熒光定量PCR技術(shù)講座理論基礎(chǔ)引物及探針設(shè)計(jì)體系優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案數(shù)據(jù)分析污染防控ppt課件

熒光定量PCR技術(shù)講座,-分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)系列講座,1,大綱,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論 二、引物及Taqman探針的設(shè)計(jì) 三、內(nèi)參基因的選擇 四、反應(yīng)體系的優(yōu)化 五、實(shí)驗(yàn)方案的選擇 六、誤差分析及操作規(guī)范 七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控 八、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析,2,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,1、熒光定量PCR技術(shù)概論 熒光定量PCR技術(shù)產(chǎn)生并成熟于上世紀(jì)90年代，由于該技 術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，能夠?qū)CR反應(yīng)的全過程進(jìn) 行實(shí)時(shí)監(jiān)控，并且自動(dòng)化程度高，所以該技術(shù)從產(chǎn)生到現(xiàn)在短 短的十幾年時(shí)間，在科研及檢驗(yàn)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用，成為 分子生物學(xué)領(lǐng)域不可或缺的一項(xiàng)重要技術(shù)。,3,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,1、熒光定量PCR技術(shù)概論 熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用 熒光信號(hào)隨著PCR反應(yīng)的積累來實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)的進(jìn)程，并通 過分析軟件對(duì)PCR的反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)分析的技術(shù)。 系統(tǒng)組成：定量PCR儀、電腦、分析軟件、試劑及耗材。,4,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,2、熒光定量PCR常用的三個(gè)概念 擴(kuò)增曲線、閾值、CT值 （1）、擴(kuò)增曲線及擴(kuò)增曲線的兩種形式,左圖反映的是隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行相應(yīng)的熒光信號(hào)的變化，比較直觀，但是指數(shù)期很短；右圖反映的是熒光信號(hào)的變化量的對(duì)數(shù)與PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系，從右圖可知，指數(shù)期很明顯，在確定閾值線時(shí)具有簡(jiǎn)單明了的特點(diǎn)，所以很多軟件都采用右圖的形式，當(dāng)然了，這兩種實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要相互轉(zhuǎn)換。,5,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,2、熒光定量PCR常用的三個(gè)概念 （2）、閾值線 在熒光定量PCR擴(kuò)增的指數(shù)期，畫一條線，在此直線上， 所有樣品的熒光強(qiáng)度與其本底熒光強(qiáng)度的差值全部相同。,6,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,2、熒光定量PCR常用的三個(gè)概念 （3）、CT值 PCR過程中，各樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，所經(jīng)過的 擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。,7,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,3、熒光定量PCR的化學(xué)基礎(chǔ) 熒光定量PCR是隨著PCR循環(huán)的進(jìn)行，以熒光信號(hào)強(qiáng)度的積 累來實(shí)時(shí)反映PCR反應(yīng)進(jìn)程的。理想的熒光物質(zhì)需具備以下特 點(diǎn)： （1）、本底低 （2）、熒光強(qiáng)度高 （3）、每輪PCR反應(yīng)完成后都有熒光強(qiáng)度的增高，而且這種熒 光強(qiáng)度的增高和每輪循環(huán)后PCR產(chǎn)物的量成線性關(guān)系 （4）、沒有PCR產(chǎn)物時(shí)，沒有熒光 （5）、該熒光物質(zhì)的受激發(fā)后其發(fā)射光的波長(zhǎng)范圍窄，各種 熒光不會(huì)產(chǎn)生熒光的交叉干擾,8,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,3、熒光定量PCR的化學(xué)基礎(chǔ) 目前常用的幾種熒光物質(zhì) （1）、Taqman探針類,5端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，探針完整時(shí)，沒有熒光，探針斷裂后，在激發(fā)光的作用下，熒光基團(tuán)產(chǎn)生熒光； 探針本身序列與目的基因序列互補(bǔ)，特異性高，退火后探針與目的基因互補(bǔ)序列結(jié)合，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，在Taq酶5-3外切酶的作用下，探針?biāo)鈹嗔?