共聚焦激光掃描熒光顯微鏡 簡(jiǎn)介以及原理PPT課件

什么是什么是共聚焦激光掃描熒光顯微鏡？共聚焦激光掃描熒光顯微鏡？ 共聚焦激光掃描熒光顯微鏡共聚焦激光掃描熒光顯微鏡（LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM ） 以激光作為光源，采用光源針孔與檢測(cè)針孔共軛聚焦技以激光作為光源，采用光源針孔與檢測(cè)針孔共軛聚焦技術(shù)，對(duì)樣本進(jìn)行斷層掃描，以獲得高分辨率光學(xué)切片的熒光顯術(shù)，對(duì)樣本進(jìn)行斷層掃描，以獲得高分辨率光學(xué)切片的熒光顯微鏡系統(tǒng)微鏡系統(tǒng)共聚焦系統(tǒng) 細(xì)胞CT 第1頁(yè)/共31頁(yè)熒光和熒光顯微鏡一、熒光的基礎(chǔ)術(shù)語(yǔ)熒光物質(zhì)： 某些物質(zhì)在特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)出波長(zhǎng)比照射光長(zhǎng)的光線 熒光。受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱熒光物質(zhì)或熒光素激發(fā)光(EXCITATION)： 能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光線稱為該熒光素的激發(fā)光。激發(fā)/吸收光譜；吸收波峰(最大吸收波長(zhǎng))488nm 520nm異硫氰酸熒光素(FITC)發(fā)射光(EMISSION): 發(fā)射光譜；發(fā)射波峰(最大發(fā)射波長(zhǎng))熒光探針： 能產(chǎn)生熒光的特異性生物染料（PI, Dapi)、標(biāo)有熒光素的特異性蛋白結(jié)合物（熒光抗體）自發(fā)熒光(AUTOFLUORESCENCE): 組織或細(xì)胞中的某些成份受激發(fā)時(shí)可發(fā)出熒光自發(fā)熒光。漂白(BLEACH)： 熒光物質(zhì)受激發(fā)時(shí)，其發(fā)射熒光的能力逐漸下降并最終喪失 漂白。第2頁(yè)/共31頁(yè)二、熒光顯微鏡術(shù)的基本原理熒光顯微鏡激發(fā)濾鏡：激發(fā)濾鏡：從光源中分濾出一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光。從光源中分濾出一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光。 帶通濾色鏡帶通濾色鏡( (BP)BP)：有寬、窄帶之分。如：有寬、窄帶之分。如：BP450-490BP450-490 長(zhǎng)、短通濾色鏡組合長(zhǎng)、短通濾色鏡組合（LP LP + + KPKP）：）：LP450 + KP490LP450 + KP490 雙色鏡：雙色鏡：雙色分光鏡；反射短波長(zhǎng)，透過(guò)長(zhǎng)波長(zhǎng)。雙色分光鏡；反射短波長(zhǎng)，透過(guò)長(zhǎng)波長(zhǎng)。阻斷濾鏡：阻斷濾鏡：多為長(zhǎng)通濾色鏡；多為長(zhǎng)通濾色鏡；LP490LP490紫外藍(lán)綠高壓汞燈被熒光探針染色的生物樣本激發(fā)被標(biāo)記結(jié)構(gòu)的熒光光學(xué)圖像光學(xué)成像濾鏡分光488nm 520nmFITC450nm 490nm第3頁(yè)/共31頁(yè)熒光顯微鏡的不足:1.無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光,透射光的同時(shí)采集,無(wú)法實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r(shí)采集及共定位。2.