大腸桿菌高效表達(dá)重組蛋白策略.doc

大腸桿菌高效表達(dá)重組蛋白策略前言重組蛋白的制備在蛋白結(jié)構(gòu)分析和醫(yī)療應(yīng)用領(lǐng)域十分重要。藥物蛋白的研究需要高純度的重組蛋白來(lái)進(jìn)行藥物動(dòng)力學(xué)和物理化學(xué)的研究1。重組蛋白在檢測(cè)酶活、連接配體、蛋白相互作用等生物學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。已經(jīng)表達(dá)出多種重組蛋白被證明有很大的應(yīng)用潛力2,3。通過(guò)基因工程改造的方法已經(jīng)獲得了許多性狀優(yōu)良的宿主菌表達(dá)系統(tǒng)，尤其是通過(guò)大腸桿菌可以大量表達(dá)外源基因編碼的重組蛋白4。但是仍然有兩個(gè)問(wèn)題制約著大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)重組蛋白的表達(dá)：一個(gè)是表達(dá)量低，還有一個(gè)就是表達(dá)錯(cuò)誤折疊的蛋白包涵體5。蛋白的表達(dá)和純化工藝一直在發(fā)展進(jìn)步，但是超過(guò)30%的重組蛋白為不具有生物活性的包涵體，嚴(yán)重影響了重組蛋白的生產(chǎn)應(yīng)用6,7。在理想條件下，重組蛋白由強(qiáng)啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生大量的具有生物學(xué)活性的可溶性重組蛋白。但是，強(qiáng)啟動(dòng)子會(huì)導(dǎo)致重組蛋白的過(guò)表達(dá),從而影響宿主菌體的生長(zhǎng)并產(chǎn)生包涵體8。在某些條件下可以通過(guò)變性、復(fù)性的方法使包涵體恢復(fù)活性9，但是復(fù)性后的蛋白是否能夠完全恢復(fù)活性仍然未可知。一般來(lái)講，可以通過(guò)表達(dá)條件的優(yōu)化來(lái)促進(jìn)蛋白的可溶性表達(dá)，比如：誘導(dǎo)溫度、培養(yǎng)基組成、宿主菌的種類。還可以通過(guò)多種方案來(lái)解決蛋白不溶的問(wèn)題：蛋白重新折疊10，構(gòu)建融合蛋白11。另外想要進(jìn)一步增加蛋白可溶性可以與分子伴侶共表達(dá)8或者低溫誘導(dǎo)12。本文對(duì)目前主要的促進(jìn)蛋白可溶表達(dá)的方法進(jìn)行了比較全面的總結(jié)。1.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建1.1選擇表達(dá)宿主菌對(duì)于大規(guī)模的表達(dá)重組蛋白，一般選擇胞內(nèi)表達(dá)或者周質(zhì)空間表達(dá)。與周質(zhì)空間表達(dá)相比，胞內(nèi)表達(dá)的表達(dá)量更高，因此應(yīng)用更為廣泛。在實(shí)驗(yàn)研究和實(shí)際生產(chǎn)中，已經(jīng)有很多大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于。在表達(dá)體系中較為常用的大腸桿菌為B菌株和K12菌株及它們的衍生菌株（表113）。美國(guó)國(guó)立研究院已經(jīng)認(rèn)證了K12菌株的標(biāo)準(zhǔn)性以及安全的使用方案，因此K12菌株在生產(chǎn)應(yīng)用中具有極大的優(yōu)勢(shì)。但是由B菌株演變而來(lái)的BL系列菌株與K12相比，突變了lon 和 ompT兩個(gè)基因14，因此具有許多表達(dá)優(yōu)勢(shì)：產(chǎn)物積累少，缺少蛋白酶，防止產(chǎn)物被降解。這些優(yōu)勢(shì)使得BL菌株也具有非常廣泛的應(yīng)用15,16,17。通常來(lái)講，針對(duì)不同的重組蛋白，宿主菌的選擇也是不同的。如果重組蛋白含有大腸桿菌稀有密碼子，就需要宿主能夠表達(dá)針對(duì)這些密碼子的tRNA，比如BL21 (DE3) CodonPlus-RIL，Rosetta (DE3)等菌株。如果重組蛋白具有許多二硫鍵，則需要宿主表達(dá)環(huán)境為氧化條件的。AD494宿主菌是硫氧還蛋白突變型，可以促進(jìn)二硫鍵的折疊。Origami菌株為硫氧還蛋白突變和谷胱甘肽還原酶突變，進(jìn)一步加強(qiáng)了二硫鍵在細(xì)胞內(nèi)的形成18。另外一方面，如果表達(dá)的重組蛋白對(duì)于宿主菌是有毒性的，則需要表達(dá)為包涵體的形式。