生物技術(shù)實踐[生物選修一]知識復習圖解
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1、 ...wd... 果酒和果醋的制作 挑選葡萄 沖洗 榨汁 酒精發(fā)酵 醋酸發(fā)酵 注意: ①要先清洗后除枝梗(防止除去枝梗時引起葡萄破損,增加被雜菌污染的時機,同時,防止葡萄汁流失) ②不能反復沖洗(防止菌種流失) 注意: 選擇新鮮的葡萄 注意: ①榨汁機要清洗干凈,并晾干(防雜菌污染) ②防止將果核壓破(因果核含有多種有害葡萄酒風味的物質(zhì)) 原理:主要菌種是酵母菌。酵母菌是異養(yǎng)兼性厭氧微生物 C6H12O6→C2H5OH+C02 溫度:20℃左右最適合酵母菌繁殖
2、,一般控制在18℃~25℃。 果酒 果醋 注意: ①發(fā)酵裝置要清洗干凈,并用體積分數(shù)為70%的酒精消毒 ②發(fā)酵瓶裝入葡萄汁后留有l(wèi)/3的空間(目的是先讓酵母菌進展有氧呼吸快速繁殖,耗盡氧氣后再進展酒精發(fā)酵;其次,防止發(fā)酵過程中產(chǎn)生的CO2造成發(fā)酵液的溢出) ③如用帶蓋的瓶子制葡萄酒,每隔12 h左右將瓶蓋擰松一次(注意不是翻開瓶蓋,防雜菌污染),之后再將瓶蓋擰緊(目的:排出多余的氣體放炸裂) ④裝入葡萄汁封閉充氣口(無氧環(huán)境和放雜菌污染) ⑤發(fā)酵過程中,隨著酒精度數(shù)的提高,葡萄酒呈現(xiàn)深紅色(因紅葡萄皮的色素也進入發(fā)酵液) ⑥酒精的鑒定:與酸性重鉻酸鉀→呈灰綠色 對照組→
3、2mL白酒 實驗組→2mL發(fā)酵液 試管甲→2mL發(fā)酵前液 試管乙→2mL發(fā)酵后液 3mL/L的H2SO43滴→混勻→ 重鉻酸鉀3滴→觀察 3mL/L的H2SO43滴→混勻→ 重鉻酸鉀3滴→觀察 原理:主要菌種是醋酸桿菌(異養(yǎng)需氧型) ①當氧氣糖源均充足時,糖→醋酸 ②當氧氣充足、缺少糖源時,乙醇→乙醛→醋酸 溫度:30℃~35℃。 注意:需適時通入空氣 高考警示: ①由于醋酸菌和乳酸菌屬于原核生物,所以在利用者兩類微生物時,其環(huán)境中一定不能參加抗生素。 ②酵母菌在營養(yǎng)和氧氣充足時進展出芽生殖 選修1?生物技術(shù)實踐?知識歸納圖解 微生物的實驗室培養(yǎng)
4、 〔一〕培養(yǎng)基的 基本知識 1.培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分 營養(yǎng)物質(zhì) 定義 作用 主要來源及所涉及的微生物 碳源 但凡能提供微生物所需碳元素的物質(zhì) 構(gòu)成生物細胞、生物體及細胞代謝產(chǎn)物,有些能為異養(yǎng)生物提供能源 無機化合物:C02、NaHC03等(自養(yǎng)生物) 有機化合物:糖類、脂質(zhì)、花生粉餅、石油等(異養(yǎng)生物) 氮源 但凡能提供微生物所需氮元素的物質(zhì) 合成蛋白質(zhì)、核酸及含氮的代謝產(chǎn)物,也可為異養(yǎng)微生物提供能源 無機化合物:N2、NH3、銨鹽、硝酸鹽,自養(yǎng)生物有機化合物:尿素、牛肉膏、蛋白胨等,異養(yǎng)生物 水分 生物體內(nèi)含量最高的組成成分,分為結(jié)合水和自由水 良好的溶劑、細
