奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型構(gòu)建技術(shù)規(guī)程-征求意見稿-

ICS65.020.30 B44DB15內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)DB XX/ XXXXXXXXX奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型構(gòu)建技術(shù)規(guī)程Technical Regulations for Establishment of Hydrogen peroxide-induced Oxidative Damage Model of Bovine Mammary Epithelial Cells點(diǎn)擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識（本稿完成日期：）XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布DBXX/ XXXXXXXXX目次前言III1范圍12規(guī)范性引用文件13術(shù)語與定義14主要試劑及配制方法15主要儀器設(shè)備26奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型的構(gòu)建37奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型的判定7前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院提出。本標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)歸口單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SAM/TC19）。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人員：馬燕芬、趙磊、吳志紅、宋利文、乃門塔娜、鳳英、羿靜、寶華、張春華、杜瑞平。8奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型構(gòu)建技術(shù)規(guī)程1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型的構(gòu)建方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于采用過氧化氫誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷模型的構(gòu)建。2 規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-1992 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格為一級水。3 術(shù)語與定義3.1磷酸緩沖鹽溶液 phosphate buffer saline （PBS）起溶解保護(hù)試劑的作用，主要成分為Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl。3.2一抗 primary antibody兔多抗細(xì)胞角蛋白（cytokeratin）18單克隆抗體。將兔多抗細(xì)胞角蛋白18單克隆抗體與PBS按1:200比例配制而成。3.3 二抗 second antibodyAlexa Fluor488標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）。4 主要試劑配制除非另有說明，在細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)使用分析純試劑。4.1 主要試劑DMEM/F12培養(yǎng)基；胎牛血清；雙抗；胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒鈉；氫化可的松；兩性霉素；表皮生長因子；催乳素；L-谷氨酰胺；膠原酶；PBS；75%酒精；新潔爾滅；0.25%胰酶；一抗；二抗；丙酮；甲醇；四氮唑藍(lán)鹽化合物（MTS）；二甲基亞砜（DMSO）。4.2 培養(yǎng)基配制完全培養(yǎng)基（生長培養(yǎng)基）（按配100 mL計(jì)算）將胎牛血清10 mL、雙抗2 mL、5%胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒鈉0.5 mL、100 g/mL氫化可的松100L、100 g/mL兩性霉素B 100 L、10 ng/mL表皮生長因子10 L、50 g/mL催乳素50 L、200 mmol/L L-谷氨酰胺1.5 mL加入85.74 mL的DMEM/F12培養(yǎng)基中，混勻后放置于250 mL的藍(lán)口瓶，4保存。無血清培養(yǎng)基（饑餓培養(yǎng)基）（按配100 mL計(jì)算）將雙抗2 mL、5%胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒鈉0.5 mL、100 g/mL氫化可的松100L、100 g/mL兩性霉素B 100 L、10 ng/mL表皮生長因子10 L、50 g/mL催乳素50 L、200 mmol/L L-谷氨酰胺1.5 mL加入95.74 mL的DMEM/F12培養(yǎng)基中，混勻后放置于250 mL的藍(lán)口瓶，4保存。終止培養(yǎng)基（按配100 mL計(jì)算）90mL DMEM/F12培養(yǎng)基中加入胎牛血清10 mL。4.3 部分試劑配制 100 g/mL氫化可的松將100 g氫化可的松溶于1 mL無水乙醇中，0.22 m濾器過濾分裝，-20保存。100 g/mL兩性霉素B 將1 mg 兩性霉素溶于10 mL無菌超純水中，0.22 m濾器過濾分裝，-20保存。