基因工程技術(shù) 筆記整理

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1、基因工程技術(shù)：按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)移等技術(shù)，有目的地改造生物種性，使現(xiàn)有物種在較短的時(shí)間內(nèi)趨于完善，創(chuàng)造出新的生物類型。質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子cccDNA，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中，它具有自主的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有二種：緊密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在細(xì)胞周 期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，通常每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有一個(gè)或幾個(gè)質(zhì) 粒分子；后者在整個(gè)細(xì)胞周期中隨時(shí)可以復(fù)制，在每個(gè)細(xì)胞中 有許多拷貝。質(zhì)粒的不相容性：

2、利用共同復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中共存。從細(xì)胞中分離質(zhì)粒DNA 的方法都包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。溶菌酶：破壞菌體細(xì)胞壁；SDS和Triton X-100：使細(xì)胞膜裂解。染色體DNA 通常用于構(gòu)建基因組文庫和Southern雜交等?；蚪MDNA的提取植物基因組DNA提取：提取緩沖液（Tris.Cl 保持pH,EDTA,NaCl,SDS），氯仿/戊醇/乙醇溶液沉淀和抽提DNA，異丙醇沉淀DNA（提染色體），TE（Tris.Cl,EDTA）-溶解DNA，RNase保存液，降解RNA，NaAC加鹽，70%乙醇漂洗。細(xì)菌基因組DNA提?。篠

3、DS，蛋白酶K，氯仿：異戊醇（24：1）- 沉淀DNA，苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）- 抽提，70%乙醇漂洗，TE,NaCl調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，RNase A，CTAB/NaCl 溶液CTAB-一種陽離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，異丙醇/無水乙醇沉淀上清液。總RNA制備mRNA的分子結(jié)構(gòu)容易受到RNA酶的攻擊反應(yīng)而降解，加上RNA 酶極為穩(wěn)定而且廣泛存在，因此，在提取過程中應(yīng)嚴(yán)格防止RNA 酶的污染并設(shè)法抑制其活性，這是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。儀器玻璃器皿：200烘2h，塑料器皿：DEPC水液處理所有器皿最后硅烷化處理。RNA酶抑制劑：DEPC-強(qiáng)烈但不徹底，與氨水溶

4、液混合會(huì)產(chǎn)生致癌物；異硫氰酸胍-最有效，使RNA酶失活；其他- RNA酶蛋白抑制劑（RNasin）SDS, 尿素等。細(xì)胞內(nèi)總RNA制備方法：異硫氰酸胍熱苯酚法、酚/SDS法、Trizol法。（均先將組織在液氮中研磨成粉末）異硫氰酸胍熱苯酚法：異硫氰酸胍(GIT)與巰基乙醇共同作用抑制RNase的活性，GIT與 十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl)作用使蛋白質(zhì)變性。酚/SDS法：用酚和SDS破碎細(xì)胞和去除蛋白質(zhì)，用LiCl選擇沉淀RNA以去除DNA和其它不純物。Trizol法：Trizol試劑（含酚、異硫氰酸胍和溶解劑等）。mRNA提取制備mRNA原理：分離的總RNA 可利用mRNA3端含有po

5、ly(A)的特點(diǎn)，用oligo(dT)纖維素柱分離，當(dāng)RNA流經(jīng)oligo(dT)纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上，然后逐漸降低鹽濃度洗脫，在低鹽溶液或蒸餾水中，mRNA被洗下。然后經(jīng)過兩次oligo（dT）纖維素柱，可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70可保存一年以上。（上樣buffer和洗脫buffer）。溶液中無鹽時(shí)要沉淀RNA，必須加鹽NaAC。瓊脂糖凝膠電泳DNA凝膠電泳：瓊脂糖- 分離DNA片段大小范圍廣；聚丙烯酰胺- 小片段，分辨力高。瓊脂糖凝膠電泳特性：1.DNA分子大小：DNA分子在一定瓊脂糖濃度下的遷移率；2