5、胞生活及生化反響的介質(zhì)、參與物質(zhì)運輸及參與生化反響的反響物 培養(yǎng)基、大氣、代謝產(chǎn)物 無機鹽 為微生物提供大量除C、H、0以外的各種元素 細胞組成成分,生命調(diào)節(jié)物質(zhì),自養(yǎng)菌的能源或其他營養(yǎng)來源,酶的激活劑 培養(yǎng)基、大氣等環(huán)境 生長因子 微生物正常生長繁殖,必不可少的微量有機物 可作為酶與核酸等的組成成分 維生素、氨基酸、堿基等 高考警示鐘 自養(yǎng)微生物與異養(yǎng)微生物所需的營養(yǎng)物質(zhì)不同 (1)自養(yǎng)微生物所需的碳源、氮源來自含碳、含氮的無機物,而異養(yǎng)微生物需要的碳源、氮源來自含碳、含氮的有機物,因此可根據(jù)培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)判斷微生物的代謝類型。 (2)含氮無機物不但能給自養(yǎng)微生物
6、提供氮源,也能作為能源物質(zhì),提供能量,如NH3既作為硝化細菌的氮源也作為能源。 2.培養(yǎng)基的配制原那么 (1)目的明確。要根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的等選擇原料、配制培養(yǎng)基。 (2)營養(yǎng)要協(xié)調(diào)。各種營養(yǎng)物質(zhì)要保證適當?shù)臐舛群捅壤?。營養(yǎng)物質(zhì)比例過低,不能滿足微生物生長;濃度過高那么會抑制微生物的正常生長。營養(yǎng)物質(zhì)的濃度比(如C/N)還會直接影響某些微生物的代謝產(chǎn)物,如谷氨酸生產(chǎn),C/N=4∶1時,菌體大量繁殖,谷氨酸產(chǎn)量少;而C/N=3∶1時,菌體繁殖受抑制,但谷氨酸合成量大。 (3)pH要適當。不同微生物生長所需pH不同。如細菌pH保持在6.5~7.5之間;放線菌保持在7.5
7、~8.5之間;真菌應(yīng)保持在5.0~6.0之間。 3.培養(yǎng)基的分類及作用:培養(yǎng)基種類很多,作用也不同。根據(jù)不同的分類標準,可將培養(yǎng)基分為不同種類。 劃分標準 培養(yǎng)基種類 特點 用途及實例 物理性質(zhì) 液體培養(yǎng)基 不加凝固劑 工業(yè)生產(chǎn) 半固體培養(yǎng)基 加凝固劑,如:瓊脂 觀察微生物的運動、分類鑒定、保藏菌種 固體培養(yǎng)基 微生物別離、鑒定、活菌計數(shù)、 化學成分 天然培養(yǎng)基 含化學成分不明確的天然物質(zhì) 工業(yè)生產(chǎn) 合成培養(yǎng)基 培養(yǎng)基成清楚確(用化學成分的化學物質(zhì)配成) 分類、鑒定 用途 選擇培養(yǎng)基 培養(yǎng)基中參加某種化學物質(zhì),以抑制不需要的微生物的生長,促進所需
8、要的微生物的生長 培養(yǎng)、別離出特定微生物(如:培養(yǎng)酵母茵或霉菌,可在培養(yǎng)基中參加青霉素;培養(yǎng)金黃色葡萄球菌,可在培養(yǎng)基中參加高濃度食鹽) 鑒別培養(yǎng)基 根據(jù)微生物的代謝特點,在培養(yǎng)基中參加某種指示劑或化學藥品 鑒別不同種類的微生物,如可用伊紅一美藍培養(yǎng)基鑒別飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌(假設(shè)有,茵落呈深紫色,并帶有金屬光澤) 說明:①病毒為非細胞構(gòu)造的生物體,專營活細胞寄生,目前不能利用人工培養(yǎng)基來培養(yǎng),需接種在動植物組織中才能增殖。常用于培養(yǎng)病毒的是活雞胚。 ②參加培養(yǎng)基中的凝固劑(如瓊脂),一般不能被微生物利用,只起到凝固作用。 ③選擇培養(yǎng)基一般只生長具有特定的微生物,鑒別培
