激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)講座

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1、 采 用 激 光 作 為 光 源 ， 在 傳 統(tǒng) 光 學(xué) 顯 微 鏡基 礎(chǔ) 上 ， 使 用 紫 外 或 可 見 光 激 發(fā) 熒 光 探 針 ， 采用 共 軛 聚 焦 原 理 和 裝 置 ， 從 而 得 到 細(xì) 胞 或 組 織內(nèi) 部 微 細(xì) 結(jié) 構(gòu) 的 熒 光 圖 像 ， 在 亞 細(xì) 胞 水 平 上 觀察 生 理 信 號 及 細(xì) 胞 形 態(tài) 的 變 化 ， 并 利 用 計(jì) 算 機(jī)對 所 觀 察 的 對 象 進(jìn) 行 數(shù) 字 圖 象 處 理 的 一 套 集 觀察 、 分 析 和 輸 出 為 一 體 系 統(tǒng) 。 它 把 光 學(xué) 成 像 的分 辨 率 提 高 了 30%40%， 成 為 形 態(tài) 學(xué) ，

2、分 子 生物 學(xué) ， 神 經(jīng) 科 學(xué) ， 藥 理 學(xué) ， 遺 傳 學(xué) 等 領(lǐng) 域 中 新一 代 的 研 究 工 具 。 Hippocampus neurons expressing GFP 熒 光 顯 微 鏡 LSCM 顯 微 鏡 成 像 清 晰 度 的 決 定 因 素 : 1.分 辨 率2.球 差3.色 差 1、 分 辨 率 ： 指 顯 微 鏡 能 將 近 鄰 的 兩 個質(zhì) 點(diǎn) 分 辨 清 楚 的 能 力 ,通 常 是用 顯 微 鏡 所 能 分 辨 清 楚 最 近的 相 鄰 兩 點(diǎn) 間 的 距 離 來 表 示 。 0.25 mm 2、 球 差 ： 由 主 軸 上 某 一 物 點(diǎn) 向 光 學(xué)

3、系統(tǒng) 發(fā) 出 的 單 色 圓 錐 形 光 束 ， 經(jīng) 該光 學(xué) 系 列 折 射 后 ， 不 能 聚 焦 成一 點(diǎn) ,使 成 像 模 糊 不 清 ,形 成 一 彌散 光 斑 (俗 稱 模 糊 圈 )， 則 此 光 學(xué)系 統(tǒng) 的 成 像 誤 差 稱 為 球 差 。 激 光 掃 描 共 聚 焦 顯 微 鏡 熒 光 顯 微 鏡 激 光 掃 描 共 聚 焦 顯 微 鏡 中 常 見 的 激 光 器 Ar激 光 器 : 458nm, 476nm, 488nm, 514nm HeNe : 543nm,633nm 固 體 激 光 器 (UV): 405nm激 光 器 的 特 點(diǎn) : 1) 方 向 性 好 : 激

4、 光 基 本 延 直 線 傳 播 2) 單 色 性 好 :=10-8nm 3) 高 亮 度 : 激 光 方 向 性 好 , 其 在 空 間 上 的 能 量 分 布 是 高 度 集 中 的 。 4) 偏 振 性 : 激 光 為 平 面 偏 振 光 , 光 纖 耦 合 Leica DM IRBE 倒 置 熒 光 顯 微 鏡 LSCM物 鏡 的 重 要 參 數(shù) NA 數(shù) 值 孔 徑 又 叫 做 鏡 口 率 ， 簡 寫 為 N.A。 是 物鏡 的 主 要 技 術(shù) 參 數(shù) ， 是 判 斷 物 鏡 性 能 高 低 的 重 要標(biāo) 志 。 N.A=n*sin a/2 n： 物 體 與 物 鏡 間 媒 質(zhì) 的

5、折 射 率 a2： 物 鏡 孔 徑 角 的 一 半 溴 萘 折 射 率 1.66， 香 柏 油 1.515， 玻 璃 1.52，水 的 為 1.3， 空 氣 為 1。 香 柏 油 與 玻 璃 折 射 率 相 似 ，故 光 折 射 少 ， 透 光 率 高 ， 成 像 清 楚 。 N.A. 越 大 ： 放 大 倍 數(shù) 越 大 ， 分 辨 率 越 高 ， N.A. 越 大 ： 視 場 寬 度 與 工 作 距 離 越 小 4x 20 x 10 x 40 x 60 x 100 x 分 析 軟 件控 制 軟 件 + 圖 1. 共 聚 焦 顯 微 鏡 簡 化 原 理 圖 用 于 激 發(fā) 熒 光 的 激 光

6、束 (Laser)透 過 入 射 小 孔 (light source pinhole)被 二 向 色 鏡(Dichroic mirror)反 射 ， 通 過 顯 微 物 鏡 (Objective lens)匯 聚 后 入 射 于 待 觀 察 的 標(biāo) 本(specimen)內(nèi) 部 焦 點(diǎn) (focal point)處 。 激 光 照 射 所 產(chǎn) 生 的 熒 光 (fluorescence light)和 少量 反 射 激 光 一 起 ， 被 物 鏡 重 新 收 集 后 送 往 二 向 色 鏡 。 其 中 攜 帶 圖 像 信 息 的 熒 光 由 于波 長 比 較 長 ， 直 接 通 過 二 向 色