6、.瓊脂糖濃度：1.0-1.2%；3.DNA分子構(gòu)象：超螺旋DNA最快，線狀雙鏈最慢；4.電源電壓：不大于5V/cm，負(fù)正；5.染料：溴化乙錠（EB）-強(qiáng)誘變劑；6.離子強(qiáng)度：0.5*TBE（不能過高，避免buffer發(fā)燙）。RNA凝膠電泳：RNA分子有很多二級(jí)結(jié)構(gòu)，需經(jīng)變性劑處理，可以破壞RNA中的二級(jí)結(jié)構(gòu)。然后，用瓊脂糖凝膠電泳可分級(jí)分離不同大小的mRNA分子。RNA瓊脂糖凝膠電泳方法有三種：乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞（劇毒）瓊脂變性電泳。DNA限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶：限制性內(nèi)切酶是指能特異性結(jié)合于一段被稱為限制性識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異性位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA

7、。I類酶：結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA；II類酶：由二種酶分子組成的二元系統(tǒng)（核酸酶切割、甲基化酶修飾），其識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)是同一位置；III類酶：在識(shí)別位點(diǎn)之外切割DNA 分子，然后從底物上解離。甲基化：保護(hù)DNA分子，越活躍的地方，甲基化程度越低。切割性能：回文對(duì)稱特異核苷酸序列、平末端DNA片段、粘性末端。酶單位：在合適緩沖液和反應(yīng)溫度下，在20ul反應(yīng)體積中一小時(shí)內(nèi)完全降解1mg DNA 所需要的量。載體：把一個(gè)有用的目的 DNA片段通過重組DNA 技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工具。常見載體：質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、BAC、YAC等。質(zhì)粒載體的特性：分子量小、

8、多拷貝、松弛控制型；具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點(diǎn)；能插入較大的外源DNA片段；具有容易操作的檢測(cè)表型。pBR322、pUC18/19（分子量更小、-互補(bǔ)原理藍(lán)白篩選、多克隆位點(diǎn)區(qū)MCS）、pBluescript SK(+/-)（MCS）。乳糖操縱子：-互補(bǔ)原理：lacZ（-半乳糖苷酶基因）基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酶陰性突變體之間可以實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)的現(xiàn)象。藍(lán)白斑篩選：X-gal-IPTG（乳糖類似物誘導(dǎo)劑）-藍(lán)色吲哚產(chǎn)物（當(dāng)外源片段插入后，失去-互補(bǔ)能力，因而不產(chǎn)生-半乳糖苷酶，無法分解培養(yǎng)基中的乳糖，菌落呈白色）。 噬菌體：侵染細(xì)菌的病毒（裂解性侵

9、染、溶源性侵染）?！緣A性磷酸酶-活性好, 但較抗熱和去污劑,在去磷酸化反應(yīng)后很難去除】 細(xì)胞轉(zhuǎn)化（transformation）是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段（E.coli）?！救缧鑼①|(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)胞，需誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA.】 感受態(tài)細(xì)胞：受體細(xì)胞經(jīng)一些特殊方法（如CaCl2、RbCl（KCl）等化學(xué)試劑）處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的細(xì)胞狀態(tài)?！綥B培養(yǎng)基不含Amp，設(shè)2個(gè)對(duì)照（防污染）】 提高轉(zhuǎn)化效率的因素：細(xì)胞生長狀態(tài)和密度（剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期）、質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度（DNA溶液體積不超

10、過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%）、試劑質(zhì)量（最高純度）、防止雜菌和雜DNA污染（無菌器皿）。PCR技術(shù)的3個(gè)步驟：變性：目的雙鏈DNA在94下解鏈；退火：兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度（50左右）下雨模板上的目的序列通過氫鍵配對(duì)；延伸：TaqDNA聚合酶合成DNA的最適溫度下，以目的DNA為模板進(jìn)行合成。PCR反應(yīng)5要素：引物、模板、酶、dNTPs和Mg2+ 引物設(shè)計(jì)原則：1.引物長度：（20bp）；2.引物擴(kuò)增跨度：2kb左右最有效；3.引物堿基：G+C含量40-60%為宜，ATGC分布均勻，不要集中；4、避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)；5.引物3端的堿基：嚴(yán)格要求配對(duì)；6.引物中有或能加

