激光共聚焦顯微鏡原理和操作

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1、激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 技 術(shù) 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 技 術(shù) 及 應(yīng) 用The techniques and application of Confocal Laser Scanning Microscopy 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 技 術(shù)人 眼 分 辨 率 ： 0.2mm光 學(xué) 顯 微 鏡 分 辨 率 ： 0.25mm電 子 顯 微 鏡 分 辨 率 ： 0.2nm共 焦 顯 微 鏡 分 辨 率 ： 0.18mm 二 、 原 理激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 技 術(shù) 原 理 小 結(jié) :Confocal 利 用 放 置 在 光 源 后 的 照 明 針 孔

2、 和 放 置 在 檢 測(cè)器 前 的 探 測(cè) 針 孔 實(shí) 現(xiàn) 點(diǎn) 照 明 和 點(diǎn) 探 測(cè) ， 來(lái) 自 光 源 的 光 通 過(guò) 照明 針 孔 發(fā) 射 出 的 光 聚 焦 在 樣 品 焦 平 面 的 某 個(gè) 點(diǎn) 上 ， 該 點(diǎn) 所 發(fā)射 的 熒 光 成 像 在 探 測(cè) 針 孔 上 ， 該 點(diǎn) 以 外 的 任 何 發(fā) 射 光 均 被 探測(cè) 針 孔 阻 擋 。 照 明 針 孔 與 探 測(cè) 針 孔 對(duì) 被 照 射 點(diǎn) 或 被 探 測(cè) 點(diǎn) 來(lái)說(shuō) 是 共 軛 的 ， 因 此 被 探 測(cè) 點(diǎn) 即 共 焦 點(diǎn) ， 被 探 測(cè) 點(diǎn) 所 在 的 平 面即 共 焦 平 面 。 計(jì) 算 機(jī) 以 像 點(diǎn) 的 方 式 將 被

3、 探 測(cè) 點(diǎn) 顯 示 在 計(jì) 算 機(jī)屏 幕 上 ， 為 了 產(chǎn) 生 一 幅 完 整 的 圖 像 ， 由 光 路 中 的 掃 描 系 統(tǒng) 在樣 品 焦 平 面 上 掃 描 ， 從 而 產(chǎn) 生 一 幅 完 整 的 共 焦 圖 像 。 只 要 載物 臺(tái) 沿 著 Z軸 上 下 移 動(dòng) ， 將 樣 品 新 的 一 個(gè) 層 面 移 動(dòng) 到 共 焦 平面 上 ， 樣 品 的 新 層 面 又 成 像 在 顯 示 器 上 ， 隨 著 Z軸 的 不 斷 移動(dòng) ， 就 可 得 到 樣 品 不 同 層 面 連 續(xù) 的 光 切 圖 像 。激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 技 術(shù) 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 技

4、 術(shù) 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 技 術(shù) 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 技 術(shù) 共 焦 顯 微 鏡 與 傳 統(tǒng) 顯 微 鏡 的 區(qū) 別1.抑 制 圖 像 的 模 糊 ， 獲 得 清 晰 的 圖 像 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 技 術(shù) 共 焦 顯 微 鏡 與 傳 統(tǒng) 顯 微 鏡 的 區(qū) 別2. 具 有 更 高 的 軸 向 分 辨 率 ， 并 可 獲 取 連 續(xù) 光 學(xué) 切 片 conventionalconfocal 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 技 術(shù) 共 焦 顯 微 鏡 與 傳 統(tǒng) 顯 微 鏡 的 區(qū) 別3. 增 加 側(cè) 向 分 辨 率 d 2 alconvent

5、ionconfocal dd 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 技 術(shù) 共 焦 顯 微 鏡 與 傳 統(tǒng) 顯 微 鏡 的 區(qū) 別4. 由 于 點(diǎn) 對(duì) 點(diǎn) 掃 描 去 除 了 雜 散 光 的 影 響 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 技 術(shù)三 . 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 的 設(shè) 計(jì) 特 點(diǎn) :1.點(diǎn) 照 明2.具 有 照 明 pinhole和 探 測(cè) pinhole3.照 明 pinhole和 探 測(cè) pinhole共 軛 (共 焦 ), 共 焦 點(diǎn) 即被 探 測(cè) 點(diǎn) ， 被 探 測(cè) 點(diǎn) 所 在 的 平 面 為 共 焦 平 面4.具 有 掃 描 系 統(tǒng) 逐 點(diǎn) 掃 描 成 像 5.

