度等，都應(yīng)記錄清楚。二人一組的實驗，必須每人都作記錄。 實驗報告 實驗報告是實驗的總結(jié)和匯報，通過實驗報告的寫作可以

32、分析總結(jié)實驗的經(jīng)驗和問題，學會處理各種實驗數(shù)據(jù)的方法，加深對有關(guān)生物化學與分子生物學原理和實驗技術(shù)的理解和掌握，同時也是學習撰寫科學研究論文的過程。實驗報告的格式應(yīng)為： ⑴ 實驗目的；⑵ 實驗原理；⑶ 儀器和試劑；⑷ 實驗步驟；⑸ 數(shù)據(jù)處理；⑹ 結(jié)果討論。 每個實驗報告都要按照上述要求來寫，實驗報告的寫作水平也是衡量學生實驗成績的一個重要方面。實驗報告必須獨立完成，嚴禁抄襲。寫實驗報告要用實驗報告專用紙，以便教師批閱，不要用練習本和其他片頁紙。 為了使實驗結(jié)果能夠重復，必須詳細記錄實驗現(xiàn)象的所有細節(jié)，例如，若實驗中生成沉淀，那麼沉淀的真實顏色是什麼，是白色、淡黃色

33、或是其他？沉淀的量是多還是少，是膠狀還是顆粒狀？什麼時候形成沉淀，立即生成還是緩慢生成，熱時生成還是冷卻時生成？在科學研究中，仔細地觀察，特別注意那些未予想到的實驗現(xiàn)象是十分重要的，這些觀察常常引起意外的發(fā)現(xiàn)，報告并注意分析實驗中的真實發(fā)現(xiàn)，對學生將是非常重要的科學研究訓練。 實驗報告使用的語言要簡明清楚，抓住關(guān)鍵，各種實驗數(shù)據(jù)都要盡可能整理成表格并作圖表示之，以便比較，一目了然。實驗作圖尤其要嚴格要求，必須使用坐標紙，每個圖都要有明顯的標題，坐標軸的名稱要清楚完整，要注明合適的單位，坐標軸的分度數(shù)字要與有效數(shù)字相符，并盡可能簡明，若數(shù)字太大，可以化簡，并在坐標軸的單位上乘以10的方

34、次。實驗點要使用專門設(shè)計的符號，如：○、●、□、■、△、▲等，符號的大小要與實驗數(shù)據(jù)的誤差相符。不要用“×、＋”和“·”小園點。有時也可用兩端有小橫線的垂直線段來表示實驗點，其線段的長度與實驗誤差相符。通常橫軸是自變量，往往知道的很準確，縱軸是應(yīng)變量，是測量的數(shù)據(jù)。曲線要用曲線板或曲線尺畫成光滑連續(xù)的曲線，各實驗點均勻分布在曲線上和曲線兩邊，且曲線不可超越最后一個實驗點。兩條以上的曲線和符號應(yīng)有說明。 實驗結(jié)果的討論要充分，盡可能多查閱一些有關(guān)的文獻和教科書，充分運用己學過的知識和生物化學原理，進行深入的探討，勇于提出自己獨到的分析和見解，并歡迎對實驗提出改進意見。 1.5 實

35、驗室基本操作 1.5.1 玻璃儀器的清洗 實驗中所用的玻璃儀器清潔與否，直接影響實驗的結(jié)果，往往由於儀器的不清潔或被污染而造成較大的實驗誤差，有時甚至會導致實驗的失敗。 做生物化學實驗對玻璃儀器清潔程度的要求，比一般化學實驗的要求更高。這是因為：①生物化學實驗中蛋白質(zhì)、酶、核酸等往往都是以“毫克”和“微克”計的，稍有雜質(zhì)，影響就很大。②生物化學實驗對許多常見的污染雜質(zhì)十分敏感，如金屬離子（鈣、鎂離子等）、去污劑和有機物殘基等，因此玻璃儀器（包括離心管等塑料器皿）是否徹底清洗凈就是非常重要的。 ⑴ 初用玻璃儀器的清洗 新購買的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可