9、養(yǎng)基可以存在其他微生物,而且能鑒別特定的微生物。 注意:選擇培養(yǎng)基的選擇方法 (1)在培養(yǎng)基中參加某種化學物質(zhì)。例如,參加青霉素可以別離出酵母菌和霉菌;參加高濃度的食鹽可以得到金黃色葡萄球菌。這里的參加是在主要營養(yǎng)成分完整的基礎(chǔ)上參加。 (2)改變培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分。例如缺乏氮源時可以別離出固氮微生物;石油作為惟一碳源時,可以別離出消除石油污染的微生物。 (3)改變微生物的培養(yǎng)條件。例如,將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境下培養(yǎng),可以得到耐高溫的微生物。 〔二〕滅菌技術(shù) 1.無菌技術(shù)的概念 在微生物培養(yǎng)中,獲得純潔培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌入侵,其主要技術(shù)是無菌操作。無菌技術(shù)是指通過一
10、定物理、化學的手段,防止實驗室培養(yǎng)物被外來微生物污染。無菌技術(shù)主要圍繞如何防止雜菌污染展開的。 2.消毒、滅菌的方法 工程 概念 常用方法 應(yīng)用范圍 消毒 使用較為溫和的物理或化學方法,僅殺死物體外表或內(nèi)部一局部對人體等有害的微生物(不包括孢子和芽孢) 巴氏消毒法:70~75℃水中煮30min或在80℃水中煮15min 一些不耐高溫的物體如牛奶 煮沸消毒法:在100℃水浴中煮沸5~6 min 一般物品 化學藥劑消毒法:用乙醇、氯氣、漂白粉、KMnO4等藥劑來殺死或抑制細菌生長或繁殖 可用來對環(huán)境、雙手和衣物等消毒 紫外線消毒法:30W紫外燈照射30min
11、接種室 滅菌 使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物,包括芽孢和孢子 灼燒滅菌法:酒精燈火焰 接種工具如接種環(huán)、接種針等 干熱滅菌法:在160~170℃加熱1~2h 如玻璃器皿(吸管、培養(yǎng)皿)和金屬用具 高壓蒸汽滅菌:壓力為100 kPa,溫度為12l℃的條件下,維持15~30 min 培養(yǎng)基及容器的滅菌 注意: ①無菌操作是微生物培養(yǎng)過程中,防止雜茵污染的關(guān)鍵步驟。 ②消毒只能消滅或抑制營養(yǎng)體的活動,而不能到達徹底滅菌。酒精消毒用體積分數(shù)為70%的酒精效果最好,因濃度過高,會使菌體外表蛋白凝固成一層保護膜,乙醇分子不能進入其中;濃度過低,殺菌力減弱。而滅菌除殺死營養(yǎng)
12、體外,還必須殺死芽孢和孢子。 ③滅菌消毒的原理,就是通過一定理化手段,使病原茵蛋白質(zhì)變性,失去生命活性。 〔三〕微生物的純化培養(yǎng)技術(shù) 1.常用細菌培養(yǎng)基——蛋白胨培養(yǎng)基配制流程: 計算 稱量 溶化 滅菌 注意:據(jù)配方計算配制一定體積培養(yǎng)基時各成分的用量 注意: ①倒平板時,燒杯口要通過酒精燈火焰滅菌。 ②平板冷凝后要將平板倒置,以確保拿放方便,同時防止水分蒸發(fā),以利微生物生長,也可防止皿蓋上凝結(jié)的水滴滴入培養(yǎng)基,影響pH;其次防止細菌透過皿底、皿蓋的縫隙,落在培養(yǎng)基上。 ③倒平板時,不能將培養(yǎng)基濺在皿底與皿蓋之間,以防止雜菌滋生,污染培養(yǎng)基 〔調(diào)PH〕 倒平板
13、 注意: ①牛肉膏較粘稠,應(yīng)玻棒挑取,在稱量紙上稱量 ②牛肉膏蛋白胨易吸潮,動作要迅速 注意: ①溶化瓊脂時要控制火力的大小并不斷攪拌,以免培養(yǎng)基溢出或燒焦; ②加熱過程中局部水分蒸發(fā),待瓊脂完全溶化后應(yīng)補加蒸餾水,以保持溶液的濃度 注意: 由于不同微生物適宜的pH不同,因此在熔化后,必須用NaOH或HCl來調(diào)節(jié)pH 裝瓶 注意:分裝至試管時培養(yǎng)基的高度不要超過試管高度的1/5 注意: ①可用高壓蒸汽滅菌法 ②用干熱滅菌法時溫度160~170℃ (不能超過180℃,否那么易引起報紙等燃燒) ③一般是培養(yǎng)基先滅菌再倒平板,也可先倒平板,再滅菌
