中藥制劑中各類化學(xué)成分分析.doc

第五章中藥制劑中各類化學(xué)成分分析藥物分析教研室第一節(jié) 生物堿類成分分析一, 概述生物堿是生物界除生物體必須的含氮化合物(如氨基酸,蛋白質(zhì)和B族維生素等)之外的所有含氮有機(jī)化合物,因其結(jié)構(gòu)中氮原子上的未共享電子對(duì)而大多具有堿性.生物堿絕大多數(shù)具有顯著的生物活性,且活性是多方面的,因此中藥制劑中有含有生物堿類成分的中藥時(shí),常選擇該中藥含有的生物堿成分作為定性定量的依據(jù). 二, 結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)(一)結(jié)構(gòu)特征生物堿大多由C,H,N,O元素組成,極少數(shù)分子中尚含有其他元素;大多結(jié)構(gòu)復(fù)雜,結(jié)構(gòu)類型較多,主要有雜環(huán)類,大環(huán)類,萜類,甾類及有機(jī)胺類等.結(jié)構(gòu)中的氮原子有多種形式:脂氮,芳氮;季胺,叔胺,仲胺及伯胺;游離狀態(tài)和與酸結(jié)合狀態(tài);還有以氮氧配位鍵形式存在的.此外,結(jié)構(gòu)中除烷烴,羥基取代外還有羧基,酚羥基等酸性官能團(tuán)及酯鍵的取代. (二)理化性質(zhì)1,物理性狀多數(shù)生物堿為結(jié)晶型固體,少數(shù)為無(wú)定型粉末,還有一些小分子生物堿為液體,例如檳榔堿,菸堿等;液體狀的生物堿及個(gè)別小分子生物堿尚有揮發(fā)性甚至升華性,如麻黃堿具有揮發(fā)性,咖啡因具有升華性等.一般生物堿為無(wú)色或白色,但結(jié)構(gòu)中具有較長(zhǎng)共軛體系,并有助色團(tuán)的,可顯不同顏色.生物堿結(jié)構(gòu)中如有手性碳原子或?yàn)槭中苑肿拥木哂行庑?并大多與生物堿的生理活性有關(guān),通常左旋體比右旋體生理活性強(qiáng). 2. 溶解性由于生物堿結(jié)構(gòu)復(fù)雜,生物堿的溶解性也是多樣化.大多數(shù)生物堿成分極性較小,游離狀態(tài)下難溶于水,易溶氯仿,乙醚,乙醇,丙酮及苯等有機(jī)溶劑,與酸結(jié)合生成生物堿鹽后水溶性增加,但與生物堿結(jié)合的酸不同,生成的鹽水溶性也有差異,一般含氧無(wú)機(jī)酸及小分子有機(jī)酸的生物堿鹽水溶性較大.季銨型生物堿,有氮氧配位鍵的生物堿易溶于水,液體生物堿及一些小分子固體生物堿則既溶于水也可溶于有機(jī)溶劑.含有酸性官能團(tuán)或酯鍵的生物堿還可溶于一些堿液或熱苛性堿液. 此外一些液體狀態(tài)的生物堿和分子量較小的固體生物堿,如麻黃堿等具有揮發(fā)性.因此,以中藥制劑中的生物堿為指標(biāo)性成分或特征性組分測(cè)定時(shí),要注意結(jié)合生物堿成分的不同情況采用相應(yīng)的提取分離及凈化方法進(jìn)行前處理. 3. 沉淀反應(yīng)大多數(shù)生物堿在酸性水溶液中可以與某些試劑生成不溶于水的復(fù)鹽或分子復(fù)合物,這些試劑稱生物堿沉淀試劑.生物堿的沉淀試劑根據(jù)其組成有碘化物復(fù)鹽,重金屬鹽和大分子酸三大類.生物堿的沉淀反應(yīng)可以檢查中藥制劑中生物堿的存在,當(dāng)某些沉淀試劑與生物堿生成的沉淀組成恒定時(shí),還可以用于中藥制劑中生物堿成分的含量測(cè)定.但須注意的是中藥水浸出液中尚有蛋白質(zhì),多肽和鞣質(zhì)等成分,也可與生物堿沉淀試劑生成沉淀,產(chǎn)生假陽(yáng)性從而導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)論. 因此,用此反應(yīng)進(jìn)行中藥制劑中生物堿成分的分析時(shí),要用適宜的方法先行處理樣品供試液,排除干擾.常用的生物堿沉淀試劑有碘碘化鉀,碘化鉍鉀,碘化汞鉀,磷鉬酸,磷鎢酸,苦味酸,硫氰酸鉻酸及四苯硼鈉等. 4.顯色反應(yīng)生物堿與一些濃無(wú)機(jī)酸為主的試劑反應(yīng)產(chǎn)生不同的顏色,這些呈色反應(yīng)多用于檢識(shí)和區(qū)別純品生物堿,而較少用于中藥制劑中生物堿成分的分析.生物堿在一定pH條件下可與一些酸性染料(多為磺酸肽類)生成有色絡(luò)合物,可被氯仿等有機(jī)溶劑定量提出;還有些結(jié)構(gòu)中具有酯鍵的酯堿如烏頭堿等可與異羥肟酸鐵試劑反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色,這些特點(diǎn)可用于中藥制劑中生物堿成分的分析.5.堿性大多數(shù)生物堿呈堿性反應(yīng),能使紅色石蕊試紙變藍(lán).生物堿之所以能顯堿性,是因?yàn)樗鼈兎肿又械由系墓码娮訉?duì)對(duì)質(zhì)子有一定程度的親和力,因而表現(xiàn)出堿性. 6.紫外光譜特征結(jié)構(gòu)中具有共軛體系的生物堿均有紫外吸收,其中包括結(jié)構(gòu)母核即為共軛體系的和只有部分結(jié)構(gòu)為共軛系統(tǒng)的. 紫外光譜的吸收峰位置除與其他化合物一樣與共軛系統(tǒng)中助色團(tuán)的種類,位置,數(shù)量有關(guān)外,需要特別指出的是,結(jié)構(gòu)中的氮原子與發(fā)色團(tuán)直接連接或參與發(fā)色團(tuán)的生物堿,其吸收峰位置還與測(cè)定時(shí)溶劑的pH有關(guān). 