，熒光產(chǎn)生。,9,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,3、熒光定量PCR的化學(xué)基礎(chǔ) Taqman常用的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán) 熒光基團(tuán)：5端常用熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記，最佳激發(fā)光波長(zhǎng)：494-495nm，最大 發(fā)射光波長(zhǎng)：518-520nm。 淬滅基團(tuán)：TAMRA、BHQ、ECLIPSE等。 TAMRA本身也是一種熒光基團(tuán)，激發(fā)光波長(zhǎng)范圍較寬，500 560nm，最佳激發(fā)光波長(zhǎng)在560nm附近，對(duì)FAM基團(tuán)產(chǎn)生的發(fā)射光 具有較好的吸收作用；其發(fā)射光波長(zhǎng)較寬，560650nm，當(dāng)做 多重?zé)晒鈺r(shí)，容易產(chǎn)生熒光交叉干擾，并且本底較高，故現(xiàn)已 不常用。 BHQ和ECLIPSE為非熒光物質(zhì)，只是一種熒光淬滅劑，本身不會(huì) 產(chǎn)生熒光，光吸收范圍較寬，因此本底較低，作為淬滅基團(tuán)較 為常用，尤其在多重?zé)晒舛縋CR時(shí)常常被采用。,10,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,3、熒光定量PCR的化學(xué)基礎(chǔ) Taqman探針的特點(diǎn)及應(yīng)用 （1）、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高 本身具有序列特異性，保證了所檢測(cè)目的基因的特異 性；其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)保證了其所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物 的量成正比關(guān)系，因此準(zhǔn)確性極高。 （2）、對(duì)引物及試劑要求不高，配套的普通引物就可以使 用，普通的Taq酶就能滿足實(shí)驗(yàn)的要求。 （3）、常被用作基因含量的精確檢測(cè)(精確度可達(dá)幾十個(gè)拷貝) 及基因表達(dá)變化的精確分析（精確度可達(dá)0.1倍的變 化）。 （4）、目前價(jià)格也不是太貴，2OD 1000.00左右,11,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,3、熒光定量PCR的化學(xué)基礎(chǔ) （2）、熒光染料類 目前常用的熒光染料為SYBR Green、SYBR Green、 SYTO9、HRM等。其共同性質(zhì)為： （a）、結(jié)合于雙鏈核酸的小溝處 （b）、與雙鏈DNA結(jié)合后受激產(chǎn)生熒光 （c）、在變性條件下雙鏈分開，熒光消失,12,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,3、熒光定量PCR的化學(xué)基礎(chǔ) 熒光染料的特點(diǎn)及應(yīng)用 （1）、能夠與所有的核酸雙鏈結(jié)合，受激后產(chǎn)生熒光，其熒光的強(qiáng)度與 雙鏈核酸的含量及長(zhǎng)度成正比，因此本底較高； （2）、可做雙鏈核酸的熔解曲線分析； （3）、SYBR Green染料本身價(jià)格便宜，但是做熒光定量PCR時(shí)對(duì)引物設(shè) 計(jì)的要求很高；對(duì)Taq酶要求較高，最好是HotStar Taq酶，或者操 作時(shí)需要嚴(yán)格的冷啟動(dòng)，冰上操作，否則引物二聚體及非特異性擴(kuò) 增會(huì)嚴(yán)重干擾結(jié)果的準(zhǔn)確性，尤其是模板含量較低時(shí)； （4）、適合于基因含量及基因表達(dá)變化的粗略分析或初篩； （5）、在分析的基因種類很多，但是樣品量很少時(shí)，尤其適用。 （6）、對(duì)PCR反應(yīng)的毒性，能抑制PCR反應(yīng)，降低PCR反應(yīng)的效率。,13,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,4、熒光定量PCR的數(shù)學(xué)原理 對(duì)于普通的PCR反應(yīng)來說 n,Xn=X0（1E）,上式中， Xn為n輪PCR循環(huán)后，目的基因PCR產(chǎn)物的量；n為PCR循環(huán)數(shù)；X0 為目的基因的初始模板量，E為PCR的反應(yīng)效率，0E1。,14,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,4、熒光定量PCR的數(shù)學(xué)原理 由于PCR反應(yīng)體系中熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的量成正比，所以 用熒光強(qiáng)度來代替PCR產(chǎn)物的量，我們可以得到： Rn= RB+ X0(1+ E) Rs,n,總熒光信號(hào)強(qiáng)度=本底信號(hào)+分子數(shù)量×單位信號(hào)強(qiáng)度,Rn：第n個(gè)循環(huán)時(shí)的總信號(hào) RB：本底 RS：?jiǎn)挝恍盘?hào)強(qiáng)度 X0：起始DNA數(shù)目 E： PCR效率,15,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,4、熒光定量PCR的數(shù)學(xué)原理 當(dāng)循環(huán)數(shù)n等于CT值時(shí)，所有樣品熒光信號(hào)強(qiáng)度變化量的 對(duì)數(shù)全部一致，都達(dá)到了閾值。 