11、上合適的酶切位點(diǎn)；7.引物的特異性：與其他序列無明顯同源性；8.擴(kuò)增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)（以免產(chǎn)生非特異性）；9.引物量：濃度要控制。模板：可以是DNA或RNA，可以是線狀或環(huán)狀。TaqDNA聚合酶：活性半衰期為92.5（最后加入）。dNTPs：質(zhì)量、濃度與PCR擴(kuò)增效率有關(guān)，應(yīng)保存得當(dāng)，不好凍融，最好分裝。Mg2+：對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著影響，濃度過高，特異性降低，出現(xiàn)非特異性；過低，降低TaqDNA聚合酶活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。反應(yīng)緩沖液：Tris.Cl，KCl，和適當(dāng)濃度的Mg2+。（BSA、DDT）PCR反應(yīng)條件：溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。溫度：變性：94，退火：Tm= 4(G+

12、C)2(A+T)，值約低5，延伸：72。循環(huán)次數(shù)：25-30循環(huán)?！綪CR常見問題：無擴(kuò)增產(chǎn)物、非特異性擴(kuò)增、拖尾、假陽性】 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)：技術(shù)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累通過對(duì) PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。 檢測(cè)模式有：Tagman 探針和SYBR Green I檢測(cè)模式。 SYBR Green I 染料方法：是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈 DNA結(jié)合染料，與雙鏈 DNA 結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。熒光閾值：在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值。CT 值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

13、Tagman 探針：是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴(kuò)增相關(guān)。 RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA）：運(yùn)用隨機(jī)引物擴(kuò)增尋找多態(tài)性DNA片段可作為分子標(biāo)記。 原理：利用一系列（通常數(shù)百個(gè)）不同的隨機(jī)排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈（通常為10聚體）為引物，對(duì)所研究基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離，經(jīng)EB染色或放射性自顯影來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性，這些擴(kuò)增產(chǎn)物DNA 片段的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性?！綝NA提取+選擇隨機(jī)引物PCR反應(yīng)凝膠電泳圖譜分析】。缺點(diǎn)：圖譜中某些弱帶重復(fù)性較差，信息量小，有假陽性結(jié)果等等。差別表達(dá)基因分析技術(shù)：1.mRNA 差

14、異顯示技術(shù)（DD） 2.代表性差示分析技術(shù)（RDA）3.抑制性差減雜交技術(shù)（SSH）- 提取目標(biāo)樣和參照樣；將目標(biāo)樣與殘照樣雜交得到產(chǎn)物；合并雜交產(chǎn)物；特異性片段擴(kuò)增 - 該方法能使假陽性率降低到6% 4.交互差減RNA 差別顯示技術(shù)（RSDD）。分子雜交相關(guān)技術(shù)：互補(bǔ)的核苷酸序列通過Watson-Crick堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雜合雙鏈DNA分子的過程稱為雜交。雜交的雙方是所使用的探針和要檢測(cè)的核酸。根據(jù)核酸的性質(zhì)：DNA和RNA探針；根據(jù)是否使用放射性標(biāo)記物：放射性和非放射性標(biāo)記探針；根據(jù)是否存在互補(bǔ)鏈：單鏈和雙鏈；根據(jù)放射性標(biāo)記物摻入情況：均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記。1）雙鏈DNA探針：其合成方法有

15、- 切口平移法和隨機(jī)引物合成法。切口平移法：當(dāng)雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時(shí)，E.coli DNA聚合酶I 就可將核苷酸連接到切口的3羥基末端。通常使用-32PdNTP。隨機(jī)引物合成法：利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段，合成含有標(biāo)記核苷酸的DNA鏈。具有聚合活性，沒有5至3外切酶活性, 稱為Klenow片段。2）末端標(biāo)記DNA探針： 3末端標(biāo)記（利用Klenow片段及T4DNA聚合酶） 和DNA 5末端標(biāo)記（利用T4多核苷酸激酶PNK）。AKP堿性磷酸酶去磷酸化3）單鏈DNA探針：以M13載體衍生序列為模板，用Klenow片段合成；以RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成。4）Di