6、具 有 多 個(gè) （ 四 個(gè) ） 熒 光 通 道 ， 可 同 時(shí) 探 測(cè) 多 個(gè)被 標(biāo) 記 物 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 技 術(shù) 技 術(shù) 指 標(biāo) （ Leica TCS SP2) : 1. xy分 辨 率 比 傳 統(tǒng) 顯 微 鏡 小 1.4x 傳 統(tǒng) 顯 微 鏡 : Rxy=0.61/NA （ 0.25 mm ) Confocal: Rxy=0.4/NA（ 0.18 mm )2. 樣 品 的 最 大 厚 度 : 取 決 于 : 物 鏡 的 NA、 物 鏡 的 工 作 距 離 激 光 的 穿 透 力 、 樣 品 的 透 明 度 Z軸 的 最 大 移 動(dòng) 范 圍 (166mm、 Z-wid

7、e)3. 樣 品 的 最 小 光 切 厚 度 : (載 物 臺(tái) 最 小 移 動(dòng) 距 離 為 40nm） 取 決 于 : 物 鏡 的 NA、 針 孔 大 小 Z軸 的 最 小 移 動(dòng) 步 距 : 40nm Z軸 的 分 辨 率 : 0.35 mm 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 技 術(shù)4. 激 光 器 Ar激 光 器 : 458nm, 476nm, 488nm, 514nm GreNe : 543nm; HeNe: 633nm Ar激 光 器 (UV): 361nm 激 光 器 的 特 點(diǎn) : 1) 方 向 性 好 : 激 光 基 本 延 直 線(xiàn) 傳 播 2) 單 色 性 好 :=10-8n

8、m 3) 高 亮 度 : 激 光 方 向 性 好 , 其 在 空 間 上 的 能 量 分 布 是 高 度 集 中 的 。 4) 偏 振 性 : 激 光 為 平 面 偏 振 光 , 光 纖 耦 合 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 技 術(shù)5. 四 個(gè) 熒 光 通 道 , 一 個(gè) 透 射 光 通 道 即 除 了 可 同 時(shí) 采 集 多 標(biāo) 記 熒 光 圖 像 外還 可 以 同 時(shí) 采 集 透 射 光 圖 像 ,但 透 射 光圖 像 為 非 共 焦 圖 像 。 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 技 術(shù)6.掃 描 速 度 : slow 220lines/s 512512 2-3秒 slow2 44

9、0lines/s（ 2： 雙 向 掃 描 ） medium 450lines/s 512512 1.7秒 medium2 900lines/s fast 1000lines/s 512512 0.7秒 128128 0.2秒 fast2 2000lines/s7. 掃 描 密 度 : 6464 128128 512512 10241024 20482048 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡技 術(shù) 的 應(yīng) 用The application of Confocal Laser Scanning Microscopy 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用 功 能 .1.多 熒 光 標(biāo) 記 樣

10、 品 的 高 清 晰 度 、 高 分 辨 率 圖 像 采 集2.無(wú) 損 傷 、 連 續(xù) 光 學(xué) 切 片 ， 顯 微 “ CT”3.真 正 的 三 維 重 組4.假 三 維 圖 的 顯 示5.可 沿 Z軸 （ xy平 面 ） 和 Y軸 （ xz平 面 ） 方 向 進(jìn) 行 光 切6.定 量 分 析7.時(shí) 間 序 列 掃 描 : xyt 、 xyzt 和 xt 掃 描8.圖 像 處 理9. 旋 轉(zhuǎn) 掃 描10.感 興 趣 區(qū) 域 掃 描11.光 譜 掃 描 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用應(yīng) 用 定 位 、 定 量 三 維 重 組 動(dòng) 態(tài) 測(cè) 量 活 細(xì) 胞 或 組 織 內(nèi) 游 離 Ca2