熒光散射光太強(qiáng)，造成實(shí)際分辨率的大大下降。3.熒光漂白及對(duì)細(xì)胞組織的照射損傷。4.無(wú)法對(duì)樣品進(jìn)行斷層掃描,完成3D的工作。5.濾鏡對(duì)熒光信號(hào)衰減大,靈敏度熒光強(qiáng)度不夠。6.可以觀查活細(xì)胞或組織但細(xì)胞或組織內(nèi)結(jié)構(gòu)高度重疊7.只能在二維環(huán)境下觀察。8.樣品不能太厚。9.熒光的串繞無(wú)法回避。10.放大倍率小。第4頁(yè)/共31頁(yè)共聚焦激光掃描熒光顯微鏡基本配置Laserand electronicControl Unit激光光源及控制裝置Computer計(jì)算機(jī)Confocal scan and detector unit 共聚焦掃描及檢測(cè)裝置Microscope熒光顯微鏡Anti-vibration table防震臺(tái)Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System第5頁(yè)/共31頁(yè) Nikon的 Eclipse C1 Plus第6頁(yè)/共31頁(yè) 1.性能卓越的平場(chǎng)復(fù)消色差TIRF物鏡（ 60 x ，100 x）， NA = 1.49.。這是當(dāng)前數(shù)值孔徑最高的油浸物鏡 2.四孔位針孔轉(zhuǎn)盤：用電腦控制針孔的大小，可在分辨率和光切厚度之間取得最佳平衡。 3.時(shí)間間隔可變的Time Lapse: 可以在拍攝過(guò)程中不同的時(shí)間段采用不同的時(shí)間間隔。第7頁(yè)/共31頁(yè) 一、基本組成 （一）激光器:多線氬離子(458 nm, 488 nm, 514 nm) 、氦氖綠(543nm)、氦氖紅(633 nm) （二）掃描器(內(nèi)裝有針孔光欄、分光鏡、發(fā)射熒光單色器及檢測(cè)器) （三）光學(xué)裝置：根據(jù)樣品中熒光信號(hào)的強(qiáng)弱、大小及分布，調(diào)節(jié)激光能量、檢測(cè)孔光欄、光電倍增管（PMT）的檢測(cè)范圍、物鏡和電子放大倍數(shù)（zoom），以利于采集各種熒光信號(hào)。 （四）計(jì)算機(jī)圖像存儲(chǔ)與處理及控制系統(tǒng)：實(shí)現(xiàn)了圖像的優(yōu)化、三維重建，實(shí)現(xiàn)了全自動(dòng)程序化控制采集（檢測(cè)）樣品熒光圖像的時(shí)間和空間，并和同時(shí)采集樣品中多重?zé)晒庑盘?hào)的分解及合成圖像，對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定。第8頁(yè)/共31頁(yè) 一.分辨率（0.1 8m） 二.可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu) 三.無(wú)損傷、連續(xù)光學(xué)切片 四.光譜掃描（分辨由光源波長(zhǎng)，物鏡參數(shù)和針孔直徑等決定，如60X，NA1.4的物鏡水平分辨率約為0.2 m，垂直分辨率約為0.5m。）（細(xì)菌細(xì)胞1-2 m，原核生物細(xì)胞1-10 m）第9頁(yè)/共31頁(yè)第10頁(yè)/共31頁(yè) 利用照明針孔和探測(cè)針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和探測(cè)，并且被探測(cè)點(diǎn)位于焦平面。照明針孔與探測(cè)針孔對(duì)被照射點(diǎn)或被探測(cè)點(diǎn)來(lái)說(shuō)是共軛的，因此被探測(cè)點(diǎn)即共焦點(diǎn)。第11頁(yè)/共31頁(yè)第12頁(yè)/共31頁(yè) 1.