10 ng/mL表皮生長因子10 L將0.2 mg表皮生長因子溶于20 mL DMEM/F12培養(yǎng)基中，充分混勻，配制成10 g/mL的表皮生長因子濃貯，取100 L 10 g/mL濃貯溶于100 mL DMEM/F12培養(yǎng)基中，即為10 ng/mL表皮生長因子工作液，0.22 m濾器過濾分裝，-20保存。50 g/mL催乳素50 L將250 IU的催乳素（按25 IU/mg轉(zhuǎn)換）溶于1 mL DMEM/F12培養(yǎng)基中，配制成濃度為10 mg/mL的貯液，取100 L 10 mg/mL濃貯溶于20 mL DMEM/F12培養(yǎng)基中，即為50 g/mL催乳素工作液，0.22 m濾器過濾分裝，-20保存。200 mmol/L L-谷氨酰胺稱取2.923 g谷氨酰胺溶于100 mL DMEM/F12培養(yǎng)基中，即為200 mmol/L的谷氨酰胺，0.22 m濾器過濾分裝，-20保存。1% PBS在超凈臺內(nèi)，將5 mL雙抗加入500 mL PBS中，充分溶解，4 保存。3% PBS在超凈臺內(nèi)，將15 mL雙抗加入500 mL PBS中，充分溶解，4 保存。0.5%膠原酶稱取100 mg 0.5%膠原酶粉末溶于20 mL PBS中，充分溶解，于超凈臺中用0.22 m濾器過濾滅菌，分裝，-20保存。細(xì)胞凍存液（100 mL）將胎牛血清20 mL和二甲基亞砜（DMSO）10 mL加入到70 mL完全培養(yǎng)基中。3%的過氧化氫甲醇將3 mL 3%過氧化氫加入到97 mL甲醇中配制而成，0.22 m濾器過濾分裝，-20保存。5 主要儀器設(shè)備超凈臺；CO2培養(yǎng)箱；倒置顯微鏡；25 cm2透氣細(xì)胞培養(yǎng)瓶；90 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿；24孔板；瓷盤；鑷子；剪刀；貯液瓶；5 mL青霉素管；15 mL離心管；300 mL燒杯；250 mL藍(lán)口瓶；1.5 mL Eppendof管；凍存管；4 離心機(jī)；4 冰箱；-80 冰箱；80目濾網(wǎng)；10 L-5 mL槍頭；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。6 奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型的構(gòu)建6.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)6.1.1 奶牛乳腺樣品采集選取肉眼觀察切開后的乳腺深層組織內(nèi)無出血點(diǎn)，切面呈肉白色，能見白色乳汁的健康奶牛乳腺組織適量，立即裝入干凈樣品袋中帶回實(shí)驗(yàn)室。6.1.2 奶牛乳腺樣品處理首先在操作臺前點(diǎn)燃酒精燈，取250 mL的貯液瓶，裝入約200 mL含3% PBS溶液，然后將采集的乳腺樣品放入已消毒過的瓷盤里，用鑷子和剪刀剪掉組織外層，于深層處選取1 cm3大小的組織塊若干塊（注意避開導(dǎo)管和結(jié)締組織），放入貯液瓶中浸泡10 min。6.1.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)準(zhǔn)備好需要拿到培養(yǎng)間的物品：雙抗，1% PBS溶液，3% PBS溶液，DMEM/F12培養(yǎng)基，0.5%膠原酶，5 mL青霉素管，15 mL離心管，90 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，25 cm2透氣的細(xì)胞培養(yǎng)瓶。穿上經(jīng)紫外照射消毒后的試驗(yàn)專用服進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)間。將紫外照射燈關(guān)閉，打開超凈臺并點(diǎn)燃酒精燈，用酒精棉將超凈臺擦拭干凈。準(zhǔn)備7只300 mL燒杯，放入超凈臺中并依次排開，前三只燒杯裝入150 mL 3% PBS，后三只燒杯裝入150 mL 1% PBS，中間一只燒杯裝入150 mL 75%酒精。最后將裝有乳腺組織塊的250 mL藍(lán)口瓶消毒后放入超凈臺中。從藍(lán)口瓶里取出乳腺組織塊放入第一只燒杯中，用鑷子輕輕攪拌清洗30 s，轉(zhuǎn)移到第二個燒杯，以此類推，將乳腺組織塊從最后一只燒杯中取出放入高壓后的90 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將全部移出燒杯的乳腺組織塊在無菌培養(yǎng)皿中用眼科鑷子和剪刀剪去組織塊表層，剪取深層腺泡約1mm3的乳腺組織放入青霉素小瓶內(nèi)。用眼科剪刀在青霉素小瓶中將乳腺組織塊剪成糊狀。將呈糊狀的乳腺組織塊吸至15 mL離心管中，加入1% PBS適量清洗青霉素小瓶3次轉(zhuǎn)入離心管中，1300 r/min離心5 min。棄上清，向離心管中加入等體積的0.5%膠原酶。蓋好離心管蓋子，放入培養(yǎng)箱中消化1 h，消化過程中每隔20 min拿出輕輕搖晃離心管。消化完畢后，將消化后的組織塊用80目濾網(wǎng)過濾（濾網(wǎng)應(yīng)先用1% PBS潤濕）到滅菌燒杯里，用1% PBS將離心管潤洗3遍后，經(jīng)濾網(wǎng)過濾到燒杯里。將濾網(wǎng)棄掉，用5 mL槍頭吸取濾液于15 mL離心管（根據(jù)濾液的多少來決定個數(shù)）內(nèi)，然后用1% PBS將燒杯潤洗3遍，1300 r/min離心5 min。棄掉上清液，分別向15 mL離心管中加入1% PBS 3 mL清洗，輕輕吹打后，1300 r/min離心3 min。再次棄掉上清液，向其分別加入5 mL完全培養(yǎng)基，輕輕混勻，分別將5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液全部吸出輕輕放置于25 cm2透氣的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入37 5% CO2培養(yǎng)箱中，關(guān)上CO2恒溫培養(yǎng)箱門。