11、+分 布 和 濃 度 的 變 化 測(cè) 量 (Mg2+ 、 Zn+ 、 Na+ 、 K+) 自 由 基 的 檢 測(cè) 藥 物 進(jìn) 入 細(xì) 胞 的 動(dòng) 態(tài) 過(guò) 程 、 定 位 分 布 及 定 量 蛋 白 質(zhì) 的 轉(zhuǎn) 位 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用 活 細(xì) 胞 內(nèi) H+濃 度 （ pH值 ） 的 測(cè) 量 線(xiàn) 粒 體 膜 電 位 的 測(cè) 量 熒 光 漂 白 恢 復(fù) （ FRAP） 的 測(cè) 量 籠 鎖 解 籠 鎖 的 測(cè) 量 熒 光 能 量 共 振 轉(zhuǎn) 移 （ FRET） 的 測(cè) 量 其 他 應(yīng) 用 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用一 、 定 位 、 定 量 免 疫 熒 光 標(biāo)

12、記 （ 單 標(biāo) 、 雙 標(biāo) 或 三 標(biāo) ） 的 定 位 、定 量 ： 如 ： 細(xì) 胞 膜 受 體 或 抗 原 的 分 布 ， 微 絲 、 微 管 的 分 布 、 兩 種 或 三 種 蛋 白 的 共 存 與 共 定 位 、 蛋 白 與 細(xì) 胞 器 的 共 定 位 、 核 轉(zhuǎn) 錄 因 子 轉(zhuǎn) 位 和 干 細(xì) 胞 的 增 值 、 分 化 細(xì) 胞 凋 亡 : AnnexinV-fitc + PI 末 端 原 位 雜 交 -fitc + PI 熒 光 原 位 雜 交 ： 染 色 體 基 因 定 位 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用 定 位 、 定 量 研 究 中 常 用 熒 光 探 針1.Am

13、ine-Reactive Probes 與 抗 體 耦 聯(lián) 、 與 配 體 耦 聯(lián) 、 與 肽 耦 聯(lián) 、 與 人 工 合 成 的 寡 聚 核 苷 酸耦 聯(lián) 的 探 針 ， 可 用 于 免 疫 組 化 、 熒 光 原 位 雜 交 、 受 體 標(biāo) 記 等 Green Red Fura-red FITC 494/518 TRITC 544/572 Cy5 650/690 (異 硫 氰 基 熒 光 素 ) (四 甲 基 異 硫 氰 基 羅 丹 明 )Alexa Fluor 488 488/530 PE 565/578 (藻 紅 蛋 白 ) Texas Red 595/615 (德 州 紅 ) Cy3

14、 558/568BODIPY FL 503/512 BODIPY TMR 543/569 BODIPY TR 592/618 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用1)細(xì) 胞 表 面 抗 原 、 胞 內(nèi) 某 種 蛋 白 免 役 熒 光 標(biāo) 記 ： 與 抗 體 耦 聯(lián) , 直 標(biāo) : 一 抗 +熒 光 探 針 間 標(biāo) : 二 抗 +熒 光 探 針 如 : 微 管 蛋 白 tublin ( 抗 tublin抗 體 +熒 光 探 針 ) 肌 動(dòng) 蛋 白 actin ( Palloidine+熒 光 探 針 )2)細(xì) 胞 膜 表 面 受 體配 體 +熒 光 探 針 如 : nAchR、 mAchR

15、、 多 巴 胺 受 體 (D1,D2) 標(biāo) 記 Gm1: 霍 亂 毒 素 受 體 霍 亂 毒 素 +FITC 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用2.標(biāo) 記 細(xì) 胞 器 熒 光 探 針1)線(xiàn) 粒 體 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ， 可 染 活 細(xì) 胞 ， 陽(yáng) 離 子 , 可 檢 測(cè) 線(xiàn) 粒 體 膜 電 位 , 且 在 多 數(shù) 細(xì) 胞 中 停 留 時(shí) 間 短 JC1 線(xiàn) 粒 體 膜 電 位 低 時(shí) 為 單 體 490/527 發(fā) 綠 光 線(xiàn) 粒 體 膜 電 位 高 時(shí) 為 多 聚 體 490/590 發(fā) 紅 光 可 標(biāo) 記 活 細(xì) 胞 線(xiàn) 粒 體 ，