7、 鏡 并 透 過 出 射 小 孔 (Detection pinhole)到 達(dá) 光 電 探 測器 (Detector)（ 通 常 是 光 電 倍 增 管 （ PMT） 或 是 雪 崩 光 電 二 極 管 （ APD） ） ， 變 成電 信 號 后 送 入 計(jì) 算 機(jī) 。 而 由 于 二 向 色 鏡 的 分 光 作 用 ， 殘 余 的 激 光 則 被 二 向 色 鏡 反 射 ，不 會 被 探 測 到 。 共 軛 普 通 光 學(xué) 顯 微 鏡 與 激 光 共 聚 焦 顯 微 鏡 的 區(qū) 別 Z XY XY平 面 Optical sections collected simultaneously at

8、 three different excitation wavelengths (488, 568, and 647 nanometers). The specimen is the fruit fly third instar wing imaginal disk. XY XY平 面 XY XY平 面 timeTime-lapse imaging of a living fruit fly embryo injected with calcium green is presented in Figure 2. The series of images shows the change in

9、distribution of the fluorescent probe over time. 0 s 10 s 20 s 30 s Peripheral nervous system of a fruit fly embryo Z XY XY平 面 觀 察 活 細(xì) 胞 、 活 組 織 ： 在 不 損 傷 細(xì)胞 的 前 提 下 ,對 活 組 織 、 活 細(xì) 胞 進(jìn) 行 觀 察 和測 量 ， 這 不 僅 省 去 了 繁 瑣 的 樣 品 前 期 處 理過 程 (如 脫 水 、 脫 蠟 、 染 色 等 );而 且 觀 察 過 的樣 品 還 可 以 繼 續(xù) 用 于 其 他 的 研 究 。 這 種 功

10、能 對 于 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 、 轉(zhuǎn) 基 因 研 究 尤 為 重 要 。這 可 以 說 是 最 大 的 優(yōu) 勢 。 6 生 化 成 分 精 確 定 位 觀 察 配 合 專 用 的 分 子 探 針 ,對 于要 檢 測 的 成 分 不 僅 可 以 定 位 到 細(xì) 胞 水 平 ,還 可 以 定位 到 亞 細(xì) 胞 水 平 和 分 子 水 平 。7 動 態(tài) 觀 察 在 同 一 樣 品 平 面 上 隨 時(shí) 間 進(jìn) 行 連 續(xù) 掃 描 ,就 可 分 析 細(xì) 胞 結(jié) 構(gòu) 、 內(nèi) 含 、 和 標(biāo) 記 等 動 力 學(xué) 變 化 。目 前 在 這 方 面 做 得 最 多 的 是 使 用 觀 察 心肌 或 平 滑 肌 細(xì)

11、 胞 內(nèi) 游 離 鈣 、 鈉 、 鉀 離 子 濃 度 或 的 動 態(tài) 變 化 。8 定 量 測 量 ： 首 先 應(yīng) 用 專 一 的 熒 光 探 針 對 樣 品 進(jìn) 行染 色 ,樣 品 的 熒 光 強(qiáng) 度 和 所 測 成 分 的 含 量 呈 正 比 ,如果 其 余 條 件 固 定 ,通 過 對 比 各 組 樣 品 之 間 的 熒 光 強(qiáng)度 值 ,可 得 出 特 定 成 分 的 含 量 比 。 合 適 的 熒 光 探 針 是 有 效 地 進(jìn) 行 實(shí) 驗(yàn) 并 獲 取 理 想 實(shí)驗(yàn) 結(jié) 果 的 保 障 。(1)現(xiàn) 有 儀 器 所 采 用 的 激 光 器(2)熒 光 探 針 的 光 穩(wěn) 定 性 和 光

12、漂 白 性(3)熒 光 的 定 性 或 定 量 定 性 :單 波 長 激 發(fā) 探 針 定 量 :雙 波 長 激 發(fā) 比 率 探 針(4)熒 光 探 針 的 特 異 性 和 毒 性 。(5)熒 光 探 針 適 用 的 pH * 不 同 的 熒 光 探 針 在 不 同 標(biāo) 本 的 效 果 常 有 差異 ， 故 除 綜 合 考 慮 以 上 因 素 以 外 ， 有 條 件 者 應(yīng) 進(jìn)行 染 料 的 篩 選 ， 以 找 出 最 適 的 熒 光 探 針 。* 許 多 熒 光 探 針 是 疏 水 性 的 ， 很 難 或 不 能 進(jìn)入 細(xì) 胞 ， 需 使 熒 光 探 針 與 AM（ 乙 酰 羥 甲 基 酯 ）

13、結(jié) 合 后 變 成 不 帶 電 荷 的 親 脂 性 化 合 物 方 易 于 通 過質(zhì) 膜 進(jìn) 入 細(xì) 胞 ， 在 細(xì) 胞 內(nèi) 熒 光 探 針 上 的 AM被 非特 異 性 酯 酶 水 解 ， 去 掉 AM后 的 熒 光 探 針 不 僅 可與 細(xì) 胞 內(nèi) 的 靶 結(jié) 構(gòu) 或 靶 分 子 結(jié) 合 且 不 易 透 出 質(zhì) 膜 ，從 而 能 有 效 的 發(fā) 揮 作 用 。 Xenopus oocytes Calcium green用 細(xì) 胞 內(nèi) 液 稀 釋 Calcium green導(dǎo) 入 微 注 射 器以 20nL/oocyte注 射 卵 母 細(xì) 胞18C避 光 放 置 40分 鐘共 聚 焦 顯 微 鏡 觀 察 HEK293 cells expressing PLC-PH-GFP PLC-PH-GFP + H1 receptor LipofactAMINE2000 混 合 20分 鐘混 合 物 孵 育 細(xì) 胞 4-6小 時(shí)洗 掉 轉(zhuǎn) 染 液 ， 加 入 正 常 培 養(yǎng) 液 ， 培 養(yǎng) 24hLSCM觀 察 Control Histamine washoutHEK293 cells expressing PLC-PH-GFPA