14、 2.純化大腸桿菌 Ⅰ.原理:在培養(yǎng)基上將細菌稀釋或分散成單個細胞,使其長成單個的菌落,這個菌落就是純化的細菌菌落。 Ⅱ.微生物接種方法: (1)平板劃線法:平板劃線法中細胞的別離和稀釋過程發(fā)生在接種環(huán)在固體平板外表上的劃線和移動過程中。在線的開場局部,微生物往往連在一起生長,隨著線的延伸,菌數(shù)逐漸減少,最后可能形成純種的單個菌落。(如圖) (2)稀釋涂布平板法:10倍系列稀釋操作 劃線操作時注意: 〔1〕用接種環(huán)取菌種之前、每次劃線之前和劃線完畢都要進展灼燒滅菌,灼燒后要在酒精燈附近冷卻后再操作;(第一次操作:殺死接種環(huán)上原有的
15、微生物。每次劃線之前:殺死上次劃線后接種環(huán)上殘留的菌種,使下次劃線的菌種直接來源于上次劃線的末端。劃線完畢后:殺死接種環(huán)上殘存的菌種,防止細菌污染環(huán)境和感染操作者) 〔2〕劃線時不要劃破培養(yǎng)基,如果采用分段劃線法操作從第二次操作應(yīng)總在上一次劃線末端開場,首尾區(qū)不能相連; 〔3〕操作必須始終在酒精燈火焰旁進展。 涂布操作時注意: 〔1〕配制系列梯度稀釋液時,所用的試管和移液管均需滅菌,必須用無菌水配制; 〔2〕涂布器用70%的酒精消毒,多余酒精在燒杯中滴盡,沾有少量酒精的涂布器在酒精燈火焰引燃。不要將過熱的涂布器放入盛有酒精的燒杯中,一面引燃其中的酒精; 〔3〕配制系列梯度稀釋液和轉(zhuǎn)
16、移菌液以及涂布過程等必須都在酒精燈火焰旁進展,移液管頭不能接觸任何物體。 3.菌種的保存 ①對于頻繁使用的菌種,可以采用臨時保藏的方法。 ②對于需要長期保存的菌種,可以采用甘油管藏的方法。 注意:①菌種保藏的原理是:低溫、枯燥和隔絕空氣,使微生物代謝能力和繁殖能力降低。 ②不同菌種的保藏方法因不同菌種而異。需氧型,必須低溫有氧,而厭氧型必須低溫無氧;腐生微生物可提供牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,而寄生微生物需提供活體組織等非人工培養(yǎng)基,如病毒需提供活雞胚。 〔三〕微生物的篩選與計數(shù)〔以“土壤中分解尿素的細菌〞為例〕 篩選菌株 原那么:人為提供有利于目的菌生長的條件,同時抑制或阻止
17、其他微生物的生長 培養(yǎng)基的成分:尿素作為惟一的氮源(選擇培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基) 菌落計數(shù) 菌種的鑒定 對照:將不接種的培養(yǎng)基置于一樣溫度恒溫箱培養(yǎng)(目的:證實培養(yǎng)基是否被雜菌污染) 統(tǒng)計茵落數(shù)目的方法: (1)顯微鏡直接計數(shù)法 ①原理:利用特定細菌計數(shù)板或血細胞計數(shù)板,在顯微鏡下計算一定容積樣品中微生物數(shù)量 ②方法:用計數(shù)板計數(shù)。③缺點:不能區(qū)分死菌與活菌。 (2)間接計數(shù)法(活菌計數(shù)法) ①原理:當樣品的稀釋度足夠高時,培養(yǎng)基外表生長的一個菌落,來源于樣品稀釋液中的一個活菌,通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù),就能推測出樣品中大約含有多少活菌。 ②計算公式:每克樣品中的菌株數(shù)=(C÷