16、且 為 檢 測(cè) 線(xiàn) 粒 體 膜 電 位 最 佳 探 針Mitotracker Green FM 490/516, 染 活 細(xì) 胞 或 固 定 細(xì) 胞 , 穩(wěn) 定 不 漏 出Mitotracker Orange CMTMRos 551/576, (氧 化 型 )Mitotracker Orange 還 原 型 , 只 能 染 活 細(xì) 胞 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用2)溶 酶 體 Lysosome 中 性 紅 541/640: 微 偏 堿 性 , 可 標(biāo) 記 溶 酶 體 等 酸 性 器 官 為 非 特 異 性 AO : LysoTracker Green DND-26 504/51

17、1, 染 活 細(xì) 胞 LysoTracker Blue LysoTracker Red3)內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng) Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非 特 異 性 , 較 高 濃 度 標(biāo) 記 內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng) , 較 低 濃 度 標(biāo) 記 線(xiàn) 粒 體4)高 爾 基 體 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可 染 活 或 死 細(xì) 胞 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用細(xì) 胞 器 的 單 克 隆 抗 體5)細(xì) 胞 核 PI propidium iodide 536/617 DNA/RNA 死 細(xì) 胞碘 化 丙 啶EB ethi

18、dium bromide 518/617 DNA/RNA 死 細(xì) 胞Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活 細(xì) 胞Hochest 33258 352/461 DNA A-T 活 細(xì) 胞DAPI 358/461 DNA A-T 半 通 透 細(xì) 胞Chromomycin A3 450/470 DNA G-CAO 500/526 DNA 活 細(xì) 胞 560/650 RNA TOTO-1 514/533 DNA 死 細(xì) 胞SYTO1116 2024 488/ 520 活 細(xì) 胞SYTO1116 2024 521/ 556 活 細(xì) 胞SYTO 17 621/634 活 細(xì) 胞 3

19、. GFP 綠 色 熒 光 蛋 白GFP的 的 發(fā) 現(xiàn) ： 60年 代 ， Shimomura等 首 先 從 水 母 中 分 離 出 一種 水 母 發(fā) 光 蛋 白 (aequoren)， 該 蛋 白 與 鈣 和 腸 腔 素 結(jié) 合 后 可 產(chǎn)生 藍(lán) 色 熒 光 。 然 而 水 母 整 體 幾 提 取 的 顆 粒 都 呈 綠 色 ， 后 經(jīng) 證 實(shí)在 水 母 體 內(nèi) 還 存 在 另 外 一 種 發(fā) 光 蛋 白 即 綠 色 熒 光 蛋 白 GFP, 后經(jīng) 研 究 表 明 ， 在 水 母 體 內(nèi) Ca2+和 腸 腔 素 與 水 母 發(fā) 光 蛋 白 結(jié) 合 后 ，水 母 發(fā) 光 蛋 白 產(chǎn) 生 藍(lán) 色

20、 熒 光 ， GFP在 藍(lán) 光 的 激 發(fā) 下 ， 產(chǎn) 生 綠 色熒 光 。 將 外 源 基 因 與 GFP DNA 相 連 , GFP可 作 為 外 源 基 因 的 報(bào) 告 基因 實(shí) 時(shí) 監(jiān) 測(cè) 外 源 基 因 的 表 達(dá) .激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用GFP主 要 應(yīng) 用 : 對(duì) 活 細(xì) 胞 中 的 蛋 白 質(zhì) 進(jìn) 行 準(zhǔn) 確 定 位 及 動(dòng) 態(tài) 觀(guān) 察 可 實(shí) 時(shí) 原 位 跟 蹤 特 定 蛋 白 在 細(xì) 胞 生 長(zhǎng) 、 分 裂 、 分 化 過(guò) 程 中或 外 界 刺 激 因 子 的 作 用 下 的 時(shí) 空 表 達(dá) , 如 某 種 轉(zhuǎn)

21、 錄 因 子 的 核轉(zhuǎn) 位 、 蛋 白 激 酶 C的 膜 轉(zhuǎn) 位 等 。 GFP基 因 與 分 泌 蛋 白 基 因 連 接 后 轉(zhuǎn) 染 細(xì) 胞 , 可 動(dòng) 態(tài) 觀(guān) 察 該 分 泌 蛋 白 分 泌 到 細(xì) 胞 外 的 過(guò) 程 GFP基 因 與 定 位 于 某 一 細(xì) 胞 器 特 殊 蛋 白 基 因 相 連 ,就 能 顯 示 活 細(xì) 胞 中 細(xì) 胞 核 、 內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng) 、 高 爾 基 體 、 線(xiàn) 粒 體 等 細(xì) 胞 器的 結(jié) 構(gòu) 及 病 理 過(guò) 程 可 用 于 觀(guān) 察 分 子 的 運(yùn) 動(dòng) （ FRAP） 蛋 白 之 間 的 相 互 作 用 （ FRET） 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用