三,供試液制備進(jìn)行中藥制劑中生物堿成分分析時(shí),制備樣品供試液可根據(jù)不同情況選用乙醇,甲醇,酸水以及堿化后直接用有機(jī)溶劑等溶劑提取,而后進(jìn)行凈化除去干擾成分,凈化的方法主要有溶劑法,沉淀法及氧化鋁吸附色譜法等.一般要根據(jù):分析目的物是總堿還是單體生物堿;主要生物堿的性質(zhì)是水溶性生物堿還是脂溶性生物堿,是強(qiáng)堿還是弱堿等;欲使用的分析方法經(jīng)典的化學(xué)法,分光光度法還是色譜法等因素選擇溶劑和方法. 四, 定性鑒別目前,用于中藥制劑中生物堿成分定性鑒別的方法主要有沉淀法,薄層色譜法,氣相色譜法及高效液相色譜法.其中沉淀法和薄層色譜法為中國(guó)藥典(2005版)收載方法.(一)一般理化鑒別沉淀反應(yīng)是生物堿理化鑒別常用方法,主要利用生物堿能與一些試劑生成沉淀這一特性.此反應(yīng)一般在酸性水溶液中進(jìn)行.由于中藥制劑中成分復(fù)雜,有些成分如蛋白質(zhì),多肽和鞣質(zhì)等也可與試劑生成沉淀而造成假陽(yáng)性結(jié)果,因此,制備樣品供試液時(shí)必須凈化處理,除去干擾成分,方能用沉淀反應(yīng)進(jìn)行中藥制劑中生物堿類成分的鑒別. (二)色譜鑒別1.薄層色譜法 薄層色譜具有分離和鑒定雙重作用,對(duì)于成分復(fù)雜的中藥制劑用薄層色譜法進(jìn)鑒別,可得到滿意的,可靠的鑒別效果.吸附劑:硅膠或氧化鋁薄層色譜,展開劑:多用氯仿,苯等低極性溶劑,加入其化溶劑調(diào)整展開劑的極性.由于硅膠顯弱酸性,強(qiáng)堿性的生物堿在硅膠色譜板上能形成鹽,使Rf值很小或拖尾,形成復(fù)斑.在硅膠吸附薄層色譜中,常用堿性系統(tǒng)或在堿性環(huán)境下展開.顯色劑:常用改良碘化鉍鉀試劑,有時(shí)噴碘化鉍鉀試劑之后再噴硝酸鈉試劑,可使樣品斑點(diǎn)更加清晰.亦可用碘蒸氣,硫酸鈰,碘鉑酸等其化的試劑顯色.2.紙色譜法紙色譜法可用于生物堿鹽或游離堿的鑒別,主要是以水為固定相的正相紙層析,分離效果常取決于流動(dòng)相的性質(zhì).中藥制劑中生物堿紙色譜的顯色劑基本和薄層色譜法的相同,但含硫酸的試劑不適用. 五,含量測(cè)定 生物堿成分含量測(cè)定的方法早期常用酸堿滴定法,沉淀法等經(jīng)典的化學(xué)方法.近年多采用分光光度法,薄層色譜法及高效液相色譜法等. (一)總生物堿含量測(cè)定化學(xué)分析法主要使用酸堿滴定法;強(qiáng)堿滴定生物堿鹽時(shí),在70%-90%的乙醇介質(zhì)中終點(diǎn)比在水中明顯,因此常將生物堿鹽溶于90%乙醇,再用標(biāo)準(zhǔn)堿乙醇液滴定.若選擇的溶劑及指示終點(diǎn)方法合適,還可用非水滴定法進(jìn)行.分光光度法 分光光度法1,直接測(cè)定不經(jīng)過(guò)化學(xué)反應(yīng),利用生物堿物質(zhì)自身的光吸收直接進(jìn)行比色測(cè)定的方法;一般用于藥味較少,干擾不大的中藥制劑中總生物堿的含量測(cè)定; 2,離子對(duì)萃取比色法酸性染料比色法應(yīng)用本法的關(guān)鍵在于介質(zhì)的pH,酸性染料的種類和有機(jī)溶劑的選擇;常用的酸性染料有甲基橙,溴麝香草酚蘭(BTB)和溴甲酚綠等;pH的選擇要根據(jù)染料的性質(zhì)及生物堿的堿性(pKa)大小來(lái)確定;選擇有機(jī)溶劑的原則是根據(jù)離子對(duì)與有機(jī)相能否形成氫鍵以及形成氫鍵能力的強(qiáng)弱而定.氯仿,二氯甲烷與離子對(duì)形成氫鍵,有中等程度的提取率,且選擇性也較好,故是常 用的提取溶劑. 苦味酸鹽比色法在弱酸性或中性溶液中生物堿可與苦味酸定量生成苦味酸鹽沉淀,該沉淀可溶于氯仿等有機(jī)溶劑,也可以在堿性條件下解離釋放出生物堿和苦味酸. 雷氏鹽比色法雷氏鹽(NH4Cr(NH3)2(SCN)4H2O)在酸性介質(zhì)中可與生物堿類成分定量地生成難溶于水的有色絡(luò)合物. 異羥肟酸鐵比色法 含有酯鍵結(jié)構(gòu)的生物堿,在堿性介質(zhì)中加熱,酯健水解,產(chǎn)生的羧基與羥胺反應(yīng)生成異羥肟酸,再與Fe3+生成紫紅色的配合物(異羥肟酸鐵),在一定濃度下符合Beer定律,可用比色法進(jìn)行含量測(cè)定. (二)單體生物堿的含量測(cè)定1,薄層色譜法 生物堿不具有紫外吸收或揮發(fā)性時(shí)可用本法測(cè)定.選用的吸附劑,展開劑及顯色方法與鑒別相似,但要求比鑒別嚴(yán)格.使用改良碘化鉍鉀等作為顯色劑時(shí),必須完全揮干展開劑后(尤其在堿性環(huán)境下展開時(shí))才可噴灑,否則背景深,反差小,影響測(cè)定. 2,高效液相色譜法以反相高效液相色譜應(yīng)用較多;在反相高效液相色譜中,由于硅膠表面殘留硅醇基的影響,使生物堿分析易產(chǎn)生保留時(shí)間延長(zhǎng),峰形變寬,拖尾.可采取改進(jìn)流動(dòng)相,固定相等措施以克服游離硅醇基的影響,滿足定量定量分析的要求.中藥制劑中生物堿成分時(shí)行高效液相色譜法測(cè)定時(shí),使用較多的是紫外檢測(cè)器. 3,氣相色譜法只適用于有揮發(fā)性的,遇熱不分解的生物堿類;生物堿鹽在急速加熱過(guò)程中產(chǎn)生的酸對(duì)色譜柱和檢測(cè)器不利,應(yīng)該注意;制備供試品溶液時(shí)一般應(yīng)采用冷提取,凈化過(guò)程也要避免加熱,以防成分流失,最后需用氯仿等低極性有機(jī)溶劑為溶媒制備成供試液. (三)常見生物堿成分分析中藥制劑中含有生物堿成分的中藥較多,含有的生物堿成分也很復(fù)雜,但作為定性定量的指標(biāo)性成分.