表1：常用于重組蛋白表達(dá)的宿主菌及其特點(diǎn)1.2 質(zhì)粒的設(shè)計(jì)理想的基因轉(zhuǎn)錄是質(zhì)粒和啟動(dòng)子功能協(xié)同完成的。廣泛使用的質(zhì)粒都是由復(fù)制子、啟動(dòng)子、標(biāo)記位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、融合蛋白聯(lián)合調(diào)控進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的（圖120。）重組蛋白的表達(dá)量與質(zhì)粒的拷貝數(shù)、結(jié)構(gòu)、分離穩(wěn)定性有關(guān)。如果拷貝數(shù)低形成的mRNA數(shù)量少，蛋白的表達(dá)量就會(huì)降低。高拷貝數(shù)可以提高蛋白的表達(dá)量，但是這也會(huì)給宿主造成代謝上的負(fù)擔(dān)?？截悢?shù)很大程度上由起始子的復(fù)制情況決定的，也體現(xiàn)出質(zhì)粒是嚴(yán)密調(diào)控還是松散調(diào)控。圖1. 質(zhì)粒的基本構(gòu)成高拷貝數(shù)質(zhì)粒在生產(chǎn)應(yīng)用中并不令人滿意。首先，宿主為了保存高拷貝數(shù)質(zhì)粒，不得不在培養(yǎng)基中增加篩選抗生素。但是FDA限制臨床應(yīng)用產(chǎn)品中添加劑的含量。其次，高拷貝數(shù)質(zhì)粒存在分離不穩(wěn)定性，尤其是在低抗生素的條件下23,24。第三，高拷貝數(shù)質(zhì)粒的表達(dá)和維持需要大量能量，不可避免的會(huì)影響宿主菌的生長(zhǎng)和蛋白的合成。另外一個(gè)缺點(diǎn)就是，大量蛋白的過(guò)表達(dá)容易產(chǎn)生包涵體。利于蛋白產(chǎn)品高表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)該是嚴(yán)密調(diào)控并且高轉(zhuǎn)錄效率的。但是如果目的蛋白有毒性，則會(huì)損傷宿主細(xì)菌。另外有些特殊的宿主只能與特定的質(zhì)粒組合才能獲得理想的重組蛋白。表2. 大腸桿菌表達(dá)中經(jīng)常使用的啟動(dòng)子有多種啟動(dòng)子已經(jīng)成功的用于表達(dá)各類重組蛋白(表225,26,27,17),。其中，lac啟動(dòng)子及其衍生物，tac和trc，在研究和工業(yè)化中有著重要的應(yīng)用28,25。tac和trc啟動(dòng)子比lac啟動(dòng)子更強(qiáng)，這三個(gè)啟動(dòng)子都是由IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)的。IPTG可以抑制lac啟動(dòng)子的阻遏，因此重組表達(dá)的水平由培養(yǎng)基中IPTG的濃度進(jìn)行調(diào)控。但是，IPTG價(jià)格比較昂貴，且對(duì)許多菌株有毒性作用。為了解決這些問(wèn)題，通突變篩選的方法獲得了可以通過(guò)溫度的調(diào)節(jié)控制熱敏啟動(dòng)子29。從T7噬菌體中得到的T7啟動(dòng)子也廣泛的應(yīng)用于蛋白重組表達(dá)。T7噬菌體RNA聚合酶可以識(shí)別T7啟動(dòng)子，DNA鏈的延長(zhǎng)速率比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍。宿主菌染色體中含有前噬菌體(DE3)可以編碼T7噬菌體聚合酶，在T7啟動(dòng)子衍生物L(fēng)8-UV5的調(diào)控下可以進(jìn)行表達(dá)。這種新的lac啟動(dòng)子減少了對(duì)于AMP的依賴，也減少了對(duì)于葡萄糖抑制的敏感性。因此T7啟動(dòng)子系統(tǒng)被認(rèn)為比lac啟動(dòng)子系統(tǒng)更為強(qiáng)大。通過(guò)T7啟動(dòng)子系統(tǒng)可以獲得重組目的蛋白占總蛋白含量50%，但是大多以包涵體的形式存在23,30。儲(chǔ)熱調(diào)控啟動(dòng)子系統(tǒng)比如噬菌體pL和pR啟動(dòng)子，也用于生產(chǎn)治療性蛋白。質(zhì)粒中含有熱敏性的cI857阻遏組件，可以通過(guò)溫度的變化控制pL和pR啟動(dòng)子。由于溫控法容易操作，所以適合于大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，同時(shí)也可以減少培養(yǎng)基的污染。