22、三 .動(dòng) 態(tài) 測(cè) 量 Physiology:細(xì) 胞 內(nèi) 離 子 動(dòng) 態(tài) 變 化 測(cè) 量1).游 離 Ca2+測(cè) 量 檢 測(cè) 游 離 Ca2+變 化 熒 光 探 針 的 原 理 ： 這 類(lèi) 探 針 多 為 Ca2+螯 合 劑 ， 不 與Ca 2+結(jié) 合 時(shí) 不 發(fā) 熒 光 ， 通 常 也 不 能 進(jìn) 入 細(xì) 胞 膜 ， 只 有 與 乙 酰 甲 酯 AM相連 方 可 進(jìn) 入 細(xì) 胞 內(nèi) ， 被 細(xì) 胞 內(nèi) 酯 酶 水 解 后 并 與 胞 內(nèi) 游 離 鈣 結(jié) 合 后 發(fā) 出 熒光 。 Kd值 為 Ca2+解 離 常 數(shù) ， 表 明 檢 測(cè) Ca2+濃 度 的 范 圍 :0.1xKd-10 xkd,

23、Kd和 很 多 因 素 有 關(guān) ， 如 pH、 Mg2+、 與 蛋 白 的 結(jié) 合 、 溫 度 等 。 細(xì) 胞 內(nèi) 生 理Ca2+濃 度 值 (10-100n M)， 細(xì) 胞 內(nèi) Ca2+超 載 濃 度 值 （ 基 礎(chǔ) Ca2+濃 度 的 10倍左 右 ） 熒 光 探 針 激 發(fā) 波 長(zhǎng) 發(fā) 射 波 長(zhǎng) KdFLuo3-AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nMFluo4 506nm 525nmCalcium Green-1 507nm 530nm 190nMCalcium Green-2 507nm 535nm 550nMFura red 420/480nm 637n

24、m 140nMOregon Green 488 494nm 520nm 20,000nMCalcium Crimson 583nm 602nm 328nMIndo-1 356nm 405/458nm 230nMFura-2 340/380 476nm 145nM激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用 程 序 化 測(cè) 量 ： 用 timelapse中 的 編 程 按 鈕 可 進(jìn) 行 不 同 時(shí) 間 序 列 的 掃 描 測(cè) 量 。 F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)Ca2+濃 度 絕 對(duì) 測(cè) 量1） 單 波 長(zhǎng) 公 式 法Fluo3: 530nm Kd=450nMCa2+I =

25、Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)F min: 細(xì) 胞 內(nèi) 無(wú) 鈣 時(shí) 的 熒 光 強(qiáng) 度 ( MnCl2)Fmax： 細(xì) 胞 內(nèi) 鈣 飽 和 時(shí) 的 熒 光 強(qiáng) 度 (A23187)測(cè) 量 時(shí) 切 記 細(xì) 胞 內(nèi) 靜 息 Ca2+濃 度 的 相 對(duì) 熒 光 強(qiáng) 度 值 不 能 太 低 （ F值不 低 于 40） 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用 細(xì) 胞 內(nèi) 生 理 Ca2+濃 度 值 （ 10-8 -10-7 M）細(xì) 胞 內(nèi) Ca2+超 載 濃 度 值 （ 基 礎(chǔ) Ca2+濃 度 的 10倍 左 右 ）2） 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線(xiàn) 法根 據(jù) 儀 器 條 件 和 負(fù) 載 條 件 ， 以

26、不 同 Ca2+濃 度 的 Buffer(EGTA- Ca2+)做 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線(xiàn) ， 橫 軸 為 Ca2+濃 度 ， 縱 軸 為 熒 光 強(qiáng) 度3） 比 例 熒 光 的 測(cè) 量.雙 波 長(zhǎng) (比 例 熒 光 ： ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440)Ca 2+I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用快 速 Ca2+變 化 的 測(cè) 量1.改 變 掃 描 速 度2.采 用 雙 向 掃 描3.減 少 采 樣 點(diǎn) 數(shù) (犧 牲 空 間 分