收拾超凈臺、培養(yǎng)間，噴灑新潔爾滅。6.1.4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞傳代及純化從CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)取出培養(yǎng)瓶，在超凈臺里傾倒出舊培養(yǎng)基。加入1% PBS潤洗培養(yǎng)瓶2次，倒出。加入0.25%胰酶1 mL（注意讓槍頭從培養(yǎng)瓶側(cè)面加入，不要對著細(xì)胞加），計(jì)時(shí)30 s，倒出，加入1% PBS潤洗2次。加入0.25%胰酶1 mL，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 min。取出培養(yǎng)瓶，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞脫壁情況。乳腺上皮細(xì)胞消化完全后，迅速向瓶內(nèi)加入3 mL終止培養(yǎng)基終止消化，防止深度消化損傷細(xì)胞，用1 mL槍頭將細(xì)胞培養(yǎng)瓶底壁的細(xì)胞吹打下來。吸取細(xì)胞懸液于15 mL離心管中，4 離心機(jī)1300 r/min離心3 min。棄掉上清液，向15 mL離心管中加入3 mL PBS清洗，輕輕吹打后，4 離心機(jī)1300 r/min離心3 min。再次棄掉上清液，向其加入5 mL完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞沉淀吹散開后全部吸出輕輕放置于25 cm2透氣細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，以1.0105的密度接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。6.1.5 細(xì)胞活力測定染色：將復(fù)蘇的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用10 L移液槍分別吸取10 L細(xì)胞懸液和10 L 0.4%的臺盼藍(lán)，并將其混勻。計(jì)數(shù)：混勻后靜置30 s，吸取20 L混合液于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，使混合液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間，在熒光倒置顯微鏡下100計(jì)數(shù)，透明發(fā)亮的小圓圈為健康活細(xì)胞，無色；被臺盼藍(lán)染成藍(lán)色的細(xì)胞則表示已經(jīng)死亡。存活率：計(jì)數(shù)1000個細(xì)胞中被臺盼藍(lán)染成藍(lán)色的細(xì)胞個數(shù)，細(xì)胞存活率=存活細(xì)胞個數(shù)/細(xì)胞總數(shù)量100%，由此反應(yīng)出細(xì)胞的活力。6.1.6細(xì)胞生長曲線的繪制6.1.6.1 制備細(xì)胞懸液將生長良好的第三代細(xì)胞消化下來，計(jì)數(shù)后分別制成0.5104個/mL、1.0104個/mL、2.0104個/mL的細(xì)胞懸液25 mL，備用。6.1.6.2 接板吸取0.5104個/mL、1.0104個/mL、2.0104個/mL的細(xì)胞懸液于不同的24孔板內(nèi)，每個濃度24個孔，每孔1 mL，放入CO2恒溫培養(yǎng)箱中。6.1.6.3 計(jì)數(shù)細(xì)胞在CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用0.25%胰酶消化24孔板中0.5104個/mL、1104個/mL、2104個/mL的3孔細(xì)胞，分別制成1 mL細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。以后每隔24 h計(jì)數(shù)一次，連續(xù)8天，未計(jì)數(shù)細(xì)胞組每2天換一次液。6.1.6.4 繪圖以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，乳腺上皮細(xì)胞濃度為縱坐標(biāo)，制作折線圖。6.1.7 細(xì)胞免疫熒光測定純化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞以2104個/mL接種到24孔板中，待長至半?yún)R合單層狀態(tài)時(shí)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。用預(yù)冷的1% PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，2 min/次，用冰浴的丙酮：甲醇（1:1）固定細(xì)胞20 min。用1% PBS緩沖液沖洗細(xì)胞3次，5 min/次，滴加1 mL 3%的過氧化氫甲醇溶液室溫靜置10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶。再用1% PBS緩沖液沖洗細(xì)胞3次，5 min/次，滴加1 mL 10%胎牛血清室溫靜置1.5 h。輕輕甩掉血清，滴加1 mL一抗兔多抗cytokeratin 18單克隆抗體（1：200），放于37的5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2h。用1% PBS緩沖液清洗3次，5 min/次，在避光的條件下，滴加1 mL二抗Alexa Fluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG，放于37的5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。再用PBS緩沖液沖洗3次，5 min/次，熒光倒置顯微鏡下，觀察拍照。