但是溫控誘導(dǎo)也有其局限性，由于熱激會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)，對(duì)重組蛋白的表達(dá)也會(huì)造成一定壓力。但是對(duì)于蛋白產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量，這些壓力都是可以忽略的。噬菌體pL和pR啟動(dòng)子也可以在低溫下進(jìn)行調(diào)控，應(yīng)用于表達(dá)可溶蛋白或者熱敏感蛋白31。應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)調(diào)控啟動(dòng)子phoA和trp時(shí)，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分要確保菌體的正常生長(zhǎng)并且能夠利用磷酸鹽進(jìn)行誘導(dǎo)。這種誘導(dǎo)方法與其他的方法相比，誘導(dǎo)時(shí)間范圍非常廣泛32。另外一種嚴(yán)謹(jǐn)型啟動(dòng)子lux，從費(fèi)時(shí)弧菌中分離得到，具有群體感應(yīng)元件，在基因表達(dá)中由luxI進(jìn)行調(diào)控，通過(guò)添加自誘導(dǎo)AHL物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的激活。AHL的濃度通常為IPTG濃度的1/1000，因此這種方法更加經(jīng)濟(jì)利于生產(chǎn)放大33。2融合標(biāo)簽的選擇通過(guò)選擇蛋白表達(dá)環(huán)境的方法不一定能夠使蛋白可溶，因此進(jìn)一步采用融合標(biāo)簽的方法加強(qiáng)可溶蛋白的表達(dá)。在重組蛋白中增加融合標(biāo)簽可以增加蛋白的可溶性，并且使親和純化的過(guò)程更為簡(jiǎn)便34。盡管這些標(biāo)簽最開(kāi)始是用于促進(jìn)目的蛋白的分選及純化，近些年的研究表明，融合標(biāo)簽也可以促進(jìn)蛋白的產(chǎn)量，加強(qiáng)蛋白的溶解性，并且促進(jìn)蛋白的正確折疊35。許多大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒都可以在不同的啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)多種融合標(biāo)簽：多聚組氨酸、麥芽糖連接蛋白(MBP)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST) 36。選擇標(biāo)簽的主要依據(jù)是蛋白本身的特性以及蛋白處理的階段，比如：是否為治療蛋白，層析分離的成本以及過(guò)程可控性的影響37。組氨酸標(biāo)簽時(shí)目前應(yīng)用最為廣泛的融合標(biāo)簽。通過(guò)金屬離子螯合層析的方法可以對(duì)組氨酸標(biāo)簽標(biāo)記的目的蛋白進(jìn)行分離純化。蛋白上的組氨酸標(biāo)簽與固載的金屬離子奧何物相互作用38。另外通過(guò)MBP標(biāo)記的蛋白可以通過(guò)形成交聯(lián)直鏈淀粉進(jìn)行一步純化39,之后用含有10 mM麥芽糖的非變性緩沖液洗脫連接上的蛋白。GST也是一個(gè)親和力標(biāo)簽，通過(guò)固載谷胱甘肽可以對(duì)GST標(biāo)記的可溶蛋白進(jìn)行分離。洗脫緩沖液一般含有還原型谷胱甘肽。GST標(biāo)記的重組蛋白也可以通過(guò)酶催化或者免疫測(cè)定的方法進(jìn)行定量檢測(cè)34。想要系統(tǒng)的分析融合標(biāo)簽對(duì)于可溶蛋白的作用還是比較困難的，蛋白加入不同的融合標(biāo)簽后的反應(yīng)也不相同6,40。標(biāo)簽的選擇十分重要，標(biāo)簽可能會(huì)影響天然蛋白之間的相互作用、翻譯后修飾、是否可溶、重組蛋白的表達(dá)胞內(nèi)定位等多個(gè)方面41,42。一些標(biāo)簽在很多條件下（含有鹽離子、還原劑、表面活性劑）都可以實(shí)現(xiàn)功能，因此在之后的研究中可以彈性的選擇不同的緩沖液組成，與標(biāo)簽的功能相適應(yīng)34。3.提高蛋白轉(zhuǎn)錄效率蛋白在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)錄過(guò)程可以被分為4個(gè)部分:起始、延伸、終止、核糖體循環(huán)。