27、辨 率 ）4.采 用 線(xiàn) 掃 描 (xt) 細(xì) 胞 器 的 Ca2+測(cè) 量1.線(xiàn) 粒 體 內(nèi) 游 離 Ca2+測(cè) 量 Fluo-3 + TMRM(線(xiàn) 粒 體 熒 光 探 針 ， 紅 色 ）2. 特 異 定 位 的 重 組 水 母 發(fā) 光 蛋 白 水 母 發(fā) 光 蛋 白 與 Ca2+結(jié) 合 后 發(fā) 藍(lán) 光 用 含 有 水 母 發(fā) 光 蛋 白 和 含 有 特 定 細(xì) 胞 器 蛋 白 的 表 達(dá) 載 體轉(zhuǎn) 染 細(xì) 胞 ， 可 測(cè) 定 亞 細(xì) 胞 器 內(nèi) 的 游 離 Ca2+變 化 目 前 已 商 品 化 的 探 針 可 檢 測(cè) ： 線(xiàn) 粒 體 、 內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng) 、 細(xì) 胞 核內(nèi) 的 游 離 Ca 2+

28、， 因 生 物 發(fā) 光 很 弱 不 能 使 用 Confocal檢 測(cè) 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用 細(xì) 胞 內(nèi) 游 離 Ca2+測(cè) 量 的 應(yīng) 用l鈣 的 特 性1 細(xì) 胞 內(nèi) 外 的 電 化 學(xué) 梯 度 103-104倍2 細(xì) 胞 膜 滲 透 性 稍 有 改 變 或 鈣 庫(kù) 釋 放 稍 有 增 加 ， 導(dǎo) 致 胞 內(nèi) 鈣 明 顯 升 高3 細(xì) 胞 內(nèi) 鈣 為 細(xì) 胞 激 活 “ 開(kāi) 關(guān) ”l細(xì) 胞 內(nèi) 鈣 的 生 理 作 用1 肌 肉 的 興 奮 收 縮 -收 縮 偶 聯(lián)2 神 經(jīng) 遞 質(zhì) 的 釋 放3 學(xué) 習(xí) 記 憶 的 增 強(qiáng)4 卵 子 受 精5 細(xì) 胞 分 裂 和 再

29、生6 細(xì) 胞 調(diào) 亡7 細(xì) 胞 間 通 訊激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用 8 細(xì) 胞 信 號(hào) 傳 導(dǎo)9. DNA合 成10. 基 因 表 達(dá)l細(xì) 胞 內(nèi) 鈣 超 載 與 疾 病1 高 血 壓 、 腦 缺 血 、 心 臟 病 、 內(nèi) 分 泌 病 胞 內(nèi) 鈣 濃 度 異 常2 糖 尿 病 、 風(fēng) 濕 性 關(guān) 節(jié) 炎 、 多 發(fā) 性 硬 化 病 胞 內(nèi) 鈣 濃 度 增 高3 人 體 缺 鈣 骨 鈣 大 量 丟 失 ， 神 經(jīng) 細(xì) 胞 的 鈣 濃 度 增 高4 老 化 和 老 年 性 癡 呆 -神 經(jīng) 細(xì) 胞 內(nèi) 鈣 濃 度 增 高 細(xì) 胞 內(nèi) 生 理 Ca 2+濃 度 值 （ 10-8

30、-10-7 M）細(xì) 胞 內(nèi) Ca2+超 載 濃 度 值 （ 基 礎(chǔ) Ca2+濃 度 的 10倍 左 右 ） 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用 電刺激引起骨骼肌 細(xì)胞的Ca2+振蕩激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用 pH值 的 檢 測(cè) ： BCECF-AM 490nm 530nm 6.5-7.5 Snarf-1-AM 488nm 580/640nm 7.0-8.0 自 由 基 的 檢 測(cè)熒 光 探 針 ： H2DCF-DA（ 504nm/529nm）2-氫 ， 2氯 熒 光 素 乙 酰 乙 酸 鹽 胞 外 H2DCF-DA 擴(kuò) 散 入