第二節(jié) 黃酮類成分分析一,概述黃酮類化合物(flavonoids)是廣泛存在于自然界的一大類化合物.多具有顏色,在植物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成苷,一部分以游離形式存在.黃酮在藻類,菌類中很少發(fā)現(xiàn);苔蘚植物中大都含有;蕨類植物比較普遍存在;裸子植物中也含有但類型較少;黃酮類化合物最集中的是被子植物,類型最全,結(jié)構(gòu)最復(fù)雜,含量也高.由這些中藥參與配伍的中藥制劑也較多見. 二,結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)(一)結(jié)構(gòu)特征黃酮類化合物是指基本母核為2-苯基色原酮類化合物,現(xiàn)在則是泛指兩苯環(huán)通過(guò)中央三碳鏈相互聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物.在植物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成苷,一部分以游離形式存在.根據(jù)基本結(jié)構(gòu)又可分為黃酮,黃酮醇,雙黃酮,異黃酮,二氫黃酮,二氫黃酮醇,查耳酮,橙酮,花青素,黃烷等類型.多數(shù)黃酮結(jié)構(gòu)中存在有桂皮?；氨郊柞；M成的交叉共軛體系,故在200-400nm波長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)有強(qiáng)烈的吸收帶,此是光譜法及色譜光譜法分析的基礎(chǔ).大多黃酮及其苷類含有游離酚羥基,可與聚酰胺形成氫鍵,可用聚酰胺色譜法進(jìn)行分析. (二)理化性質(zhì)1,物理性狀黃酮類化合物多為晶性固體,少數(shù)(如黃酮苷)為無(wú)定形粉末.游離的苷元中,除二氫黃酮,二氫黃酮醇,黃烷及黃烷醇有旋光性外,其余則無(wú).苷類由于在結(jié)構(gòu)中引入糖的分子,故均有旋光性,且多為左旋.2,溶解度 黃酮類化合物的溶解度因結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)(苷或苷元,單糖苷,雙糖苷或三糖苷)不同而有很大差異.游離苷元難溶或不溶于水,易溶于甲醇,乙醇,乙酸乙酯,乙醚等有機(jī)溶劑及稀堿液中.黃酮苷一般易溶于水,甲醇,乙醇等強(qiáng)極性溶劑中,但難溶或不溶于苯,氯仿等. 3,酸堿性酸性:黃酮類化合物因分子中多有酚羥基,故顯酸性,可溶于堿性水溶液,吡啶,甲酰胺及二甲基甲酰胺中.堿性氧原子的性質(zhì)黃酮類化合物分子中-吡喃酮環(huán)上的1-位氧原子,因有未共用的電子對(duì),故表現(xiàn)出微弱的堿性,可與強(qiáng)無(wú)機(jī)酸,如濃硫酸,鹽酸等生成鹽,常表現(xiàn)出特殊的顏色,可用于鑒別.生成的鹽極不穩(wěn)定,加水后即可分解. 4,顯色反應(yīng)還原反應(yīng):與鹽酸鎂粉(或鋅粉)反應(yīng),金屬鹽類試劑的絡(luò)合反應(yīng):黃酮類化合物分子中多有下列結(jié)構(gòu),故?？膳c鋁鹽,鉛鹽,鋯鹽,鎂鹽等試劑反應(yīng),生成有色絡(luò)合物. 鋁鹽:常用試劑為1%三氯化鋁或硝酸鋁溶液.生成的絡(luò)合物多為黃色(max=415nm),并有熒光,可用于定性及定量分析.鉛鹽:常用1%醋酸鉛及堿式醋酸鉛水溶液,可生成黃至紅色沉淀.據(jù)此不僅可用于鑒定,也可用于提取及分離工作.鋯鹽:多用2%二氯氧化鋯甲醇溶液.黃酮類化合物分子中有游離的3-或5-OH存在時(shí),均可反應(yīng)生成黃色的鋯絡(luò)合物.但兩種鋯絡(luò)合物對(duì)酸的穩(wěn)定性不同,當(dāng)反應(yīng)液中接著加入枸櫞酸后,5-羥基黃酮的黃色溶液顯著褪色,而3-羥基黃酮溶液的呈鮮黃色(鋯枸櫞酸反應(yīng)). 5,紫外光譜特征黃酮類由于具有2-苯基色原酮的基本結(jié)構(gòu),具有特定的紫外吸收峰,常有兩個(gè)較強(qiáng)的吸收帶,I帶在300400nm范圍內(nèi),它是由于B環(huán)桂皮?；鸬?帶為240285nm范圍內(nèi),它是由于A環(huán)上的苯甲?；鸬?黃酮類化合物當(dāng)加入一些位移試劑如甲醇鈉,醋酸鈉,氯化鋁等,可使最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生位移,選擇性提高,還可消除雜質(zhì)的干擾,有利于含量測(cè)定. 三,定性鑒別(一)顯色反應(yīng)黃酮類化合物的顏色反應(yīng)多與分子中的酚羥基及-吡喃酮環(huán)有關(guān). 常用鹽酸-鎂粉(或鋅粉)反應(yīng) 與金屬鹽類試劑的配合反應(yīng) 黃酮類化合物分子中有游離的3-OH,5-OH或鄰二酚羥基時(shí)可與Al3+,Zr4+,Pb2+,Sr2+等形成絡(luò)合物,這些絡(luò)合物有的產(chǎn)生熒光或顏色加深(如Al3+,Zr4+),有的產(chǎn)生沉淀(如Pb2+,Sr2+) (二)色譜鑒別吸附劑:硅膠,聚酰胺;硅膠色譜分離弱極性化合物較好;聚酰胺色譜他離含游離酚羥游離羥基的黃酮及其苷為佳;纖維素薄層則適用于分離多糖苷混合物;顯色反應(yīng):采用在紫外光下觀察熒光和噴顯色劑相配合的方法. 四,黃酮類成分定量分析 中藥制劑中如含有黃酮類成分,可根據(jù)要求測(cè)定制劑中的總黃酮含量,黃酮類單體成分的含量或二者同時(shí)測(cè)定.