在大多數(shù)情況下，翻譯的起始是蛋白合成決定速率的關(guān)鍵步驟。這個(gè)效率由每條mRNA5末端的翻譯起始區(qū)(TIR)的序列和結(jié)構(gòu)決定43。翻譯起始區(qū)(TIR)由四部分組成：(1)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(SD)序列，(2)起始密碼子，(3)核糖體結(jié)合位點(diǎn)和起始密碼子之間的區(qū)域，(4) 在SD序列上游或是起始密碼子下游的翻譯增強(qiáng)子。調(diào)控TIR序列可以降低或者提高大腸桿菌中重組蛋白的表達(dá)44,45。已經(jīng)證明了六個(gè)核苷酸的SD序列(AGGAGG)比其他更長(zhǎng)或者更短的序列在表達(dá)綠色熒光蛋白(rGFP)方面效率更高46。在這個(gè)研究中，A/U合并的加強(qiáng)子使rGFP的表達(dá)增強(qiáng)了13倍。在對(duì)TIR區(qū)域進(jìn)行修飾的時(shí)候要避免mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)覆蓋SD序列或者起始密碼子。在SD區(qū)域中進(jìn)行單點(diǎn)突變會(huì)使RNA噬菌體MS2外殼蛋白的表達(dá)降低500倍47。將起始密碼子AUG從堿基配對(duì)的mRNA結(jié)構(gòu)中暴露出來(lái)，可以有效提高大腸桿菌中IL-10的表達(dá)量，比野生型的表達(dá)量高10倍48。最近，科學(xué)家研究出了翻譯起始的生物學(xué)模型，可以通過(guò)設(shè)計(jì)核糖體的結(jié)合位點(diǎn)來(lái)改變翻譯起始速率。這個(gè)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)速率控制，并且細(xì)微精確的調(diào)整重組蛋白的表達(dá)43。表達(dá)量的精確程度對(duì)蛋白的分泌十分重要，如果表達(dá)速率太快會(huì)影響細(xì)菌的分泌過(guò)程，導(dǎo)致最終蛋白產(chǎn)量低。但是為了重組蛋白產(chǎn)量的最大化，翻譯水平通常選擇高分泌水平的表達(dá)方案49,44。4.提高mRNA的穩(wěn)定性 mRNA的穩(wěn)定性（半衰期）也會(huì)影響大腸桿菌中的表達(dá)速率。mRNA在大腸桿菌中的降解主要是由于RNA酶的存在，包括內(nèi)切酶(RNase E, K and III和外切酶(RNase II 和多核酸磷酸化酶)。RNA酶和活性和菌體的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)50。對(duì)于高表達(dá)系統(tǒng)而言，提高mRNA的穩(wěn)定性主要有兩個(gè)策略：通過(guò)宿主的基因改造或者改變菌體生長(zhǎng)條件，使mRNA的兩端更具有防護(hù)性，避免被RNA酶水解51。實(shí)驗(yàn)證明，在序列5端非編碼區(qū)中添加ompA基因可以形成一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，有效的延長(zhǎng)外源mRNA的半衰期52。在人類IL-2的cDNA翻譯終止子的位置添加來(lái)源于蘇云金桿菌的penP基因，可以加強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性，提高IL-2在大腸桿菌中的表達(dá)量52。研究表明，在C末端添加的rne基因，可以編碼RNA酶，導(dǎo)致mRNA的降解，因此對(duì)rne基因進(jìn)行突變可以提高mRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)重組蛋白的表達(dá)量53。含有這種突變的菌株已經(jīng)應(yīng)用于商業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域。5.密碼子優(yōu)化除了TIR序列和mRNA的穩(wěn)定性以外，大腸桿菌密碼子的特異性也影響蛋白的翻譯。表達(dá)含有稀有密碼子的外源基因會(huì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)停滯，蛋白表達(dá)過(guò)程中過(guò)早結(jié)束翻譯，基因產(chǎn)生移碼，缺失等現(xiàn)象54。當(dāng)稀有密碼子聚集時(shí)，這種現(xiàn)象更明顯55。