18、V)×M,其中,C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù),V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL),M代表稀釋倍數(shù)。 ③操作:設(shè)置重復組,增強實驗的說服力與準確性。同時為了保證結(jié)果準確,一般選擇菌落數(shù)在30~300的平板進展計數(shù)。 方法:檢測培養(yǎng)基pH的變化判斷 原理:在細菌分解尿素時,分泌的脲酶將尿素分解為氨,氨使培養(yǎng)基堿性增高,pH升高 菊花的組織培養(yǎng) 制備MS培養(yǎng)基 外植體消毒 接種 成分:無機物(大量元素、微量元素)、有機物:糖類(最常使用的糖是蔗糖,提供能源和維持滲透壓)、維生素、氨基酸
19、、有機添加劑〔生長因子〕、激素 pH:5.8左右 滅菌:高壓蒸汽滅菌 注意: ①為降低工作量、減少誤差,可通過配制母液,到達一次稱量藥品、屢次使用。 ②配制培養(yǎng)基時,母液的應(yīng)用應(yīng)先搖勻,移液用的移液管或量筒需清洗兩次,以免造成誤差。 培養(yǎng) 試管苗 愈傷組織 胚狀體(或不定芽) 脫分化 再分化 移栽(煉苗) 栽培 材料:植物的種類、年齡、保存時間 消毒原因:大局部來自田間,帶有大量病毒、細菌 菊花莖段消毒:所用消毒劑為體積分數(shù)為70%的酒精和質(zhì)量分數(shù)為0.1%的氯化汞溶液,所使用的清洗液是無菌水。 注意:不同植株或同一植株的不同部位,所選用的消毒劑種類及
20、濃度可能不同; 方法:始終在酒精燈火焰旁進灼燒滅菌。 注意:將菊花莖段插入培養(yǎng)基時不要倒插 溫度:18~22℃ 光照:在初期菊花的組織培養(yǎng)需光照,月季的花藥培養(yǎng)不需光照(有利愈傷組織形成),二者后期均需要光照(有利葉綠素形成和光合作用) 注意:生長素和細胞分裂素的使用 使用順序不同→結(jié)果不同 (先生長素,后細胞分裂素:有利于細胞分裂,但不分化 先細胞分裂素,后生長素:細胞既分裂也分化 同時使用: 分化頻率提高) 用量比例不同→發(fā)育方向不同 (高:利用根的分化,抑制芽的形成 低:利用芽的分化,抑制根的形成 適中:
21、促進愈傷組織的生長) 注意:培養(yǎng)一株完整的試管苗,必須先進展生芽培養(yǎng),然后進展生根培養(yǎng),如果順序顛倒,先誘導生根,就不好誘導生芽了。 原因:因試管苗光合作用能力低,對不良環(huán)境耐受力差,一定要在保溫、保濕一段時間以增強適應(yīng)力 方法:流水清洗根部,移栽至消過毒的蛭石或珍珠巖環(huán)境培養(yǎng) 脫分化階段只分裂; 再分化階段既有分裂也有分化 人工種子制備階段 原理:細胞的全能性(高度分化的植物細胞,仍具有發(fā)育為完整個體的潛能) (1)原因:體細胞攜帶有本物種全部的遺傳信息 (2)實現(xiàn)的條件:離體狀態(tài)和適宜條件(水分、無機鹽、有機營養(yǎng)及激素、溫度、pH等) (3)細胞
22、的全能性大小與細胞種類的關(guān)系: ①受精卵>生殖細胞>體細胞;植物細胞>動物細胞;分化程度低的細胞>分化程度高的細胞 ②一般的,離體的植物細胞的全能性在一定條件下可充分地表達出來。 ③離體的動物細胞的全能性受到限制,但其細胞核的全能性借助卵細胞的細胞質(zhì)可表達出來。 ④未離體的細胞的全能性不能表達,只是在機體的調(diào)控下進展定向分化。 果膠酶在果汁生產(chǎn)中的作用 一、果膠酶的組成和作用:包括多聚半乳糖醛酸酶、果膠分解酶、果膠酯酶等。果膠酶能分解果膠,瓦解植物的細胞壁及胞間層
23、。其實質(zhì)是果膠分解成可溶性的半乳糖醛酸。 注意:①果膠酶是分解果膠的一類酶的總稱,不是一種酶。 ②植物、霉菌、酵母菌等細胞均能產(chǎn)生果膠酶,但通常動物細胞不產(chǎn)生果膠酶。 ③在植物細胞工程中,應(yīng)用纖維素酶和果膠酶來破壞細胞壁,獲得原生質(zhì)體。 二、探究溫度對果膠酶活性的影響 (1)實驗原理:果膠酶活性受溫度影響,處于最適溫度時,活性最高;低于或高于最適溫度,酶活性受到抑制。即果肉的出汁率、果汁的澄清度與果膠酶的活性大小成正比。 (2)設(shè)計思路:設(shè)置一系列梯度溫度,從中選出酶活性最高的溫度,然后再以該溫度為中心,縮小溫度梯度向兩個方面各設(shè)置梯度溫度,以進一步確定最適溫度范圍。所選擇