16、g標(biāo)記的核苷酸分子雜交：分子雜交是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用標(biāo)記的探針和被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或 RNA分子所處的位置。Southern雜交和Northern雜交。Southern雜交：DNA片段經(jīng)電泳分離后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。被檢對(duì)象為DNA，探針為DNA或RNA。步驟：酶切、DNA片段轉(zhuǎn)移、預(yù)雜交、雜交、顯色反應(yīng)。硝酸纖維素濾膜所得的結(jié)果背景較低，但易破裂；尼龍膜較耐用，但所得的結(jié)果背景較高。硝酸纖維素膜結(jié)合DNA依賴高鹽溶液。DNA轉(zhuǎn)移方法：毛細(xì)管轉(zhuǎn)移、真空轉(zhuǎn)移、電泳轉(zhuǎn)移。Northern雜交：RNA片段經(jīng)電

17、泳后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后用探針雜交，被檢對(duì)象為RNA，探針為DNA或RNA。影響雜交的因素：核酸分子的濃度和長度、溫度、封閉試劑、離子強(qiáng)度。變性，酸處理的目的？基因的原核表達(dá)：原核表達(dá)系統(tǒng)由原核表達(dá)寄主菌及原核表達(dá)質(zhì)粒組成，優(yōu)點(diǎn):操作簡單、方便、快速、成本低、產(chǎn)量高、純化容易；缺點(diǎn)：產(chǎn)物多以包涵體形式存在；不含內(nèi)含子，沒有轉(zhuǎn)錄及翻譯后加工過程，表達(dá)產(chǎn)物不能正常修飾；有些表達(dá)的蛋白沒有活性。基因表達(dá)方式：組成型表達(dá)（不停的表達(dá)目的蛋白）、誘導(dǎo)表達(dá)（只有在誘導(dǎo)劑作用下才表達(dá)）、融合表達(dá)（融合表達(dá)標(biāo)簽）、分泌表達(dá)（信號(hào)肽）、可溶性表達(dá)（E.coli）。啟動(dòng)子：RNA聚合酶以很高的親

18、和性結(jié)合在基因調(diào)控區(qū)域的特定位子，起始RNA合成的序列。（-10區(qū)和-35區(qū)）。細(xì)菌RNA聚合酶不能識(shí)別真核基因的啟動(dòng)子，因此原核表達(dá)載體所用的啟動(dòng)子必須是原核啟動(dòng)子。原核表達(dá)系統(tǒng)中常見啟動(dòng)子及其特點(diǎn)：Lac(乳糖啟動(dòng)子)來自E.coli，一段有方向的核苷酸序列，阻止RNA聚合酶的結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄；Trp(色氨酸啟動(dòng)子)-阻遏蛋白必須與色氨酸結(jié)合才有活性，阻止轉(zhuǎn)錄；Tac(乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子)-由Lac和Trp人工構(gòu)建的雜合啟動(dòng)子，受Lac阻遏蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)；PL (噬菌體的左向啟動(dòng)子)-左向轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，受溫度誘導(dǎo)（45）、T7噬菌體啟動(dòng)子-來自T7噬菌體，具有高度特異性，只有T7RNA聚合

19、酶才能使其啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，從而得到表達(dá)。T7啟動(dòng)子完全專一受控于T7RNA聚合酶。特點(diǎn)：啟動(dòng)子的作用要強(qiáng)；需表現(xiàn)低水平的基礎(chǔ)表達(dá)活性；具有簡便和廉價(jià)的可誘導(dǎo)性。終止子：真核基因或操縱子的3端往往有特定的具有終止轉(zhuǎn)錄功能的核苷酸序列。誘導(dǎo)劑：當(dāng)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，使其構(gòu)象發(fā)生變化，從而阻遏蛋白從DNA分子上脫落下來，RNA聚合酶進(jìn)入啟動(dòng)子區(qū)，可誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄。T7表達(dá)系統(tǒng)質(zhì)粒：pET-352、His-Tag(6 x His Tag), pET-41、42、49還含有GST-Tag， kam+ or Amp+ 抗性、His-Tag(6 x His Tag）。pET質(zhì)粒：不移碼，不改變基