點(diǎn)照明（為作圖方便已將光線發(fā)散角放大）第13頁(yè)/共31頁(yè) 假設(shè)是場(chǎng)照明（非共聚焦），會(huì)導(dǎo)致： 一.發(fā)生衍射，使像模糊； 二.散射光干擾（即除了成像點(diǎn)外，其余 點(diǎn)處有散射光進(jìn)入探測(cè)針孔）； 而點(diǎn)照明則不會(huì)有這些問(wèn)題。第14頁(yè)/共31頁(yè)消除衍射影響消除背景雜光第15頁(yè)/共31頁(yè) 2.焦平面點(diǎn)成像第16頁(yè)/共31頁(yè) 焦平面上的像是最清晰的，從上面的圖可以看出，非焦平面點(diǎn)所成 的像的光像被探測(cè)針孔擋住，不會(huì)進(jìn)入光探頭，所以焦平面點(diǎn)成像使像更清晰。第17頁(yè)/共31頁(yè)所以共聚焦成像方式可以很大的提高分辨率和成像質(zhì)量。第18頁(yè)/共31頁(yè) 一. XY軸掃描 二. Z軸掃描第19頁(yè)/共31頁(yè) （1）單光束掃描模式 其中最常見(jiàn)的掃描安排結(jié)合了兩個(gè)獨(dú)立的掃描鏡，具有中繼光學(xué)系統(tǒng)。移動(dòng)的垂直軸的反射鏡即在試樣上產(chǎn)生XY平面的掃描。但中間需要增加高級(jí)別的像差校正光學(xué)系統(tǒng)，導(dǎo)致發(fā)光效率降低。第20頁(yè)/共31頁(yè) （1）單光束掃描模式第21頁(yè)/共31頁(yè) （2）多光束掃描（尼普可夫圓盤掃描） 多光束掃描技術(shù)提供了一個(gè)替代的單光束掃描配置照明效率低，而且掃描速度更快。其中旋轉(zhuǎn)盤掃描儀有數(shù)百個(gè)孔，其功能作為照明和探測(cè)的針孔。由于磁盤掃描顯微鏡形成的實(shí)像，可以直接位于CCD照相機(jī)的圖像平面中。盡管這方面的優(yōu)勢(shì)，它允許實(shí)時(shí)聚焦和成像的動(dòng)態(tài)過(guò)程，有幾個(gè)缺點(diǎn)限制了磁盤掃描共聚焦系統(tǒng)的實(shí)際效用。其中最嚴(yán)重的是典型的依賴于傳統(tǒng)的廣譜光源，和在磁盤發(fā)生極端的光損失。第22頁(yè)/共31頁(yè) （2）多光束掃描第23頁(yè)/共31頁(yè) 奧林巴斯Fluo View300 激光共聚焦掃描系統(tǒng)光電倍增器雙色鏡激發(fā)和發(fā)射濾波滑動(dòng)器強(qiáng)度調(diào)整密度塔激發(fā)發(fā)射和射柱準(zhǔn)直儀電源X-Y檢流計(jì)鏡掃描控制器出入口透鏡系統(tǒng)第24頁(yè)/共31頁(yè)同樣可以實(shí)現(xiàn)XZ軸，YZ軸掃描第25頁(yè)/共31頁(yè) 通常的方法是通過(guò)計(jì)算機(jī)控制的馬達(dá)以預(yù)先設(shè)定的步距移動(dòng)顯微鏡的鏡臺(tái)然后采集圖像。 （當(dāng)然也有通過(guò)改變焦平面位置的方法）第26頁(yè)/共31頁(yè) 通過(guò)精細(xì)平面光切，形成生物樣品不同平面的精細(xì)圖象，將一個(gè)連續(xù)的光切圖通過(guò)精細(xì)平面光切，形成生物樣品不同平面的精細(xì)圖象，將一個(gè)連續(xù)的光切圖象象Z Z軸重疊就可形成一個(gè)完整的三維軸重疊就可形成一個(gè)完整的三維圖象圖象第27頁(yè)/共31頁(yè) 切片的厚度受物鏡的數(shù)值孔徑和針孔直徑影響，比如60X，NA1.4的鏡頭當(dāng)針孔設(shè)定為1mm時(shí)，光學(xué)切片厚度為0.4微米。第28頁(yè)/共31頁(yè) 光電倍增管掃瞄裝置空氣冷卻氬激光器激發(fā)光濾器共焦針孔屏障濾光片(檢流計(jì)物鏡第29頁(yè)/共31頁(yè)謝謝！第30頁(yè)/共31頁(yè)感謝您的觀看！第31頁(yè)/共31頁(yè)