直接測(cè)定:黃酮類化合物具有特定的紫外吸收峰,含黃酮類化合物的原料藥及部分制劑經(jīng)一定的提取純化后,可直接于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收度,以蘆丁等為對(duì)照品計(jì)算其含量.顯色測(cè)定:黃酮類化合物顯色以后顯色物與背景最大吸收波長(zhǎng)差別較大,可消除背景(即陰性空白)的干擾,以提高本法的選擇性及靈敏度.常用鋁鹽作顯色試劑.(二)黃酮類單體成分的含量測(cè)定1,薄層色譜法樣品經(jīng)有機(jī)溶劑或水提取后,可用硅膠,纖維素或聚酰胺進(jìn)行層析,達(dá)到分離目的.層析后可將含有待測(cè)組分的色斑刮下,再用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵摵?用紫外-可見分光光度法測(cè)定.更常用的是薄層掃描儀(單波長(zhǎng)或雙波長(zhǎng)法)直接在薄層板上掃描測(cè)定. 2,高效液相色譜法由于黃酮類化合物在紫外區(qū)有較強(qiáng)的吸收,使用HPLC法檢測(cè)靈敏度較高,故該法在黃酮類單體成分的定量分析中最常用.黃酮類成分的HPLC條件他為正相和反相色譜兩類,反相色譜應(yīng)用較多.反相色譜測(cè)定多有C18鍵合相固定液,流動(dòng)相常用甲醇-水-乙酸(或磷酸緩沖液)及乙腈-水.檢測(cè)器主要采用紫外檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器. 第三節(jié) 三萜皂苷類成分分析 一,概述 三萜是由30個(gè)碳原子組成的萜類化合物,大多數(shù)三萜化合物均可看作由6個(gè)異戊二烯單位聯(lián)結(jié)而成.游離三萜類化合物通常多不溶于水,而與糖結(jié)合成苷后,則大多可溶于水,振搖后可生成膠體溶液,并有持久性似肥皂溶液的泡沫,故有三萜皂苷之稱. 二,理化性質(zhì)溶解度可溶于水,易溶于熱水,含水稀醇,熱甲醇和熱乙醇中,幾乎不溶于或難溶于乙醚,苯等極性小的有機(jī)溶劑.在含水丁醇或戊醇中溶解度較好,且又能與水分成二相,可利用此性質(zhì)從水溶液中用正丁醇或戊醇提取皂苷,借以與親水性的糖,蛋白質(zhì)等分離.三萜皂苷元能溶于石油醚,苯,乙醚,氯仿等有機(jī)溶劑,而不溶于水.顯色反應(yīng)醋酐-濃硫酸反應(yīng)(Liebermann-Burchard反應(yīng));五氯化銻反應(yīng)(Kahlenberg反應(yīng));三氯醋酸反應(yīng)(Rosen-Heimer反應(yīng));冰醋酸-乙酰氯反應(yīng)(Tschugaeff反應(yīng));氯仿-濃硫酸反應(yīng)(Salkowski反應(yīng)). 三,定性鑒別:理化鑒別泡沫反應(yīng):多用于檢驗(yàn)含有皂苷的原料藥;化學(xué)顯色反應(yīng):僅在組成藥物較少的中藥制劑中使用.薄層色譜法由于皂苷類成分大多無(wú)明顯的紫外吸收,故經(jīng)薄層色譜分離,然后選用適當(dāng)?shù)娘@色劑顯色觀察,是皂苷定性鑒別中最常用的方法.三萜皂苷類成分進(jìn)行薄層層析時(shí)通常采用硅膠為吸附劑,也有采用氧化鋁,硅藻土等為吸附劑.薄層層析后,可選用三氯醋酸,氯磺酸-醋酸,50%及10%硫酸乙醇液,三氯化銻,磷鉬酸,濃硫酸-醋酸酐,碘蒸氣等顯色劑進(jìn)行顯色,其中以不同濃度的硫酸乙醇液為最常用.四,三萜皂苷類成分的定量分析中藥制劑中皂苷類成分的定量分析可分為總皂苷測(cè)定,皂苷元測(cè)定和單體皂苷測(cè)定.(一)總皂苷的含量測(cè)定1,提取分離總皂苷的含量測(cè)定一般需要用適當(dāng)?shù)娜軇┨崛?由于皂苷在極性溶劑中溶解度較大,因此提取溶劑可為各種濃度的甲醇(70%-95%),乙醇,異丙醇,丁醇,戊醇.提取后經(jīng)分離得到總皂苷成分,分離可用有機(jī)溶劑,如水飽和的正丁醇萃取,也可用大孔吸附樹脂處理后溶劑洗脫.2,測(cè)定方法重量法該方法主要用于含皂苷的原料藥質(zhì)量控制.在中藥制劑中,如處方中藥味含皂苷類成分較多時(shí),常用正丁醇作溶劑,測(cè)定正丁醇浸出物.比色法常用三萜皂苷顯色劑有香草醛-硫酸,香草醛-高氯酸,醋酐-硫酸,高氯酸,濃硫酸以及亞甲藍(lán)等.用比色法測(cè)定中藥制劑中總皂苷或總苷元的含量時(shí),可選用單體皂苷或皂苷元作對(duì)照品,但要注意測(cè)定單體皂苷或皂苷元與總皂苷的換算系數(shù).(二)皂苷元的含量測(cè)定皂苷元的獲得:得到總皂苷后,加酸(如硫酸,鹽酸)加熱水解,得到皂苷元;將樣品先行水解,再用有機(jī)溶劑從水解后的溶液中提取皂苷元.測(cè)定方法:主要有薄層色譜法,高效液相色譜法和比色法.(三) 三萜皂苷類單體成分含量測(cè)定1,薄層色譜法樣品經(jīng)適當(dāng)?shù)奶崛?純化后,用薄層色譜法分離,可排除其他組分的干擾,常用于測(cè)定中藥制劑中的皂苷元或單體皂苷,定量方法可采用薄層洗脫比色法或薄層掃描法.2,高效液相色譜法大多數(shù)三萜皂苷類成分,如人參皂苷,三七皂苷等可利用其在紫外區(qū)的末端吸收來(lái)檢測(cè),但靈敏度相對(duì)要低.若中藥制劑中所含三萜皂苷類成分本身具有較強(qiáng)的紫外吸收,如甘草酸,遠(yuǎn)志皂苷等,可用HPLC分離并用紫外檢測(cè)器檢測(cè).蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)用于高效液相色譜法檢測(cè)三萜皂苷類成分的應(yīng)用日漸廣泛. 