36、先用0.5％的去污劑洗刷，再用自來水洗凈，然后浸泡在1％～2％鹽酸溶液中過夜（不可少于四小時），再用自來水沖洗，最后用無離子水沖洗兩次，在100℃～120℃烘箱內(nèi)烘干備用。 ⑵ 使用過的玻璃儀器的清洗 先用自來水洗刷至無污物，再用合適的毛刷沾去污劑（粉）洗刷，或浸泡在0.5％的清洗劑中超聲清洗（比色皿決不可超聲），然后用自來水徹底洗凈去污劑，用無離子水洗兩次，烘干備用（計量儀器不可烘干）。清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠，否則重洗，若重洗后仍掛有水珠，則需用洗液浸泡數(shù)小時后（或用去污粉擦洗），重新清洗。 ⑶ 石英和玻璃比色皿的清洗 決不可用強堿清洗，因為強堿會浸蝕

37、拋光的比色皿。只能用洗液或1％ ～2％的去污劑浸泡，然后用自來水沖洗，這時使用一支綢布包裹的小棒或棉花球棒刷洗，效果會更好，清洗干凈的比色皿也應(yīng)內(nèi)外壁不掛水珠。 1.5.2 塑料器皿的清洗 聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化學實驗中已用的越來越多。第一次使用塑料器皿時，可先用8mol/L尿素（用濃鹽酸調(diào)pH = 1）清洗，接著依次用無離子水、1 mol/L KOH和無離子水清洗，然后用10—3 mol/L EDTA 除去金屬離子的污染，最后用無離子水徹底清洗，以后每次使用時，可只用0.5％的去污劑清洗，然后用自來水和無離子水洗凈即可。 1.5.3 洗液的配制 因己

38、確定鉻有致癌作用，因此配制和使用洗液時要極為小心，常用兩種配制方法如下： ⑴ 取100mL 工業(yè)濃硫酸置于燒杯內(nèi)，小心加熱，然后慢慢加入5g重鉻酸鉀粉末，邊加邊攪拌，待全部溶解并緩慢冷卻后，貯存在磨口玻璃塞的細口瓶內(nèi)。 ⑵ 稱取5g重鉻酸鉀粉末，置于250mL 燒杯中，加5mL 水使其溶解，然后慢慢加入100mL 濃硫酸，溶液溫度將達80℃，待其冷卻后貯存于磨口玻璃瓶內(nèi)。 1.5.4 其他洗滌液 ⑴ 工業(yè)濃鹽酸：可洗去水垢或某些無機鹽沉淀。 ⑵ 5％草酸溶液：用數(shù)滴硫酸酸化，可洗去高錳酸鉀的痕跡。 ⑶ 5％～10％磷酸三鈉（Na3PO4·1

39、2H2O）溶液：可洗滌油污物。 ⑷ 30％硝酸溶液：洗滌二氧化碳測定儀及微量滴管。 ⑸ 5％～10％乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）溶液：加熱煮沸可洗脫玻璃儀器內(nèi)壁的白色沉淀物。 ⑹ 尿素洗滌液：為蛋白質(zhì)的良好溶劑，適用于洗滌盛過蛋白質(zhì)制劑及血樣的容器。 ⑺ 有機溶劑：如丙酮、乙醚、乙醇等可用于洗脫油脂、脂溶性染料污痕等，二甲苯可洗脫油漆的污垢。 ⑻ 氫氧化鉀的乙醇溶液和含有高錳酸鉀的氫氧化鈉溶液：這是兩種強堿性的洗滌液，對玻璃儀器的侵蝕性很強，可清除容器內(nèi)壁污垢，洗滌時間不宜過長，使用時應(yīng)小心慎重。 1.5.5 玻璃和塑料器皿的干燥：