20、因的閱讀框架。多克隆位點(diǎn)BamHI。pGEX系：GST（谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶）基因融合表達(dá)質(zhì)粒。Amp+，N-端GST ，Thrombin(凝血酶) or Factor Xa蛋白酶切位點(diǎn)。GST融合表達(dá)蛋白的純化原理：選擇能識(shí)別并特異性結(jié)合GST的特定配體，其中GST的底物谷胱甘肽是較佳的候選對(duì)象，兩者結(jié)合后用還原型谷光苷肽的洗脫緩沖液競爭洗脫表達(dá)蛋白。pBAD系列：His-Tag(6 xHis), Amp+。pDH2：6His tag,Amp+，ColE1復(fù)制起點(diǎn)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。稀有密碼子：有些在真核細(xì)胞中常使用的而在原核細(xì)胞中很少使用的密碼子。 原核表達(dá)中可能遇到的問題及影響因素：基因特性

21、?；蚝∮忻艽a子（無蛋白表達(dá)）、基因GC含量（超過70%會(huì)降低蛋白表達(dá)水平）、基因或蛋白大小（介于5KD和100KD之間）、蛋白親疏水性（親表達(dá)量高，疏難表達(dá)）、基因二級(jí)結(jié)構(gòu)（抑制翻譯的起始）、信號(hào)肽（疏水性或毒性，應(yīng)清除）、表達(dá)蛋白比預(yù)計(jì)的小或用其他小的條帶（提前終止，可低溫誘導(dǎo)、基因改造）、基因毒性（細(xì)胞生長困難，應(yīng)低溫低濃度誘導(dǎo)）、質(zhì)粒不穩(wěn)定性（用低溫高濃度抗生素）、目的mRNA和蛋白不穩(wěn)定而表達(dá)量低（低溫長時(shí)表達(dá)）、包涵體（為變性的表達(dá)蛋白）、培養(yǎng)基pH。表達(dá)不出來時(shí)首先想到換菌株。 構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)，考慮3大因素：表達(dá)載體、宿主菌株、表達(dá)誘導(dǎo)條件。His tag融合蛋白純化的原理：

22、利用蛋白質(zhì)表面的一些氨基酸，如組氨酸能與多種過渡金屬離子Ni2+ ，Zn2+， Cu2+ ，Co2+，F(xiàn)e3+發(fā)生特殊的相互作用，從而把富含這類氨基酸的蛋白質(zhì)吸附，達(dá)到分離的目的。洗脫目的蛋白有幾種方式：咪唑（條件最溫和）、pH 以及EDTA。TCA（三氯乙酸）除去鹽酸胍：沉淀鹽酸胍、離心、乙醇溶解、離心，得到沉淀為洗脫蛋白，用尿素溶解、透析后保存。基因的真核表達(dá)系統(tǒng)：穿梭載體：既能在原核細(xì)胞中復(fù)制，也能在真核細(xì)胞中復(fù)制的載體。Western blot（免疫印跡）：將蛋白質(zhì)凝膠電泳、印跡、免疫測(cè)定融為一體的特異性蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)。原理：蛋白質(zhì)混合樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電

23、泳使蛋白質(zhì)按分子大小分離，將分離的各蛋白質(zhì)條帶原位轉(zhuǎn)移到固相載體膜（NC、PVDF膜）上用無關(guān)蛋白質(zhì)封閉液封閉膜的非特異性位點(diǎn)，加入特異性抗體后膜上的目的蛋白與一抗發(fā)生特異性的免疫結(jié)合反應(yīng)，洗滌后再加入能與一抗發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)的酶標(biāo)二抗，最后通過二抗上標(biāo)記酶的性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，即根據(jù)底物顯色的顏色及深淺來探測(cè)膜上印跡蛋白抗原的存在與否及含量多少。辣根過氧化合酶（HRP）：來源于植物，用于動(dòng)物性樣品的檢測(cè)（目的是消除樣品中內(nèi)源性酶的干擾，降低背景）。堿性磷酸酶（AP）：來源于動(dòng)物牛小腸，用于植物性樣品的檢測(cè)，（目的是消除樣品中內(nèi)源性酶的干擾，降低背景）。硝酸纖維素（NC）膜：其結(jié)合能力主要與膜的硝酸