31、 細(xì) 胞 內(nèi) 酯 酶 脫 乙 酰DCF-H(不 熒 發(fā) 光 ） DCF（ 發(fā) 熒 光 ）*樣 品 不 能 在 鏡 下 用 汞 燈 照 射 及 觀(guān) 察 Dihydrorhodamine 123（ 507nm/529nm）H 2rhod123 被 動(dòng) 擴(kuò) 散 入 細(xì) 胞 內(nèi) 在 細(xì) 胞 內(nèi) 被 氧 化 成rod123（ 發(fā) 光 ） 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用 藥 物 進(jìn) 入 細(xì) 胞 的 動(dòng) 態(tài) 過(guò) 程 及 定 位 分 布 xyzt 掃 描 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用四 . 膜 電 位 的 測(cè) 量標(biāo) 記 膜 電 位 探 針

32、(慢 反 應(yīng) ） ：JC1 510nm 530/590nmDioc5(3) 548nm 573nmDioc6(3) 484nm 500nm快 反 應(yīng) 探 針 ：Di-4-ANEPPS 496nm 703nmDi-4-ANEPPS 498nm 713nm細(xì) 胞 膜 靜 息 膜 電 位 ： -70mV 線(xiàn) 粒 體 膜 電 位 ： -150mV以 上 均 屬 于 陽(yáng) 離 子 探 針 ， 更 容 易 與 線(xiàn) 粒 體 親 和 ， 為 線(xiàn) 粒 體 膜 電 位 探 針 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用七熒光能量共振轉(zhuǎn)移( fluorescence Resonance Energy Transfer

33、)能 量 轉(zhuǎn) 移 ： 能 量 從 分 子 的 一 個(gè) 部 位 向 另 一 個(gè) 部 位 的 傳 遞 ，或 能 量 從 一 個(gè) 分 子 向 另 一 個(gè) 分 子 傳 遞 。 能 量 的 提 供 者叫 能 量 供 體 ， 能 量 的 接 受 者 叫 能 量 受 體 。熒 光 能 量 共 振 轉(zhuǎn) 移 的 條 件 ： 兩 個(gè) 熒 光 分 子 ： 供 體 -FL1， 受 體 -FL2 供 體 與 受 體 的 距 離 在 2-7nm 供 體 的 發(fā) 射 波 長(zhǎng) 與 受 體 的 激 發(fā) 波 長(zhǎng) 一 致 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用樣 品 要 求 ：1.經(jīng) 熒 光 探 劑 標(biāo) 記 (單 標(biāo) 、 雙

34、標(biāo) 、 三 標(biāo) ）2.固 定 的 或 活 的 組 織3.固 定 的 或 活 的 貼 壁 培 養(yǎng) 細(xì) 胞 應(yīng) 培 養(yǎng) 在Confocal專(zhuān) 用 小 培 養(yǎng) 皿 或 蓋 玻 片 上4.懸 浮 細(xì) 胞 ， 甩 片 或 滴 片 后 ， 用 蓋 玻 片 封 片 激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 應(yīng) 用激 光 掃 描 共 焦 顯 微 鏡 的 發(fā) 展 趨 勢(shì) ： 連 續(xù) 光 譜 型 Confocal 多 光 子 激 光 掃 描 顯 微 鏡 Multiphoton Laser Scanning Microscopy 雙 (多 )光 子 激 光 掃 描 顯 微 鏡 的優(yōu)勢(shì) 多 光 子 激 光 掃 描 顯 微 鏡 簡(jiǎn) 介 多 光 子 激 光 器 波 長(zhǎng) 從 700-1000nm 連 續(xù) 可 調(diào) 雙 光 子 波 長(zhǎng) ： 350-500nm 連 續(xù) 三 光 子 波 長(zhǎng) ： 230-330nm 連 續(xù) 應(yīng) 用 ： 可 直 接 清 晰 活 體 觀(guān) 察 某 些 非 標(biāo) 記 神 經(jīng) 遞 質(zhì) 的 分 泌 (5-HT) 或 NADPH的 分 布 例 4 長(zhǎng) 時(shí) 間 觀(guān) 察 活 體 阿 爾 茨 海 默 病 模 型 小 鼠 淀 粉 蛋 白 形 成 的 狀 況