40、 生化實驗中用到的玻璃和塑料器皿經(jīng)常需要干燥，通常都是用烘箱或烘干機在110℃～120℃進行干燥，而不要用丙酮蕩洗再吹干的方法來干燥，因為那樣會有殘留的有機物覆蓋在器皿的內(nèi)表面，從而干擾生物化學反應(yīng)。硝酸纖維素的塑料離心管加熱時會發(fā)生爆炸，所以決不能放在烘箱中干燥，只能用冷風吹干。 1.5.6 移液 準確的分析方法對于生物化學實驗是極為重要的，在各種生物化學分析技術(shù)中，首先要熟練掌握的就是準確的移液技術(shù)。為此要用到各種形式的移液管，其中有一些是學生們在化學實驗中未用過而在生化實驗中是常用的。下圖列出了一些生化實驗中常用的移液器具。 ⑴ 滴管（圖1－1 中(E)）

41、 使用方便，可用于半定量移液，其移液量為1mL—5mL，常用2mL，可換不同大小的滴頭（圖1－1 中(A)）。滴管有長、短兩種，新出一種帶刻度和緩沖泡的滴管，可以比普通滴管更準確地移液，并防止液體吸入滴頭。 ⑵ 移液管（吸管） 吸管使用前應(yīng)洗至內(nèi)壁不掛水珠，1mL 以上的吸管，用吸管專用刷刷洗，0.1mL、0.2mL和0.5mL 的吸管可用洗滌劑浸泡，必要時可以用超聲清洗器清洗。由于鉻酸洗液致癌，應(yīng)盡量避免使用。若有大量成批的吸管洗后沖洗，可使用沖洗桶，將吸管尖端向上置于桶內(nèi)，用自來水多次沖洗后再用蒸餾水或無離子水沖洗。 吸管分為兩種，一種是無分度的，稱為

42、胖肚吸管（圖1－1 中(F)），精確度較高，其相對誤差A級為0.7％ ~ 0.8％，B級為1.5％ ~ 0.16％，液體自標線流至口端（留有殘液），A級等待15s，B級等待3s。 另一種吸管為分度吸管（圖1－1 中(G)），管身為一粗細均勻的玻璃管，上面均勻刻有表示容積的分度線，其準確度低于胖肚吸管，相對誤差A級為0.8％ ~ 0.2％，B級為1.6％—0.4％，A級、B級在吸管管身上有A、B字樣，有“快”字則為快流式，有“吹”字則為吹出式，無“吹”字的吸管不可將管尖的殘留液吹出。吸、放溶液前要用吸水紙擦拭管尖。

43、 圖1－1 生化實驗中常用的移液器具 圖1－1 (H)為血清吸管，其刻度一直刻到管端出口處，由于沒有管尖，不會殘留液體，但需在液體流完后仃留15～20秒，常用于吸取血清等粘度大的液體。 圖1－1 (I)是微量λ吸管，用于1～500ml （1λ= 1ml）的移液，用吸水紙蘸出多吸的液體。 圖1－1 (J)是毛細微量吸管，用于1～20ml的移液，常用于薄層層析和紙層析。 吸管吸取溶液最常用的是洗耳球（圖1 中(B)）。此外，為便于移液，還可以使用新式的吸液球（圖1－1 中(C)），球上有A、B、C三個玻璃珠閥門，吸液

44、之前，先用拇指和食指按捏A閥，用其他手指擠壓球體，由A閥排氣，使球內(nèi)形成負壓，插入吸管吸液時，用拇指和食指按捏B閥，將溶液吸至所需刻度，放液時按捏C閥，直至溶液流盡，若需吹出管尖殘液時，可在按捏C閥的同時，用中指擠壓C閥前面的小球泡，即可吹出管尖殘液。 還有一種“吸管泵”（圖1－1 中(D)）使用更為方便，插入吸管后，用拇指轉(zhuǎn)動上部的小輪，即可使園柱形泵內(nèi)的柱塞上下移動，將溶液吸入或排出吸管，尤其是在移取10mL 以上的溶液時，用“吸管泵”最為方便。 ⑶ 微量進樣器 微量進樣器常用作氣相和液相色譜儀的進樣器，在生化實驗中主要是用作電泳實驗的加樣器，通常可分為無存液

