玉米赤霉烯酮ELISA快速檢測試劑盒操作說明書(1)

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1、博恒? 玉米赤霉烯酮ELISA快速檢測試劑盒操作說明書 1、 簡介 本試劑盒采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附ELISA原理快速定量檢測谷物、飼料中的玉米赤霉烯酮（ZearaLenone,ZEN）。 谷物/飼料的前處理包括：提取、過濾、稀釋，處理時間大約為20-40分鐘。 本試劑盒的檢測限為：10 ppb；谷物/飼料中ZEN的回收率 ≥80%；批內(nèi)、批間變異系數(shù)<15% 。 2、 試劑盒組成 A. 24/48/96孔ZEN酶標板: 3/6/12條×8孔 B. 20×濃縮洗滌液：25mL (用蒸餾水稀釋20倍

2、使用) 1瓶 C. ZEN抗體: 3/6/12mL 　　 1瓶 (紅蓋) D. 酶標二抗： 3/6/12 mL 　　　　　　 　 1瓶 (綠蓋) E. 顯色液：3/6/12 mL 1瓶 (藍蓋) F. 終止液:3/6 mL 　 1瓶 (黃蓋) G. ZEN標準品:1.5/2mL/瓶（0、30、60、200、500ppb）

3、各1瓶 H. 操作說明書 1份 　 注意：標準品含有低濃度ZEN、終止液含2 N H2SO4，需小心取用；勿在有效期外使用本試劑盒。 3、 貯存條件與有效期 2-8℃避光貯存，忌0℃以下凍存，有效期見試劑盒內(nèi)蓋。 4、 樣品處理程序 l 實驗準備：配制60%甲醇水溶液（v/v，60:40）和20%甲醇水溶液（v/v，20:80）。 注意：請精確配制上述溶液，以免影響檢測的準確性。 l 稱取5 g 具有代表性的粉碎樣品于100 mL帶塞三角瓶內(nèi)，準確加入25

4、 mL 60%甲醇水溶液。 l 將加入了甲醇水溶液的樣品放入振蕩器內(nèi)（或用手強力振蕩），充分振蕩3分鐘后，用whatman 1號濾紙過濾，收集濾液。 l 取濾液2mL，加入6 mL 20%甲醇水溶液，混勻，用whatman 1號濾紙過濾，此為樣品待檢液。 注意： ? 某些樣品待檢液(如花生等)久置影響檢測結(jié)果的準確性，為保證檢測的準確性，樣品提取后請即時檢測。 ? 若樣品待檢液不立即檢測，請將其存儲于棕色玻璃瓶內(nèi)，2-8℃避光保存。 ? 試劑盒在使用前，請將試劑盒內(nèi)所有試劑放到室溫（20-25℃）進行溫度平衡。試劑用完后立即將其放置回2-8℃冰箱內(nèi)保存。 ? 在每個步驟操作時

5、，速度要快，不要使板孔暴露在空氣中時間過久，避免酶標板變干。未用完的酶標板需密閉于自封帶內(nèi)，防止受潮且避光保存于2-8℃冰箱內(nèi)。 ? 在溫育時，避免光照，建議將酶標板置于濕盒內(nèi)(在有蓋容器內(nèi)放置一塊平整濕紗布)進行溫育。 ? 若樣品數(shù)量超過20份，請用多通道加樣器操作。 5、 定量檢測程序 5.1 實驗準備：從冰箱取出試劑盒，恢復至室溫后，打開自封袋，取出所需數(shù)量的板條插入微孔架，記錄空白、ZEN標準品①②③④⑤號及樣品的位置（可參照下表所示）。其余板條封口后放入冰箱。將20×濃縮洗滌液用超純水或蒸餾水稀釋20倍，待用。 1 2 3…12 A 空白 樣品 B

6、 標準品① 樣品 C 標準品② 樣品 D 標準品③ 樣品 E 標準品④ 樣品 F 標準品⑤ 樣品 G 樣品 樣品 H 樣品 樣品 5.2 加樣：空白孔加入100 μL 洗滌液(不加ZEN抗體)。ZEN標準品孔和樣品孔相應(yīng)地加入標準品(①②③④⑤)和樣品待檢液各50 μL/孔（如上表所示加入），再加入ZEN抗體(50 μL /孔)，此時各孔中溶液體積為100 μL。將酶標板在水平桌面上輕微振蕩（注意避免液體濺出），使之混勻，放入濕盒內(nèi)(在有蓋容器內(nèi)放置一塊平整濕紗布)，37℃溫育30分鐘。注意：此操作步驟要快，盡量保持前后孔