24、的溫度只能接近最適溫度,但不一定就是最適溫度。 (3)實驗操作流程及本卷須知 制備水果泥 注意:蘋果、橙子和葡萄等水果都可以作為反響物,水果不用去皮。如用蘋果為原材料,一般可按每個中等大小的蘋果加水100~200 mL的比例進展攪拌,獲得稀的蘋果泥 制備果膠酶 水果泥、果膠酶分別水浴保溫 水果泥、果膠酶混合水浴保溫 記錄果汁量 自變量:溫度(應(yīng)控制為唯一) 對照:相互對照 無關(guān)變量:果泥量、果膠酶的濃度和用量、水浴時間和混合物的pH等所有其他條件(應(yīng)控制為一樣) 設(shè)計實驗方案 確定溫度梯度→探討控制溫度的方法和措施 確定水果的種類→確定
25、制備果汁的方法→確定實驗用的水果量→確定果膠酶的量→探討測定果膠酶活性的方法 動手實驗 過濾出果汁 改變不同溫度后重復上面實驗(也可同時進展不同溫度的實驗) 記錄實驗數(shù)據(jù) 得出結(jié)論 記錄表格設(shè)計 溫度/℃ 10 20 30 40 50 60 果汁量/mL 原因:將果泥和果膠酶分裝在不同的試管中恒溫處理,可以保證底物和酶在混合時的溫度是一樣的,防止了果泥和果膠酶混合時影響混合物的溫度,從而影響果膠酶活性的問題 原因:讓果泥和果膠酶有充分的反響時間 通過測定濾出的蘋果汁的體積大小來判斷果膠酶活性的上下原因: 果膠酶將果膠分解為小分子物質(zhì),小分子物質(zhì)可
26、以通過濾紙,因此蘋果汁的體積大小反響了果膠酶的催化分解果膠的能力。在不同的溫度和pH下,果膠酶的活性越大,蘋果汁的體積就越大 注意:過濾果汁時漏斗中應(yīng)放置濾紙 注意:①每個探究實驗的設(shè)計,都要遵循實驗設(shè)計的一般原那么,特別是單因子變量控制原那么。 ②每個探究實驗的設(shè)計思路希是大梯度差值尋找最適范圍,再小梯度差值選出最適溫度、pH或酶用量。 ③如果隨酶濃度增加,果汁體積也增大,說明酶用量缺乏;當酶用量達一定值時,再增加酶用量,果汁體積不變,那么說明這個值就是酶的最適用量。 ④如果變量(溫度、pH、酶濃度)梯度無法滿足實驗,即出現(xiàn)過高、過低等現(xiàn)象
27、,那么應(yīng)及時調(diào)整實驗。 血 紅 蛋 白 的 提 取 和 分 離 一、實驗原理:蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì):形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別,由此提取和別離各種蛋白質(zhì)。 1.凝膠色譜法〔分配色譜法〕: 〔1〕原 理:分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙,路程短,流動快;分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部,路程長,流動慢。 〔2〕凝膠材料:多孔性,多糖類化合物,如葡聚糖、瓊脂糖。 〔3〕別離過程:混合物上柱→洗脫→大分子流動快、小分子流動慢→收集大分子→收集小分子洗脫:從色譜柱上端不斷注入緩沖液,促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。 〔4〕作用:別離蛋白質(zhì),