24、纖維素的純度有關(guān)，很脆、易破，但是結(jié)合蛋白效率比PDVF高。聚偏二氟乙烯（PVDF）膜：疏水性，不易破，結(jié)合蛋白較牢固，可結(jié)合小片段蛋白。SDS-PAGE中SDS的作用：強(qiáng)陰離子去污劑使蛋白質(zhì)變性、亞基解離，破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。【蛋白質(zhì)在電泳分離時(shí)，其遷移率主要取決于蛋白質(zhì)本身所帶的電荷多少、分子量大小和形態(tài)】。酶標(biāo)二抗：根據(jù)使用的第一抗體選擇，如第一抗體為兔抗體，則可使用羊抗兔IgG抗體，若為鼠源抗體，則可使用羊抗鼠IgG抗體或兔抗鼠IgG抗體。Western blot實(shí)驗(yàn)步驟：1.SDS-PAGE電泳2.電轉(zhuǎn)移濕轉(zhuǎn)法：將膜、膠、濾紙整個(gè)組合完全浸入有鉑絲電極的轉(zhuǎn)移緩沖液中的蛋白原位電轉(zhuǎn)移

25、體系。膠正膜負(fù)，（-）- （+）。Southern blot 地高辛法轉(zhuǎn)膜-UV交聯(lián)（紫外交聯(lián)原理）：紫外照射使DNA和RNA的一小部分胸腺嘧啶（T）殘基與膜表面帶正電荷的氨基基團(tuán)之間形成共價(jià)交聯(lián)。免疫球蛋白（Ig）：是指存在于人和動(dòng)物血液(血清)、組織液及其它外分泌液中的一類具有相似結(jié)構(gòu)的球蛋白?？贵w（Ab）：動(dòng)物機(jī)體受到抗原物質(zhì)的刺激后, 由B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成的漿細(xì)胞產(chǎn)生的, 能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白。抗原（Ag）：能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細(xì)胞（免疫原性）并能與之發(fā)生特異性免疫反應(yīng)（反應(yīng)原性）的物質(zhì)?？乖瓫Q定簇：存在于抗原分子表面的能夠決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，

26、是與抗體結(jié)合的位點(diǎn)。決定著抗原與抗體發(fā)生特異結(jié)合的能力。ELISA：把抗原、抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)有機(jī)地結(jié)合在一起一種免疫學(xué)技術(shù)。包被：抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程。常用的標(biāo)記基因和選擇基因：生化標(biāo)記基因、抗性標(biāo)記基因、營養(yǎng)標(biāo)記基因。生化標(biāo)記基因：其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測(cè)的生化反應(yīng)，導(dǎo)入植物24-48小時(shí)內(nèi)就可以檢測(cè)結(jié)果，迅速對(duì)轉(zhuǎn)基因程序的有關(guān)因素進(jìn)行評(píng)價(jià)和優(yōu)化，獲得基因表達(dá)水平、載體等信息。常用基因：-半乳苷酶基因（lacZ）、葡萄糖苷酸酶基因（GUS）、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（CAT）、熒光素酶基因（Luc）、花青素基因（Ant）、綠色熒光蛋白基因（GFP）。氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移