第四節(jié) 醌類成分分析一,概述中藥中醌類化合物主要有苯醌,萘醌,菲醌和蒽醌四種類型.其中以蒽醌類化合物最為多見,包括蒽醌及其不同還原程度的產(chǎn)物和二聚物,如蒽酚,氧化蒽酚,蒽酮,二蒽酮,二蒽醌等.這些化合物在中藥中可游離存在,也可與糖結(jié)合成苷,稱為蒽苷. 二,結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)(一)結(jié)構(gòu)類型及特征苯醌類苯醌類化合物從結(jié)構(gòu)上可分為鄰苯醌及對(duì)苯醌兩大類.因前者不穩(wěn)定,故天然存在的苯醌化合物多為對(duì)苯醌的衍生物,且在醌核上多有-OH,-OCH3,-CH3等基團(tuán)或更長(zhǎng)的烴類側(cè)鏈. 對(duì)苯醌 鄰苯醌 2,萘醌類萘醌化合物從結(jié)構(gòu)上考慮可以有(1,4),(1,2)及amphi(2,6)三種類型.但迄今為止從自然界得到的幾乎均為-萘醌類.-(1,4)萘醌 -(1,2)萘醌 amphi-(2,6)萘醌 3,菲醌類天然菲醌衍生物包括鄰醌(A)及對(duì)醌(B)兩種類型.(A) (B)4,蒽醌類蒽醌類成分包括蒽醌衍生物及其不同還原程度的產(chǎn)物,如氧化蒽酚,蒽酚,蒽酮及蒽酮的二聚物等.蒽醌 氧化蒽酚 蒽酮 蒽酚理化性質(zhì)1,溶解性苯醌及萘醌多以游離狀態(tài)存在;而蒽醌類則往往結(jié)合成苷存在于植物體中;游離的醌類多具有升華性;小分子的苯醌及萘醌類具有揮發(fā)性,能隨水蒸氣蒸餾,可據(jù)此進(jìn)行提取,精制工作.游離醌類多溶于乙醇,乙醚,苯,氯仿等有機(jī)溶劑,微溶于或不溶于水.結(jié)合成苷后極性增大,易溶于甲醇,乙醇中,在熱水中也可溶解,幾乎不溶于乙醚,苯,氯仿等非極性溶劑中. 2,酸堿性蒽醌類化合物分子中多具有酚羥基,故具有一定酸性,在堿性水溶液中易溶,但加酸酸化時(shí)又可重新沉淀析出,所謂堿提取酸沉淀即是根據(jù)這個(gè)道理進(jìn)行的.根據(jù)以上性質(zhì),醌類化合物的提取可采用堿提取-酸沉淀法.3,顯色反應(yīng)醌類的顏色反應(yīng)主要取決于其氧化還原性質(zhì)以及存在的酚羥基的性質(zhì).堿性條件下的呈色反應(yīng):羥基蒽醌類在堿性溶液中會(huì)引起顏色改變并加深.與金屬離子的反應(yīng):在蒽醌類化合物結(jié)構(gòu)中,如果有-酚羥基或具有鄰位二酚羥基時(shí),則可與Pb2+,Mg2+等金屬離子形成絡(luò)合物.與Pb2+形成的絡(luò)合物在一定pH條件下能沉淀析出,故可用于該化合物的精制.與對(duì)亞硝基二甲基苯胺反應(yīng):9位或10位未取代的羥基蒽酮類化合物,尤其是1,8-二羥基衍生物,酮基對(duì)位的亞甲基上的氫很活潑,可與對(duì)亞硝基二甲基苯胺反應(yīng),縮合產(chǎn)生各種顏色. 三,定性鑒別1,顯色反應(yīng)將中藥制劑用適當(dāng)方法提取分離,制成供試品液,利用堿性條件下的呈色反應(yīng)或醋酸鎂顯色反應(yīng)等可對(duì)羥基蒽醌類成分進(jìn)行鑒別.2,升華法游離的蒽醌及其他醌類衍生物多具有升華性.中藥制劑中如含有這類成分量較大,可采用升華法得到升華物,可見光下觀察或加堿性試液顯色定性.如大黃流浸膏的鑒別.3,薄層鑒別1)吸附劑:多用硅膠2)展開劑:A:乙酸乙酯-甲醇-水(100:16.5:13.5或相近的比例),適于他離蒽醌苷元和蒽醌苷. B:正丙醇-乙酸乙酯-水(4:4:3)和異丙醇-乙酸乙酯-水(9:9:4),適于分離番瀉苷和二蒽酮苷 C:不含水或甲醇的混合溶媒適合于他離蒽醌類的苷元.3)顯色方法:主要有噴堿性試劑或醋酸鎂甲醇液,氨氣熏及在紫外燈下觀察熒光,亦可在可見光下直接觀察色斑. 四,含量測(cè)定蒽醌類成分含量測(cè)定1,游離蒽醌的測(cè)定中藥中含有游離蒽醌的量一般不高,且為脂溶性的,故此部分另用弱極性溶劑如乙醚,氯仿等提取后加堿比色測(cè)定. 2,結(jié)合蒽醌的測(cè)定通常是取游離蒽醌測(cè)定項(xiàng)下的藥渣將苷提出,水解成苷元后再測(cè)定;將藥渣先行酸水解,然后用非極性溶劑提取苷元后測(cè)定;取待測(cè)樣品先行酸水解,然后用非極性溶劑提取苷元后測(cè)定,其結(jié)果為總蒽醌含量,從中減去游離蒽醌含量,即得結(jié)合蒽醌的含量. 3,蒽醌類單體成分的測(cè)定中藥制劑中蒽醌類單體成分的測(cè)定一般要將樣品水解后再進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定方法主要有薄層掃描法和高效液相色譜法.薄層掃描法為蒽醌類成分常用定量分析方法,經(jīng)層析分離后,可在可見光,紫外光及熒光下掃描測(cè)定.蒽醌類成分在紫外及可見光下均有強(qiáng)吸收,利用高效液相色譜-紫外可見光檢測(cè)器測(cè)定蒽醌類單體成分,具有靈敏,準(zhǔn)確,簡(jiǎn)便等特點(diǎn).在含蒽醌類化合物的中藥制劑分析中應(yīng)用日趨增多.第五節(jié) 揮發(fā)性成分分析 一,概述揮發(fā)性成分是指中藥中一類具有芳香氣并易揮發(fā)的成分,其化學(xué)組成復(fù)雜,主要包括揮發(fā)油類成分和其他分子量較小,易揮發(fā)的化合物.揮發(fā)油為易流動(dòng)的油狀液體,具香味和揮發(fā)性,可隨水蒸汽蒸餾. 二,結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)(一)結(jié)構(gòu)特征揮發(fā)油中成分按化學(xué)結(jié)構(gòu)分類,可分為萜類化合物,脂肪族化合物及芳香族化合物等.