28、測定生物大分子分子量,蛋白質(zhì)的脫鹽等。 2.緩沖溶液 〔1〕原理:由弱酸和相應(yīng)的強堿弱酸鹽組成〔如H2CO3-NaHCO3, NaH2PO4/Na2HPO4等〕,調(diào)節(jié)酸和鹽的用量,可配制不同pH的緩沖液。 〔2〕緩沖液作用:抵抗外界酸、堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。 3.凝膠電泳法: 〔1〕原 理:不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同,在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同,導致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同。 〔2〕別離方法:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。 〔3〕別離過程:在一定pH下,使蛋白質(zhì)基團帶上正電或負電;參加帶負電荷多的SDS,形
29、成“蛋白質(zhì)-SDS復合物〞,使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。 二、實驗步驟及本卷須知 血紅蛋白的釋放 過程:①采集血樣(加檸檬酸鈉防止血液凝固)→②低速短時離心(防止白細胞沉淀)→③吸取血漿→④生理鹽水洗滌(防紅細胞破裂)→緩慢攪拌(防止紅細胞破裂釋)⑤低速短時離心→⑥重復洗滌三次→⑦上清液中無黃色,說明紅細胞已洗滌干凈。 目的:除去雜蛋白 紅細胞 的洗滌 過程:加蒸餾水→加40%體積的甲苯→磁力攪拌器攪拌 目的:紅細胞破裂,釋放出血紅蛋白 注意:參加蒸餾水后紅細胞液體積與原血液體積要一樣。參加甲苯的目的是溶解細胞膜,有利于血紅蛋
30、白的釋放和別離 別離血紅 蛋白溶液 過程:離心〔2000r/min〕 目的:別離血紅蛋白和其他雜質(zhì) 結(jié)果 第1層(最上層):甲苯層(無色透明) 第2層(中上層):脂溶性物質(zhì)的沉淀層(白色薄層固體) 第3層(中下層):血紅蛋白的水溶液層(紅色透明液體) 第4層(最下層):雜質(zhì)的沉淀層(暗紅色) 透 析 原理:透析袋能使小分子自由進出,而將大分子保存在袋內(nèi) 過程:血紅蛋白溶液裝入透析袋→將透析袋放入磷酸緩沖液中→透析12h 目的:除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)或用于更換樣品的緩沖液 1.樣品處理 2.粗別離 3.純 化 調(diào)節(jié)緩
31、沖液面 翻開色譜柱下端的流出口,使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊,關(guān)閉出口 參加蛋白質(zhì)樣品 調(diào)節(jié)緩沖液面 洗 脫 收集分裝蛋白質(zhì) 4.純度鑒定 凝膠色譜柱 裝填 步驟:固定(色譜柱垂直固定在支架)→裝填(將凝膠懸浮液一次性裝填) →洗滌(目的:使凝膠裝填嚴密) 要求:嚴密、均勻(否那么,會在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙,使本該進入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過,攪亂洗脫液的流動次序,影響別離的效果) 裝填成功檢測:①凝膠是一種半透明的介質(zhì),可在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈,檢查凝膠是否裝填得均勻。 ②參加大分子的有色物質(zhì),觀察色帶移動是否均勻、狹窄、平整