45、和有存液兩種。 1) 0.5mL ～5mL無存液微量進樣器： 進樣器的不銹鋼芯子直接通到針尖端處，不會出現(xiàn)存液，所以可用于5mL以下的極微量液體進樣。 2) 10mL～100mL有存液微量進樣器： 不銹鋼的針尖管部分是空管，進樣器的柱塞不能到達，因而管內(nèi)會存有空氣或液體，其使用注意事項是：① 不可吸取濃堿溶液，以免腐蝕玻璃和不銹鋼零件。 ② 因為有存液，所以吸液時要來回多拉幾次，將針尖管內(nèi)的氣泡全部排盡。 ③ 針尖管內(nèi)孔極小，使用后，尤其是吸取過蛋白質(zhì)溶液后，必須立即清洗針尖管，防止堵塞。若遇針尖管堵塞，不可用火燒，只能用φ0.1mm的不銹鋼絲耐心串通。 ④ 進樣器未

46、潤濕時不可來回干拉芯子，以免磨損而漏氣。 ⑤ 若進樣器內(nèi)發(fā)黑，有不銹鋼氧化物，可用芯子蘸少量肥皂水，來回拉幾次即可除之。 ⑷ 自動取液器 這種取液器在生化實驗中大量地使用，它們主要用于多次重復的快速定量移液，可以只用一只手操作，十分方便。移液的準確度（即容量誤差）為 ±(0.5％～1.5％)，移液的精密度（即重復性誤差）更小些，為 ≤0.5％。 取液器可分為二種：一種是固定容量的，常用的有100ml 、200mL和1000mL等幾種；另一種是可調(diào)容量的取液器，常用的有200mL、1000mL和5000mL等多種規(guī)格。每種取液器都有其專用的聚丙烯塑料吸頭，吸頭通常是

47、一次性使用，當然也可以超聲清洗后重復使用，而且此種吸頭還可以進行120℃高壓滅菌。 可調(diào)式自動取液器的操作方法是用拇指和食指旋轉(zhuǎn)取液器上部的旋鈕，使數(shù)字窗口出現(xiàn)所需容量體積的數(shù)字，在取液器下端插上一個塑料吸頭，并旋緊以保證氣密，然后四指并攏握住取液器上部，用拇指按住柱塞桿頂端的按鈕，向下按到第一停點，將取液器的吸頭插入待取的溶液中，緩慢松開按鈕，吸上液體，并停留1～2秒鐘（粘性大的溶液可加長停留時間），將吸頭沿器壁滑出容器，用吸水紙擦去吸頭表面可能附著的液體，排液時吸頭接觸傾斜的器壁，先將按鈕按到第一停點，停留一秒鐘（粘性大的液體要加長停留時間），再按壓到第二停點，吹出吸頭尖部的剩余

48、溶液，如果不便于用手取下吸頭，可按下除吸頭推桿，將吸頭推入廢物缸。 自動取液器的使用注意事項是： ① 吸取液體時一定要緩慢平穩(wěn)地松開拇指，絕不允許突然松開，以防將溶液吸入過快而沖入取液器內(nèi)腐蝕柱塞而造成漏氣。 ② 為獲得較高的精度，吸頭需予先吸取一次樣品溶液，然后再正式移液，因為吸取血清蛋白質(zhì)溶液或有機溶劑時，吸頭內(nèi)壁會殘留一層“液膜”，造成排液量偏小而產(chǎn)生誤差。③ 濃度和粘度大的液體，會產(chǎn)生誤差，為消除其誤差的補償量，可由試驗確定，補償量可用調(diào)節(jié)旋鈕改變讀數(shù)窗的讀數(shù)來進行設(shè)定。④ 可用分析天平稱量所取純水的重量并進行計算的方法，來校正取液器，1mL 蒸餾水20℃時重0.9982g。

49、 圖1－2 自動取液器示意圖 1.6 緩沖溶液與pH測定 緩沖溶液是一類能夠抵制外界加入少量酸和堿的影響，仍能維持pH值基本不變的溶液。該溶液的這種抗pH變化的作用稱為緩沖作用。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物溶于溶劑（即純水）所得的溶液，溶液內(nèi)所溶解的溶質(zhì)（化合物）稱之為緩沖劑，調(diào)節(jié)緩沖劑的配比即可制得不同pH的緩沖液。 緩沖溶液的正確配制和pH值的準確測定，在生物化學的研