6.2 H2O2配制6.2.1 H2O2原液配制30% H2O2濃度約為9 mol/L。1 mol/L H2O2原液配制在1 mL H2O2中加入8 mL高壓滅菌超純水稀釋到9 mL，配制成濃度為1 mol/L（1000mmol/L）的H2O2原液。6.2.2 600 mol/L H2O2工作液配制在0.006 mL 1000 mmol/L 的H2O2原液中加入9.994 mL的高壓滅菌超純水稀釋到10 mL，即為600 mol/L H2O2工作液，每次換液時(shí)現(xiàn)配。6.2.3 600 mol/L H2O2誘導(dǎo)培養(yǎng)基配制（按20 mL計(jì)）將12 L的1000 mmol/L的H2O2原液加入到19.98 mL的無血清培養(yǎng)基中，即為600 mol/L H2O2誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每次換液時(shí)現(xiàn)配。6.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型的構(gòu)建6.3.1奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)將傳第三代奶牛乳腺上皮細(xì)胞使用完全培養(yǎng)基懸浮，并以2105個/mL或2104個/mL的密度分別接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或6孔板中，置于37，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁達(dá)80%90%時(shí)，繼續(xù)于無血清培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)12-16 h。6.3.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型構(gòu)建25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或6孔板中的乳腺上皮細(xì)胞在饑餓培養(yǎng)12-16 h后，PBS清洗2次，分別加入5 mL/瓶或2.5 mL/孔的600 mol/L濃度的H2O2誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。7 奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型的判定7.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)觀察在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷數(shù)量達(dá)20%-40%，氧化損傷乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)不規(guī)則橢圓形態(tài)。7.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖率測定（MTS法）7.2.1 制備細(xì)胞懸液將復(fù)蘇后的乳腺上皮細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，使其濃度為2104個/mL。7.2.2接板向離心管中加入完全培養(yǎng)基，充分混勻，接到96孔板中，每組5個復(fù)孔，每孔200 L。標(biāo)記好于37 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。7.2.3 饑餓處理培養(yǎng)12 h后，每孔內(nèi)的完全培養(yǎng)基換成200 L的饑餓培養(yǎng)基，于37 5% CO2培養(yǎng)箱饑餓培養(yǎng)16-24 h。7.2.4 換液培養(yǎng)16h后，每孔內(nèi)的饑餓培養(yǎng)基換成100 L的H2O2誘導(dǎo)培養(yǎng)基，于375% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。7.2.5 加MTS培養(yǎng)6 h后，在每孔內(nèi)加20 L MTS，在37，5% CO2的環(huán)境下孵育1-4 h。7.2.6 測吸光度值將96孔板放入酶標(biāo)儀中中速搖動10 min，490 nm讀取吸光度（OD）值，OD值范圍為0.20-0.25。7.2.7奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖率奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖率小于80%。7.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化-抗氧化指標(biāo)測定7.3.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化-抗氧化指標(biāo)測定方法600 mol/L的H2O2作用于乳腺細(xì)胞6 h后，棄上清，抽取1 mL PBS清洗每孔內(nèi)貼壁生長的乳腺上皮細(xì)胞2次，棄去液體，每孔加入200 L的細(xì)胞裂解液，冰浴30 min，將貼壁細(xì)胞用細(xì)胞刮刀全部刮下，分別將細(xì)胞懸液收集于1.5 mL Eppendof管中，4，12000 r/min離心10 min，收集上清液測定氧化和抗氧化指標(biāo)。7.3.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化-抗氧化指標(biāo)判定范圍氧化指標(biāo)：ROS含量大于3500 pg/mL，MDA含量大于75 mmol/L?？寡趸笜?biāo)：SOD活性小于150 U/mL，GSH-PX活性小于600 U/L，CAT活性小于90 U/L，GST活性大于1000 mIU/L，LDH活性大于23 IU/L。_