解決這個(gè)問(wèn)題的辦法是根據(jù)大腸桿菌偏好性，綜合的優(yōu)化基因序列，已經(jīng)有多種方法可以對(duì)大腸桿菌和其他宿主菌進(jìn)行優(yōu)化56。經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化后的抗體序列在周質(zhì)空間的表達(dá)量為原始基因的100倍57。添加稀有密碼子同源的tRNA也可以彌補(bǔ)密碼子偏好的問(wèn)題。大腸桿菌Rosetta (DE3)菌株具有pRARE質(zhì)粒可以編碼tRNA，識(shí)別只有真核細(xì)胞中才具有的稀有密碼子。通過(guò)這種菌株生產(chǎn)人類重組蛋白時(shí)，68種蛋白中有35種的產(chǎn)量獲得了明顯的提高58。這種菌株可以表達(dá)在BL21 (DE3)中無(wú)法表達(dá)的蛋白。應(yīng)用pRARE質(zhì)粒提高大腸桿菌重組蛋白的表達(dá)量非常實(shí)用，其效果在多個(gè)試驗(yàn)中得到了驗(yàn)證59,60。6.培養(yǎng)基環(huán)境對(duì)可溶表達(dá)的影響在大腸桿菌中想要獲得具有生物學(xué)活性的可溶蛋白需要平衡DNA轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯、蛋白折疊三個(gè)過(guò)程。大腸桿菌中高效表達(dá)可以獲得占總蛋白30%的重組蛋白，如果加入分子伴侶和調(diào)節(jié)因子可以獲得更多。另外，許多蛋白的正確折疊需要二硫鍵的正確形成以及糖基化，而大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)環(huán)境不能滿足這些調(diào)節(jié)。所以許多人類重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)會(huì)出現(xiàn)大量的錯(cuò)誤折疊，形成包涵體。培養(yǎng)條件對(duì)于外源基因的表達(dá)來(lái)說(shuō)非常重要。一般來(lái)講，可以通過(guò)控制合成速率的方法來(lái)避免包涵體的形成。主要的影響因素有：不同時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后陪時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)物濃度。6.1不同時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo)對(duì)表達(dá)的影響通常在菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期早期進(jìn)行誘導(dǎo)，但是也有報(bào)道顯示可以在對(duì)數(shù)期末期61甚至平臺(tái)期62進(jìn)行誘導(dǎo)。因此，誘導(dǎo)前的菌體濃度對(duì)于重組蛋白的表達(dá)來(lái)講是非常重要的影響因素。6.2 誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)后的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)表達(dá)的影響兩個(gè)影響蛋白可溶表達(dá)的重要影響因素是誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)后時(shí)間。通過(guò)降低誘導(dǎo)溫度的方法可以降低蛋白合成的速率，減少包涵體的形成。通過(guò)這種方法已經(jīng)成功表達(dá)了多種難以表達(dá)的蛋白12。高溫可以促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，但是易產(chǎn)生質(zhì)粒丟失，不利于含有外源基因的質(zhì)粒的表達(dá)63。在連續(xù)培養(yǎng)的過(guò)程中這種影響更為明顯?？偟膩?lái)說(shuō)，高溫和溫度依賴性的疏水作用易與導(dǎo)致聚集沉淀64。在菌體中，有一些蛋白適合緩慢、長(zhǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)，那就必然要選擇低溫條件下65。6.3 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)表達(dá)的影響低誘導(dǎo)劑濃度可能會(huì)導(dǎo)致誘導(dǎo)效率降低，重組蛋白產(chǎn)量降低；誘導(dǎo)劑價(jià)格昂貴，如果過(guò)量加入不僅會(huì)增加成本，還會(huì)帶來(lái)毒性抑制菌體的生長(zhǎng)，影響重組蛋白的表達(dá)66。