50、究工作中有著極為重要的意義，因為在生物體內(nèi)進行的各種生物化學過程都是在精確的pH值下進行的，而且受到氫離子濃度的嚴格調(diào)控，能夠做到這一點是因為生物體內(nèi)有完善的天然緩沖系統(tǒng)。生物體內(nèi)細胞的生長和活動需要一定的pH值，體內(nèi)pH環(huán)境的任何改變都將引起與代謝有關(guān)的酸堿電離平衡移動，從而影響生物體內(nèi)細胞的活性。為了在實驗室條件下準確地模擬生物體內(nèi)的天然環(huán)境，就必須保持體外生物化學反應(yīng)過程有體內(nèi)過程完全相同的pH值，此外，各種生化樣品的分離純化和分析鑒定，也必須選用合適的pH值，因此，在生物化學的各種研究工作中和生物技術(shù)的各種開發(fā)工作中，深刻地了解各種緩沖試劑的性質(zhì)，準確恰當?shù)剡x擇和配制各種緩沖溶液，精確

51、地測定溶液的pH值，就是非常重要的基礎(chǔ)實驗工作。下表列出某些人體體液的pH值： 表1—3 人體體液pH 體 液 pH 體 液 pH 血 清 7.35～7.45 大腸液 8.3～8.4 成人胃液 0.9～1.5 淚 6.6～6.9 唾 液 6.3～7.1 尿 4.8～7.5 胰 液 7.5～8.0 腦脊液 7.35～7.45 1.6.1 基本概念

52、 ⑴ Br?nsted-Lowry酸堿理論（又稱酸堿質(zhì)子理論）。1923年由丹麥化學家?nsted和英國化學家同時提出了酸堿質(zhì)子學說，發(fā)展了酸堿理論，被后人稱為酸堿質(zhì)子理論或Br?nsted-Lowry酸堿理論。他們認為凡能釋放質(zhì)子的分子或離子（如：H2O，HCl，NH4+，HSO4— 等）稱為酸，凡能接受質(zhì)子的分子或離子（如：H2O，NH3，Cl—等）稱為堿。因此，一種酸釋放質(zhì)子后即成為堿，稱為該酸的共軛堿，同樣一種堿與質(zhì)子結(jié)合后，形成對應(yīng)的酸，稱為該堿的共軛酸。 A—H ＋ B— A ＋ B—H

53、 酸1 堿2 堿1 酸2 酸1 是 堿1的共軛酸， 堿2 是 酸2 的共軛堿。 如鹽酸在水中的解離： HCl Cl— ＋ H+ HCl是酸，Cl—是它的共軛堿。 ⑵ 緩沖體系的設(shè)計： 強電解質(zhì)溶于水幾乎全部解離為正負離子，弱電解質(zhì)溶于水時，則不完全解離，只有部分的分子解離出正負離子，其馀以分子形式存在于溶液中。例如弱酸（HA）及其鹽溶于水時，只有部分HA解離為 H+ 和 A—離子，其平衡方程式如下：

54、 K1 HA A— ＋ H+ (1-1) K2 ∴

55、 (1-2) (1-2)式兩邊取負對數(shù)： (1-3) (1-3)式中： [HA] — 為弱酸的濃度

56、 [H+] — 為HA解離出的氫離子濃度 [A—] — 為HA的共軛堿的離子濃度 K1 — 為酸解離的速度常數(shù) K2 — 為A—與H+ 締合的速度常數(shù) Ka — 為反應(yīng)方程(1-1)達平衡時HA的解離平衡常數(shù) 現(xiàn)將HA的pKa 定義為 －lg Ka，將HA溶液的pH定義為 －log[H+]， ∴ (1-3)式可寫為 ： (1-4) 或：

57、 (1-5) 方程(1-4)稱為：Henderson-Hassel-Balch方程，此方程對于生物化學學科，在理論與實踐上都具有重要意義。該方程表示了溶液pH與溶質(zhì)中可解離基團pKa之間的關(guān)系。很明顯，當[A—]＝[HA]時： ∴ pH ＝ pKa 這就意味著當[HA]有一半解離時，溶液的pH等于 pKa，此弱酸－堿緩沖體系的pKa即