7、溫育時間一致，每次加樣須更換新的吸頭。 5.3洗板：甩出孔中的液體，用洗瓶或移液器將洗滌液加入各孔中(滿孔)，再次甩出孔中液體，將酶標板倒置在吸水紙上拍打以除去孔中的液體，再重復操作洗滌步驟三次(共洗四次)。 5.4加酶標二抗：將洗好的酶標板平放，加入酶標二抗100 μL /孔，置于濕盒內(nèi)，37℃溫育30分鐘。 5.5洗板：參照5.3 5.6顯色：將洗好的酶標板平放，加入顯色液100 μL /孔，37℃顯色5分鐘(若顯色較淺，可適當延長，但不宜超過10分鐘)。 5.7終止及測定：將顯色完畢的酶標板取出，加入終止液50 μL/孔，輕微震蕩混勻，以空白孔調(diào)零，在450 nm處測量吸光值A(chǔ)

8、（在加入終止液5分鐘內(nèi)讀取吸光值）。 5.8結(jié)果判定：以ZEN標準品濃度30ppb、60ppb、200ppb、500ppb的常用對數(shù)值（1gC）為橫坐標，各濃度標準品相應(yīng)的吸光值A(chǔ)與0ppb的標準品A值的比值(B/B0%)為縱坐標[B/B0%=標準品（或樣品）的吸光值/0ppb標準品的吸光值×100%]，繪制標準曲線。根據(jù)樣品孔的吸光值計算樣品的B/B0%值，查標準曲線，可得到相應(yīng)樣品中ZEN的含量(已考慮樣品提取的稀釋倍數(shù)，結(jié)果無需換算)。(或可直接用RADEWIN 等專用ELISA分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析得出結(jié)果)。如果檢測結(jié)果高于檢測上限，請將待測樣品提取液用30%甲醇水（v/v，30:

9、70）稀釋后再檢測，測定結(jié)果乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。 6、 限量(定性)檢測程序 樣品處理程序見四，適用于同時定性檢測多個限量標準不同的樣品，以ZEN標準品③號(60ppb)作參照進行定性比較，不需作標準曲線。待測樣品提取液根據(jù)限量標準的不同，用30%的甲醇水溶液按下表稀釋： 限量標準 ≤60ppb ≤500ppb 待檢樣品提取液 1mL 0.3mL 30%的甲醇水 0 2.2mL 稀釋倍數(shù) 1 50/6 6.1 實驗準備：從冰箱取出試劑盒，恢復至室溫后，打開自封袋，取出所需數(shù)量的板條插入微孔架，記錄空白、ZEN標準品③號(60ppb)及樣品的位置，其余板條封口后放入

10、冰箱。 6.2 反應(yīng)：空白孔加入100 μL 洗滌液(不加ZEN抗體)。ZEN標準品孔和樣品孔相應(yīng)地加入標準品③號(60ppb)和稀釋后的待檢樣品提取液各50 μL/孔，再加入ZEN抗體(50 μL /孔)，將酶標板在水平桌面上輕微振蕩（注意避免液體濺出），使之混勻，置濕盒內(nèi)，37℃溫育30分鐘。注意：此操作步驟要快，盡量保持前后孔溫育時間一致，每次加樣須更換新的吸頭。 6.3 洗板： 參照5.3 6.4 加酶標二抗：參照5.4 6.5 洗板：參照5.5 6.6 顯色：參照5.6 6.7 終止及測定：參照5.7 (目測法不加終止液) 6.8結(jié)果判定：目測法(未加終止液前目測)：

11、比較樣品孔與標準品參照孔的顏色，若樣品孔顯色比標準品參照淺，則為陽性，樣品中ZEN的含量超出限量標準；若深者，則為陰性；若顏色接近，則需用酶標儀測吸光值比較。儀器法：酶標儀檢測在450nm波長處各孔的吸光值A(chǔ)，若樣品的A值<標準參照的A值，為陽性，表示樣品中ZEN的含量超出限量標準；若樣品A值≥標準參照A值，為陰性。 7、 自備儀器及試劑 l 酶標儀（內(nèi)置450nm濾光片）或黃曲霉毒素B1專用測定儀 l 20-200μL微量移液器及配套吸頭 l 恒溫培養(yǎng)箱（0℃-50℃）、冰箱、感量0.01g的天平、小型粉碎機或碾缽 l 玻璃器皿：三角瓶、燒杯、分液漏斗、蒸發(fā)皿、量筒、具塞試管、滴管、移液管等 l 其他：甲醇、whatman 1號濾紙、吸水紙等 8、 國家標準 GB/T 19540-2004 飼料中玉米赤霉烯酮的測定 薄板層析法和ELISA分析法 GB 2715 2005 糧食衛(wèi)生標準 小麥和玉米中玉米赤霉烯酮限量指標為60μg/kg GB 13078.2-2006 飼料衛(wèi)生標準飼料和玉米中玉米赤霉烯酮的允許量500μg/kg 地址：南昌市高新區(qū)火炬大道201號江西留學生創(chuàng)業(yè)園　 郵編：330029 電話：0791-8130250 傳真：0791-8130250