顯色反應(yīng)揮發(fā)油中若含有酚類成分,加入三氯化鐵的乙醇溶液,可產(chǎn)生藍(lán)色,藍(lán)紫色或綠色反應(yīng);若含有羰基化合物,加入苯肼或苯肼衍生物,羥胺等試劑,可生成結(jié)晶性的衍生物;若含有醛類化合物,加入硝酸銀氨試液,可發(fā)生銀鏡反應(yīng);若含有內(nèi)酯類化合物,于樣品的吡啶溶液中加入亞硝酰鐵氰化鈉及氫氧化鈉溶液,出現(xiàn)紅色并逐漸消失;若含有不飽和化合物,于樣品中加入溴,紅棕色褪去;若含有奧類衍生物,加入濃硫酸,可產(chǎn)生藍(lán)色或紫色反應(yīng). (二)薄層色譜法揮發(fā)油成分薄層色譜的條件主要是根據(jù)極性大小加以分離的.油中所含各類化合物的極性順序?yàn)?烴(萜)<醚<酯<醛,酮<醇,酚<酸 因此可試用不同極性的展開劑進(jìn)行分離常用的吸附劑為硅膠,氧化鋁等,其中以硅膠常用常用展開劑為石油醚或正己烷,可使不含氧的烴類成分展開,而含氧化合物一般留在原點(diǎn). 常用的薄層顯色劑有:茴香醛-濃硫酸試劑:與揮發(fā)油中各成分產(chǎn)生多種鮮艷的顏色.2%高錳酸鉀水溶液:在粉紅色背景產(chǎn)生黃色斑點(diǎn)時(shí)表明含不飽和化合物.熒光素-溴試劑:在長(zhǎng)波長(zhǎng)的紫外光燈下觀察,如薄層斑點(diǎn)顯黃色熒光,則表明含乙烯基化合物.2.4-二硝基苯肼試劑:噴試劑后如產(chǎn)生黃色斑點(diǎn)表明可能含有醛或酮類化合物.異羥肟酸鐵試劑:噴試劑后如產(chǎn)生淡紅色斑點(diǎn)表明含有內(nèi)酯類化合物 .三氯化鐵試劑:斑點(diǎn)顯藍(lán)色或綠色,含有酚性物質(zhì).0.05%溴酚藍(lán)乙醇溶液:斑點(diǎn)顯黃色表明含酸類物質(zhì).硝酸鈰銨試劑:在黃色背景上顯棕色斑點(diǎn),表明含有醇類物質(zhì).對(duì)二甲氨基苯甲醛試劑:在80加熱10分鐘,顯深藍(lán)色,可能含類物質(zhì).碘化鉀-冰醋酸-淀粉試劑:斑點(diǎn)顯藍(lán)色表明含過(guò)氧化物. 四,含量測(cè)定含量測(cè)定可分為總揮發(fā)油和單一成分的測(cè)定.總揮發(fā)油的測(cè)定,采用揮發(fā)油測(cè)定器,用蒸餾法測(cè)定,可分別測(cè)定相對(duì)密度在1.0以下和1.0以上的揮發(fā)油含量. 單一成分測(cè)定:主要采用氣相色譜法和薄層色譜法. 第六節(jié) 木脂素類成分分析一,概述木脂素是一類在生物體內(nèi)由二分子苯丙素衍生物聚合而成的化合物. 二,理化性質(zhì)溶解性游離的木脂素具親脂性,一般難溶于水,在石油醚中溶解度較小,易溶于苯,氯仿,乙醚,丙酮及乙醇等有機(jī)溶劑,具有酚羥基的木脂素類還可溶于苛性堿水溶液中.木脂素與糖結(jié)合成苷時(shí)則親水性增加,對(duì)水的溶解性增大,也可溶于甲醇,乙醇.顯色反應(yīng)木脂素類沒有共有的特征顏色反應(yīng),但對(duì)于一些非特征性試劑如磷鉬酸乙醇溶液,硫酸乙醇溶液等,不同的木脂素化合物可顯示不同的顏色,常用于薄層色譜的顯色.Labat 反應(yīng) 可作為具有亞甲二氧基的木脂素的特征反應(yīng),化合物加濃硫酸,再加沒食子酸,可產(chǎn)生藍(lán)綠色.Ecgrine反應(yīng) 如以變色酸代替沒食子酸,并保持溫度在70-80,20min,可產(chǎn)生藍(lán)紫色. 紫外光譜特征多數(shù)木脂素的UV光譜具有苯環(huán)的特征吸收,并且其二個(gè)取代芳環(huán)是二個(gè)孤立的發(fā)色團(tuán),UV吸收峰位置在250350nm之間,吸收強(qiáng)度是二者的總和,立體結(jié)構(gòu)對(duì)紫外光譜影響不大,苯環(huán)上取代基可影響峰的位置.四.定性鑒別一般理化鑒別利用木脂素分子結(jié)構(gòu)中的功能基具有的顏色反應(yīng)來(lái)檢識(shí)它們.色譜鑒別中國(guó)藥典(2005版)中凡以木脂素成分為指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)的,使用的方法均為薄層色譜法.木脂素類成分一般具有較強(qiáng)的親脂性,采用吸附色譜法可獲得較好的分離效果,常用硅膠薄層色譜.顯色方法大多用香草醛試劑和10%濃硫酸試劑, 110加熱5min,除此之外還可用5%10%磷鉬酸乙醇液,碘蒸氣熏后呈黃棕色或置紫外燈下觀察熒光. 五.含量測(cè)定總木脂素成分含量測(cè)定總木脂素類含量測(cè)定方法可采用變色酸比色法,二階導(dǎo)數(shù)光譜法及柱色譜比色法等.變色酸比色法是根據(jù)某些木脂素成分,其結(jié)構(gòu)中亞甲二氧基與變色酸/濃硫酸試劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色進(jìn)行比色測(cè)定含量,本方法要求供試液純度較高.單體木脂素成分的含量測(cè)定薄層色譜法:以硅膠為吸附劑,低極性有機(jī)溶劑展開.高效液相色譜法:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,乙腈-水或甲醇-水系統(tǒng)為流動(dòng)相,多用紫外檢測(cè)器測(cè)定. 第七節(jié) 其他類型成分分析 (一)概述概念:有機(jī)酸按結(jié)構(gòu)可分為三類,即脂肪類,芳香族類和萜類.