32、。如紋路或是氣泡,輕輕敲打柱體以消除氣泡,否那么重新裝柱。 用吸管將透析后的樣品沿管壁環(huán)繞移動加到色譜柱的頂端。加樣后,翻開下端出口,使樣品滲入凝膠床內(nèi),等樣品完全滲入凝膠層后,關(guān)閉出口 參加20mmol/L的磷酸緩沖液到適當高度 連接緩沖液洗脫瓶,翻開下端出口,進展洗脫 方法:待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時,用試管收集 檢測別離是否成功:如果凝膠色譜柱裝填得很成功、別離操作也正確的話,能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整,隨著洗脫液緩慢流出;如紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬,說明別離的效果不好,這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān) SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(選做)
33、 胡 蘿 卜 素 的 提 取 一、胡蘿卜素基礎(chǔ)知識 1.原理:根據(jù)胡蘿卜素易溶于有機溶劑的特點,可采取有機溶劑萃取的方法來提取胡蘿卜素。即將粉碎、枯燥的植物原料用有機溶劑浸泡,使胡蘿卜素溶解在有機溶劑中,再蒸發(fā)出有機溶劑可獲得。 2.萃取劑的選擇 〔1〕有機溶劑的分類:分為水溶性〔如乙醇和丙酮〕和水不溶性〔如石油醚、乙酸乙酯、乙醚、苯、四氯化碳〕兩類。多數(shù)對人體有一定毒性。 〔2〕選取萃取胡蘿卜素的有機溶劑的原那么 ①具有較高的熔點,能夠充分溶解胡蘿卜素,并且不與水混溶;②萃取效率高;③對人無毒
34、、不易燃、易與產(chǎn)品別離、不影響產(chǎn)品質(zhì)量 萃取胡蘿卜素的有機溶劑應(yīng)該具有較高的沸點,能夠充分溶解胡蘿卜素且不與水混溶。另外,還要考慮對人體是否有毒性等安全問題。因乙醚的沸點較低,苯和四氯化碳對人體有毒性,所以本實驗選用石油醚或乙酸乙酯作為萃取劑。 胡蘿卜 粉碎 目的:便于胡蘿卜素能充分溶解 注意:顆粒要小 枯燥 萃取 過濾 濃縮 胡蘿卜素 目的:除去水分 注意:控制溫度、時間 目的:使胡蘿卜素充分溶解 注意:①不能明火加熱 ②冷凝回流,防萃取液揮發(fā) 影響因素:主要是萃取劑的性質(zhì)和量;其次是原料顆粒的大小、嚴密程度、含水量、萃取的溫度、萃取時間的長短等 目的:
35、除去顆粒等雜質(zhì) 目的:除去有機溶劑 裝置:蒸餾裝置 注意:①不能明火加熱 ②收集瓶口可用錫箔或牛皮紙遮蓋 胡蘿卜素粗品的鑒定 方法:紙層析法, 原理:混合物各組分在層析液中的溶解度不同,隨層析液在濾紙上的擴散速度不同,溶解度大的隨層析液在濾紙上的擴散速度快,反之那么慢,這樣,同一種物質(zhì)在濾紙上的擴散速度一樣,最終位置也一樣。 流程:量作基線:下端距底邊2cm處劃基線,在基線上取A、B、C、D四個點 對照點樣:在A、D點點標準樣品,B、C點點提取樣品 枯燥層析:吹干濾紙溶劑,放入層析容器中層析 比照觀察:比照觀察樣品色素點與標準色素點的異同。 結(jié)果分析:如果萃取樣品中出現(xiàn)了和標準樣品一樣的層析帶,說明提取胡蘿卜素的實驗成功。由于提取物中含有雜質(zhì),萃取樣品的顏色可能比標準樣品的顏色淺,我們也可以通過顏色的比較,初步確定提取的胡蘿卜素的量。 注意: ①選擇枯燥的濾紙,為防止操作時濾紙的污染,應(yīng)盡量防止用手直接接觸濾紙,可以戴手套進展操作 ②點樣時應(yīng)注意點樣斑點不能太大(直徑應(yīng)小于0.5cm),如果用吹風機吹干,溫度不宜太高,否那么斑點會變黃 ③卷紙時注意濾紙兩邊不能互相接觸,以免因毛細現(xiàn)象導致溶劑沿濾紙兩邊的移動加快,溶劑前沿不齊,影響效果 二、操作流程及注意: 。
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