58、代表緩沖范圍的中點。一個緩沖體系的有效緩沖范圍，通常是在pKa值為中點的兩個pH單位范圍內(nèi)，即：緩沖劑的有效pH范圍＝pKa±1，所以，當緩沖溶液的pH等于該緩沖劑的pKa時，緩沖能力最大。若要設(shè)計一個新的緩沖體系時，只需按所要求的pH值查出pKa值等于此pH值的各種緩沖劑并從中進行挑選即可。 1960年，和他的同事們提出，適合生命科學研究使用的緩沖體系應(yīng)具有以下特性： ① pKa值在6～8之間； ② 在水中的溶解度高；③ 不易穿透生物膜；④ 鹽效應(yīng)小；⑤ 離子濃度、溶液組成和溫度對解離的影響小；⑥ 不與金屬離子生成復合物或沉淀； ⑦ 該緩沖劑化學穩(wěn)定；⑧ 紫外和可見光波長范圍內(nèi)

59、光吸收??；⑨ 易制得高純度的鹽。 按照這些要求可以設(shè)計和選擇最為合適的緩沖劑來配制所需的緩沖溶液。 1.6.2 生物化學常用緩沖液 ⑴ 磷酸鹽緩沖液 磷酸鹽是生物化學研究中使用最廣泛的一種緩沖劑，由於它們是二級解離，有二個pKa值，所以用它們配制的緩沖液，pH范圍最寬： NaH2PO4： pKa1＝2.12， pKa2＝7.21 Na2HPO4： pKa1＝7.21， pKa2＝12.32 配酸性緩沖液： 用 NaH2PO4，pH＝1～4， 配中性緩沖液： 用混合的兩

60、種磷酸鹽，pH＝6～8， 配堿性緩沖液： 用 Na2HPO4，pH＝10～12。 用鉀鹽比鈉鹽好，因為低溫時鈉鹽難溶，鉀鹽易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的緩沖液時，只能用磷酸鈉而不能用磷酸鉀，因為SDS（十二烷基硫酸鈉）會與鉀鹽生成難溶的十二烷基硫酸鉀。 磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點為：①容易配制成各種濃度的緩沖液；②適用的pH范圍寬；③pH受溫度的影響小；④緩沖液稀釋后pH變化小，如稀釋十倍后pH的變化小于0.1。 其缺點為：①易與常見的鈣Ca++離子、鎂Mg++離子以及重金屬離子締合生成沉淀；②會抑制某些生物化學過程，如對某些酶的催化作用會產(chǎn)生某

61、種程度的抑制作用。 ⑵Tris（三羥甲基氨基甲烷，N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane）緩沖液 　 Tris緩沖液在生物化學研究中使用的越來越多，有超過磷酸鹽緩沖液的趨勢，如在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中已都使用Tris緩沖液，而很少再用磷酸鹽。 Tris緩沖液的常用有效pH范圍是在“中性”范圍，例如： Tris-HCl緩沖液： pH＝7.5～8.5 Tris-磷酸鹽緩沖液： pH＝5.0～9.0 配制常用的緩沖液的方法有兩種：①按書后附錄中所列該緩沖液表中的方法，分別配制

62、0.05mol/L Tris和0.05mol/L HCl溶液，然后按表中所列體積混合。由于標準濃度的稀鹽酸不易配制，所以常用另一種方法；②若配1L 0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液：先稱12.11g Tris堿溶于950mL～970mL 無離子水中，邊攪拌邊滴加4N HCl，用pH計測定溶液pH值至所需的pH值，然后再加水補足到1L。 Tris-HCl緩沖液的優(yōu)點是： ①因為Tris堿的堿性較強，所以可以只用這一種緩沖體系配制pH范圍由酸性到堿性的大范圍pH值的緩沖液；②對生物化學過程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀。 其缺點是：①緩沖液的pH值受溶液濃度影響