按羧基數(shù)目可分為單羧基酸,二羧基酸和三羧基酸.(二)定性鑒別薄層色譜法吸附劑:常用硅膠,聚酰胺等.展開劑:常用極性較大的溶劑,為防有機(jī)酸展開過(guò)程中發(fā)生離解,常在展開劑中加入一定比例的甲酸或乙酸等以消除因解離而產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象.顯色劑:常用pH指示劑,如溴甲酚綠,溴甲酚紫,溴酚藍(lán),磷鉬酸試劑等.具有熒光的物質(zhì)如綠原酸,阿魏酸等,可不必顯色,在熒光燈下觀察熒光.(三)含量測(cè)定酸堿滴定法本法適合于測(cè)定總有機(jī)酸類成分,由于中藥中有機(jī)酸類成分酸性弱,在水溶液中滴定突躍不明顯,可用非水溶液滴定法.滴定液顏色較深時(shí),影響觀察滴定終點(diǎn),采用電位法指示終點(diǎn).高效液相色譜法芳香族酸類和其他具有紫外吸收的酸類,可用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定,如綠原酸,沒食子酸,桂皮酸,丹參素,阿魏酸等. 分光光度法 可用單波長(zhǎng)法,雙波長(zhǎng)法,導(dǎo)數(shù)分光光度法測(cè)定有機(jī)酸的含量.薄層掃描法脂肪酸類,萜類等一些不具有紫外吸收的酸類物質(zhì)可用薄層色譜分離,再選用合適的顯色劑,顯色后測(cè)定.脂肪酸類如蘋果酸,丁二酸,丙二酸,枸櫞酸,酒石酸可用溴酚蘭,溴甲酚綠等pH指示劑為顯色劑;萜類物質(zhì)如熊果酸,齊墩果酸可用硫酸乙醇,磷鉬酸試劑等為顯色劑.可產(chǎn)生熒光的化合物可用薄層分離后用熒光法測(cè)定,如阿魏酸,綠原酸等化合物. 二,環(huán)烯醚萜類成分分析(一)概述概念環(huán)烯醚萜:一類特殊的單萜,由二個(gè)異戊二烯構(gòu)成,含有10個(gè)碳原子,其母核都為環(huán)狀,具有烯鍵和醚鍵,常與糖結(jié)合成苷.溶解性:大多易溶于水,甲醇,可溶于乙醇,丙酮,正丁醇.對(duì)酸敏感:成苷后苷鍵易被水解斷裂,苷元結(jié)構(gòu)中C1的羥基和C2位的氧是一個(gè)半縮醛結(jié)構(gòu),化學(xué)性質(zhì)活潑,易發(fā)生進(jìn)一步氧氣化聚合等反應(yīng),尤其在酸堿作用下更易變化.(二)定性鑒別利用薄層色譜可對(duì)環(huán)烯醚萜苷類成分進(jìn)行定性鑒別.薄層板:(1)硅膠G;(2)硅膠GF254;(3)聚酰胺薄膜.顯色劑:(1)硫酸乙醇溶液;(2)茴香醛試液;(3)香草醛硫酸試液;(4)對(duì)二甲氨基苯甲醛-硫酸溶液.(三)含量測(cè)定高效液相色譜法:對(duì)于有紫外吸收的環(huán)烯醚萜苷類成分可用該項(xiàng)法進(jìn)行分析.薄層掃描法:可用硅膠GF254薄層,檢測(cè)熒光熄滅斑點(diǎn);也可用硅膠G薄層,用顯色劑顯色后測(cè)定.分光光度法:利用環(huán)烯醚萜苷與某些試劑的呈色反應(yīng),于分光光度計(jì)上測(cè)定吸收度進(jìn)行定量分析. 三,香豆素類成分分析(一)概述概念:香豆素是一類內(nèi)酯衍生物,具有芳香氣,分子中苯環(huán)或吡喃酮環(huán)上常有取代基存在,按其基本的環(huán)狀結(jié)構(gòu)形式,分為簡(jiǎn)單香豆類,呋喃香豆素類,吡喃香豆素類,其他香豆素類.(二)理化性質(zhì)顯色反應(yīng) 異羥肟酸鐵反應(yīng)內(nèi)酯環(huán)在堿性條件下開環(huán),與鹽酸羥胺縮合成異羥肟酸,然后再在酸性條件下與三價(jià)鐵離子配合成鹽而顯紅色. 與酚羥基反應(yīng)具有酚羥基取代的香豆素類在水溶液中可與FeCl3試劑產(chǎn)生顏色.若香豆素化合物的C6位上(即酚羥基的對(duì)位)沒有取代基,則能與Gibbs試劑反應(yīng)顯藍(lán)色.香豆素類成分在堿性溶液中加熱,使內(nèi)酯環(huán)開裂,若酚羥基對(duì)位無(wú)取代基,則可與重氮化試劑反應(yīng)生成紅色偶氮染料. 紫外光譜特征化合物的結(jié)構(gòu)中羰基和芳環(huán)形成較強(qiáng)的共軛體系,因此在紫外光區(qū)具有很強(qiáng)的特征吸收,紫外吸收光譜一般在300nm左右(lg為4左右)有最大吸收,吸收峰的位置與取代基有很大關(guān)系.香豆素母核本身無(wú)熒光,而羥基香豆素在紫外光下大多數(shù)能顯藍(lán)色熒光,這是因?yàn)榱u基能增強(qiáng)分子熒光的緣故.香豆素類熒光的有無(wú)或強(qiáng)弱與分子中取代基的種類和位置有關(guān).香豆素的熒光性質(zhì)在薄層色譜中可用于定性鑒別和定量分析. (三)定性鑒別熒光法羥基香豆素大多能產(chǎn)生熒光,利用此性質(zhì)可進(jìn)行定性鑒別.可直接觀察提取溶液的熒光,也可觀察薄層斑點(diǎn)熒光.薄層色譜法具有熒光的香豆素類成分,可用薄層色譜熒光法進(jìn)行鑒別不具熒光或熒光強(qiáng)度較弱的香豆素可用顯色劑或噴灑堿溶液以增強(qiáng)熒光再進(jìn)行觀察.(四)含量測(cè)定1,分光光度法利用香豆素類成分的顏色反應(yīng),生成有色物質(zhì),于可見光波長(zhǎng)區(qū)域進(jìn)行測(cè)定.香豆素類成分都具有紫外吸收,樣品較純凈時(shí),也可于紫外光區(qū)域直接測(cè)定. 2,薄層掃描法本法為香豆素類成分常用測(cè)定方法之一,樣品經(jīng)薄層分離后,于熒光燈下定位,利用香豆素類成分具有紫外吸收或能產(chǎn)生熒光的特性,不經(jīng)顯色,直接進(jìn)行掃描測(cè)定. 3,熒光光度法羥基香豆素類成分大多能產(chǎn)生較強(qiáng)烈熒光,用熒光光度法進(jìn)行測(cè)定有較高的靈敏度.