27、酶（CAT）基因：抑制蛋白質(zhì)生物合成。應(yīng)用原理：真核生物沒有Cat，Cat轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞具有對(duì)氯霉素的抗性，通過Cat的活性檢測(cè)分析外源基因的表達(dá)。活性檢測(cè)：反應(yīng)底物乙酰CoA.方法：硅膠G薄層層析法、DTNB分光光度法。葡萄糖苷酸酶基因（GUS）：染色原理-Gus 可以水解葡糖苷酸，形成葡糖醛酸（蘭色）。熒光素酶（Luc）基因：在ATP存在下催化D-熒光素的氧化反應(yīng)生成氧化熒光素和黃-綠色光。這是一種對(duì)植物組織沒有傷害的檢測(cè)方法。花青素（Ant）基因：轉(zhuǎn)入這些基因后，可以在植物組織上生成紅色的花青素斑點(diǎn)。此基因不需任何底物就可以檢測(cè)，但使用局限性大。綠色熒光蛋白（GFP）基因：是海洋生物水母

28、體內(nèi)的一種發(fā)光蛋白，經(jīng)過改造后用于做植物的標(biāo)記基因，基因產(chǎn)物在蘭色光或紫色光下可見綠色熒光?？剐詷?biāo)記基因：抗生素抗性基因、重金屬抗性基因、代謝抗性基因?？股乜剐曰颍喊逼S青霉素抗性基因（Apr）、四環(huán)素抗性基因（Tet r）、氯霉素抗性基因（Cm r）、卡那霉素抗性基因（Kanr）、G418抗性基因（G418r）、潮霉素抗性基因（Hygr）、新霉素抗性基因（Neor）。篩選基因：選擇的基本原理：使未轉(zhuǎn)化的組織或細(xì)胞，在含有選擇劑的培養(yǎng)基上新陳代謝受阻而停止生長，最后死亡。重金屬抗性基因：銅、鋅、鎘抗性基因。代謝抗性基因：抗除草劑基因。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法：普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，它

29、能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。原理：根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌細(xì)胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。【人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株】。Ti質(zhì)粒：根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞核外存在的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子。溫度低于30？Ti質(zhì)粒攜帶著既能分解又能合成這些化合物的酶類和相應(yīng)基因，然而冠癭堿合成基因卻不能在根癌農(nóng)桿菌中表達(dá)，它們只有進(jìn)入植物細(xì)胞后才能表達(dá)，Ti質(zhì)粒上的冠癭

30、堿分解基因產(chǎn)物卻能分解冠癭堿，為宿主細(xì)胞提供能源、氮源和碳源。 6大功能區(qū)：致癌區(qū)、冠癭堿合成區(qū)、冠癭堿分解區(qū)、Ti質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移區(qū)、毒性區(qū)、DNA復(fù)制區(qū)。T-DNA：在致癌區(qū)和冠癭堿合成區(qū)的兩側(cè)存在著一個(gè)24 bp直接重復(fù)序列，由這三部分所構(gòu)成的DNA區(qū)域叫做T-DNA。T-DNA 區(qū)域中的這些基因只有在T-DNA插入到植物基因組后才能激活表達(dá)。Vir區(qū)：毒性區(qū)，控制根癌農(nóng)桿菌附著于植物細(xì)胞和Ti質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞有關(guān)部位。VirE, VirD, VirC, VirG, VirB, VirA（最先激活）。根癌農(nóng)桿菌對(duì)高濃度的創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子，即一些酚類化合物具有趨化性，在植物細(xì)胞表面附著后，受這些創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子的刺激，Ti質(zhì)粒vir區(qū)毒性基因被激活和表達(dá)。右邊界的缺失，使得DNA合成不能起始，因而T-DNA不能釋放，所以T-DNA不能轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞。而左邊界的缺失，僅會(huì)影響DNA合成過程的終止?；驑尳閷?dǎo)法轉(zhuǎn)化：將核酸直接發(fā)送至細(xì)胞內(nèi)的物理學(xué)方法。原理：利用火藥爆炸或高壓氣體加速，將包裹了帶目的基因的DNA溶液的高速微彈直接送入完整的植物組織和細(xì)胞中，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出植株，選出其中轉(zhuǎn)基因陽性植株即為轉(zhuǎn)基因植株。材料：目的基因、受體組織（愈傷組織）、基因槍轟擊金粉包埋試劑盒。高壓氣體可裂膜 子彈載膜 子彈擋網(wǎng)（阻擋可裂膜及載膜的碎片）培養(yǎng)皿受體組織