因此，誘導(dǎo)劑濃度應(yīng)該嚴(yán)格控制，略高于臨界濃度。IPTG濃度在0-1 mM之間對(duì)菌體的生長(zhǎng)速率和菌體濃度沒(méi)有明顯影響66。但是，IPTG的濃度需要與宿主菌、載體、重組蛋白相適應(yīng)。7.胞內(nèi)蛋白折疊調(diào)節(jié)因素胞內(nèi)折疊調(diào)節(jié)因子包括：折疊伴侶（DnaK和GroEL），維持伴侶(e.g.,IbpA 和B)，降解伴侶(ClpB)，這些蛋白都在保持蛋白正確折疊構(gòu)象方面有著非常重要的作用。共表達(dá)這些分子伴侶可以增強(qiáng)許多種蛋白的溶解性67。共表達(dá)GroEL/ GroES時(shí)，表達(dá)的B型鈉尿肽抗體中有65%時(shí)可溶的，比非共表達(dá)提高了2.4倍68。但是，通過(guò)共表達(dá)的方法并不一定能夠增強(qiáng)蛋白的可溶性，也可能會(huì)導(dǎo)致菌體代謝的負(fù)擔(dān)，降低蛋白的表達(dá)水平。不同的宿主菌也可以促進(jìn)蛋白的折疊可溶。破壞txrB和 gor基因，可以促進(jìn)蛋白二硫鍵的形成和異構(gòu)化。通過(guò)在胞內(nèi)過(guò)表達(dá)二硫鍵異構(gòu)酶DsbC可以加強(qiáng)二硫鍵的形成69。結(jié)語(yǔ)：大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因工程中最早的表達(dá)系統(tǒng), 但還存在一些問(wèn)題: 一是有些來(lái)自真核生物的蛋白并沒(méi)有得到有效的表達(dá); 二是選擇一個(gè)合適的宿主和載體系統(tǒng)要經(jīng)過(guò)多次嘗試, 費(fèi)時(shí)費(fèi)力; 三是重組蛋白的分泌表達(dá)技術(shù)不如胞內(nèi)表達(dá)技術(shù)研究得透徹。要解決這些問(wèn)題可以通過(guò)以下途徑: (1)通過(guò)基因?qū)雽⑿揎棛C(jī)制引入原核表達(dá)系統(tǒng), 如糖基化、磷酸化、乙?；王０坊? ( 2)構(gòu)建一套適應(yīng)性和功能強(qiáng)大的表達(dá)載體系統(tǒng), 避免大范圍嘗試; (3)深入研究表達(dá)系統(tǒng)的分泌機(jī)制,加強(qiáng)信號(hào)肽功能, 分子伴侶和轉(zhuǎn)運(yùn)通路機(jī)制的研究, 獲得更多的胞外分泌。雖然現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)大量真核表達(dá)系統(tǒng), 但大腸桿菌仍然是基礎(chǔ)研究和商業(yè)生產(chǎn)重組蛋白的強(qiáng)大工具, 隨著各項(xiàng)研究的深入, 重組蛋白的高效表達(dá)技術(shù)將會(huì)越來(lái)越完善。參考文獻(xiàn)1. Casteleijn M G, Urtti A, Sarkhel S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical researchJ. International journal of pharmaceutics, 2013, 440(1): 39-47. 2. Bondos S E, Bicknell A. Detection and prevention of protein aggregation before, during, and after purificationJ. Analytical biochemistry, 2003, 316(2): 223-231.3. Garca M, Monge M, Len G, et al. Effect of preservatives on IgG aggregation, complement-activating effect and hypotensive activity of horse polyvalent antivenom used in snakebite envenomationJ. Biologicals, 2002, 30(2): 143-151.snakebite envenomation, Biologicals 30 (2002) 143151.4. Kane J F, Hartley D L. 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