當(dāng)干擾成分較多時(shí),可先用薄層分離,刮取薄層洗脫被測(cè)成分后再用熒光光度法進(jìn)行測(cè)定,但本法不及薄層掃描法簡(jiǎn)便,刮取薄層洗脫時(shí)易引起誤差. 4,高效液相色譜法香豆素類成分含有芳香環(huán)及其它共軛結(jié)構(gòu),用HPLC測(cè)定時(shí),有較高的靈敏度,常用固定相為C18,流動(dòng)相為不同比例的甲醇水,5,氣相色譜法某些分子量小,具有揮發(fā)性的香豆素類成分,可用氣相色譜法測(cè)定,如蛇床子素,歐前胡素,香柑內(nèi)酯,異虎耳草素,花椒毒素,花椒毒酚等成分可用GC測(cè)定,常用SE-30石英毛細(xì)管柱,FID檢測(cè)器. 四,單萜及二萜類成分分析 1,含芍藥苷中藥制劑的分析(1)定性鑒別芍藥苷的定性鑒別,多用薄層色譜法.可用硅膠GF254薄層板分離后于紫外光燈(254nm)下直接觀察,但斑點(diǎn)色澤較淺,也可用顯色劑顯色后進(jìn)行鑒別.常用的薄層吸附劑為硅膠G,硅膠GF254,顯色劑有:10%硫酸乙醇溶液;5%香草醛硫酸溶液;5%茴香醛-5%硫酸乙醇溶液;稀鹽酸;碘蒸氣.(2)含量測(cè)定具有紫外吸收,但不能產(chǎn)生熒光,在硅膠GF254薄板上可產(chǎn)生暗色斑點(diǎn),所以芍藥苷常用的定量方法為高效液相色譜法和薄層掃描法. 2,含穿心蓮中藥制劑的分析 結(jié)構(gòu)中含有,不飽和內(nèi)酯,其紫外吸收光譜為max223nm,可利用此結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行鑒別和含量測(cè)定 .定性鑒別:多采用薄層色譜法進(jìn)行鑒別具有紫外吸收,在硅膠CF254薄層板上呈現(xiàn)暗斑點(diǎn),也可用硅膠G薄層,用顯色劑顯色后進(jìn)行觀察.常用的顯色劑:A碘蒸氣;B2%的3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液與7%氫氧化鉀溶液的等量混合液.含量測(cè)定穿心蓮總內(nèi)酯的測(cè)定可根據(jù)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)在pH=8以上水解開環(huán)的性質(zhì),用氫氧化鈉水解,以酸回滴剩余堿間接測(cè)定總內(nèi)酯含量;利用比色法測(cè)定;用以上兩種方法測(cè)定總內(nèi)酯含量時(shí),要注意其他雜質(zhì)的干擾,需要經(jīng)過(guò)凈化預(yù)處理再進(jìn)行測(cè)定;穿心蓮單體內(nèi)酯的測(cè)定薄層分離后用紫外分光光度法測(cè)定用薄層掃描或高效液相色譜法測(cè)定五,多糖多糖又稱多聚糖(polysaccharides),通常是由D-葡萄糖,D-半乳糖,L-阿拉伯糖,L鼠李糖,D-半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等十個(gè)以上的單糖基通過(guò)苷鍵連接聚合而成的高分子物質(zhì).理化性質(zhì)無(wú)甜味,無(wú)還原性.一般分為兩類,一類為水不溶的,主要是形成動(dòng)植物的支持組織,如纖維素,甲殼素等,分子呈直糖鏈型;另一類為動(dòng)植物的貯存養(yǎng)料,可溶于熱水成膠體溶液,如淀粉,肝糖元等,多數(shù)為支糖鏈型. (二)鑒別1. 薄層色譜法多糖可采用酸水解法將其水解成較小片段,然后進(jìn)行薄層色譜鑒別.硅膠色譜,纖維素色譜,硅藻土色譜及氧化鋁色譜.由于糖是多羥基化合物,極性強(qiáng)容易吸附,采用含有無(wú)機(jī)鹽水溶液,如0.3mol/L磷酸二氫鈉水溶液制備硅膠薄層板,使硅膠薄層吸附能力降低,斑點(diǎn)集中,對(duì)分離有所改善,樣品承載量顯著提高. 2. 紙色譜法多糖可采用酸水解法將其水解成單糖,然后進(jìn)行紙色譜;也可用某些系統(tǒng)直接將多糖展開.總多糖的測(cè)定3.5-二硝基水楊酸(DNS)比色法在堿性溶液中,3.5-二硝基水楊酸與還原糖生成棕紅色氨基化合物,在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈比例關(guān)系,利用比色法可測(cè)定樣品中糖含量.苯酚-硫酸法苯酚-硫酸試劑可與游離的或多糖中的已糖,糖醛酸起顯色反應(yīng),已糖在490nm波長(zhǎng)處,戊糖及糖醛酸在480nm波長(zhǎng)處有最大吸收,吸收度與糖含量呈線性關(guān)系. 蒽酮-硫酸法糖類與硫酸發(fā)生脫水反應(yīng),生成糠醛或其衍生物,可與蒽酮試劑縮合產(chǎn)生顏色物質(zhì),反應(yīng)后溶液呈藍(lán)綠色,于620nm波長(zhǎng)處有最大吸收,吸收度與多糖含量呈線性關(guān)系. 單體多糖的含量測(cè)定單體多糖多采用高效凝膠液相色譜法,以已知分子量的多糖對(duì)照品作對(duì)照,確定其分子量.再將其酸水解后進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定,確定其組成(單糖的種類及比例),以單糖的量推算多糖的量.檢測(cè)器多為示差折光檢測(cè)器,通常用氨基鍵合硅膠柱分離,但其穩(wěn)定性差,用硅膠柱動(dòng)態(tài)改性,可避免這一問題.