63、較大，緩沖液稀釋十倍，pH值的變化大于0.1；②溫度效應(yīng)大，溫度變化對緩沖液pH值的影響很大，即： △pKa／℃＝－0.031 ，例如：4℃時緩沖液的pH＝8.4，則37℃時的pH＝7.4，所以一定要在使用溫度下進行配制，室溫下配制的Tris-HCl緩沖液不能用于0℃～4℃。 ③易吸收空氣中的CO2，所以配制的緩沖液要蓋嚴密封。 ④此緩沖液對某些pH電極發(fā)生一定的干擾作用，所以要使用與Tris溶液具有兼容性的電極。 ⑶ 有機酸緩沖液 這一類緩沖液多數(shù)是用羧酸與它們的鹽配制而成，pH范圍為酸性，即pH＝3.0～6.0，最常用的是甲酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等。 甲酸

64、～甲酸鹽緩沖液很有用，因其揮發(fā)性強，使用后可以用減壓法除之。乙酸～乙酸鈉和檸檬酸～檸檬酸鈉緩沖體系也使用的較多，檸檬酸有三個pKa值：pKa1＝3.10， pKa2＝4.75， pKa3＝6.40。琥珀酸有二個pKa值：pKa1＝4.18， pKa2＝5.60。 有機酸緩沖液的缺點是：①所有這些羧酸都是天然的代謝產(chǎn)物，因而對生化反應(yīng)過程可能發(fā)生干擾作用；②檸檬酸鹽和琥珀酸鹽可以和過渡金屬離子（Fe3+、Zn++、Mg++等）結(jié)合而使緩沖液受到干擾；③這類緩沖液易與Ca++離子結(jié)合，所以樣品中有Ca++離子時，不能用這類緩沖液。 ⑷ 硼酸鹽緩沖液 常用的有效pH

65、范圍是：pH＝8.5～10.0，因而它是堿性范圍內(nèi)最常用的緩沖液，其優(yōu)點是配制方便，只使用一種試劑，缺點是能與很多代謝產(chǎn)物形成絡(luò)合物，尤其是能與糖類的羥基反應(yīng)生成穩(wěn)定的復合物而使緩沖液受到干擾。 ⑸ 氨基酸緩沖液 此緩沖液使用的范圍寬，可用于pH=2.0～11.0，例如最常用的有： 甘氨酸—HCl緩沖液：pH=2.0～5.0， 甘氨酸—NaOH緩沖液：pH=8.0～11.0，　 　 　 　 甘氨酸—Tris緩沖液：pH=8.0～11.0，（此緩沖液用于廣泛使用的SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳的電極緩沖液）， 組氨酸緩沖液：pH=5.5

66、～6.5， 甘氨酰胺（glycine amide）緩沖液：pH=7.8～8.8， 甘氨酰甘氨酸（glycylglycine）緩沖液：pH=8.0～9.0。 此類緩沖體系的優(yōu)點是：為細胞組份和各種提取液提供更接近的天然環(huán)境。其缺點是：①與羧酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似，也會干擾某些生物化學反應(yīng)過程，如代謝過程等。②試劑的價格較高。 ⑹ 兩性離子緩沖液（Zwitterionic buffers），又稱Good’s緩沖液 1960年，和他的同事們總結(jié)了現(xiàn)有的各種緩沖試劑的優(yōu)缺點后認為，必須用人為設(shè)計和人工合成的方法來找到專門用于生命科學研究的特定的緩沖體系，這些緩沖體系應(yīng)具有前面所述的九條要求和特性。他們合成的一系列Good’s緩沖液可查閱有關(guān)的資料。 Good’s緩沖液的主要優(yōu)點是不參加和不干擾生物化學反應(yīng)過程，對酶化學反應(yīng)等無抑制作用，所以它們專門用于細胞器和極易變性的、對pH敏感的蛋白質(zhì)和酶的研究工作。其缺點是：①價格昂貴，②對測定蛋白質(zhì)含量的雙縮脲法和Lowry法不適用，因為它們會使空白管的顏色加深。 1.6.3 pH值的測定