RT= RB+ X0(1+ E) Rs lg(RT -RB) = lgX0 + CT lg(1+ E) + lg Rs CT lg(1+ E) = -lgX0 + lg(RT -RB) lg Rs 此時(shí)，PCR反應(yīng)處于指數(shù)期階段，所有樣品的反應(yīng)效率E穩(wěn)定且近似相 等； lg(RT -RB)、Rs也都相同，只有CT值和-lgX0為變量，且這兩個(gè)變 量之間成一次性方程。 也就是說， 所有樣品的lgX0與到達(dá)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)n（Ct值）呈線性 關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模 板量,CT,16,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,5、熒光定量PCR線性關(guān)系成立的條件分析 CT lg(1+ E) = -lgX0 + lg(RT -RB) lg Rs （1）、PCR效率相等，在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期，E穩(wěn)定且為常數(shù)； （2）、RT RB 要相等；也就是說到達(dá)閾值時(shí)樣品的熒光強(qiáng)度與樣品的熒 光本底之差要相等； （3）、樣品的單位信號(hào)強(qiáng)度Rs要相等，用熒光染料做熒光基團(tuán)時(shí)，Rs 就 是每條PCR產(chǎn)物結(jié)合熒光染料后所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，此熒光強(qiáng)度和 PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)短有關(guān)，PCR產(chǎn)物越長(zhǎng)，結(jié)合的熒光染料越多， Rs 值 越大；用探針做熒光基團(tuán)時(shí)，Rs 就等于PCR反應(yīng)時(shí)，Taq酶水解掉 探針，探針的發(fā)光基團(tuán)所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，和PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度沒有 直接關(guān)系。,17,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,5、熒光定量PCR線性關(guān)系成立的條件分析,左圖橫坐標(biāo)是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強(qiáng)度Rn，改圖反映的是各個(gè)樣品隨著每輪PCR反應(yīng)，其總的熒光量的實(shí)時(shí)變化；右圖橫坐標(biāo)也是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強(qiáng)度與熒光本底的差值RT RB即Rn的對(duì)數(shù)，在右圖中確定閾值線，該直線上所有樣品的RT RB的對(duì)數(shù)都相同，熒光定量PCR的線性關(guān)系才會(huì)成立。,18,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,5、熒光定量PCR線性關(guān)系成立的條件分析,LogX0與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知樣品Ct值，就可以在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出未知樣品初始模板量。,19,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,6、雙鏈核酸的熔解曲線分析 使用熒光染料作為熒光基團(tuán)時(shí)，由于熒光染料的特性隨著PCR反應(yīng)的進(jìn) 行，雙鏈PCR產(chǎn)物呈指數(shù)增長(zhǎng)，SYBR Green與雙鏈PCR產(chǎn)物結(jié)合后熒光越 來越強(qiáng)，當(dāng)PCR反應(yīng)結(jié)束時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，此時(shí)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行緩慢 加熱，從50一直加熱到99，在此過程中PCR產(chǎn)物按照TM值的大小雙鏈被 依次打開，熒光強(qiáng)度也隨著雙鏈的打開依次減弱，如下圖：,20,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,6、雙鏈核酸的熔解曲線分析 對(duì)于核酸序列相同的PCR產(chǎn)物，其TM值也相同，而且其TM值在一個(gè)很小 的溫度范圍內(nèi)，在此溫度區(qū)間，其序列相同的核酸雙鏈全部打開，熒光強(qiáng) 度急劇降低，以熒光強(qiáng)度的變化率和溫度來作圖，則可得到如下圖：,21,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,6、雙鏈核酸的熔解曲線分析 上圖就是熔解曲線，熔解曲線反映的是一定序列長(zhǎng)度的核 酸雙鏈，在一定的離子強(qiáng)度下的TM值。核酸雙鏈的TM值由雙鏈 核苷酸之間相連接的氫鍵決定，不同的核酸雙鏈，其TM值也不 同，所以通過熔解曲線，我們能獲知雙鏈核酸的均一性、野生 型和突變型雙鏈之間的堿基差異等，如果采用高分辨率熒光染 料，鏈條核酸雙鏈哪怕只有一個(gè)堿基的差異，通過熔解曲線也 能分析出來。 電泳是通過核酸分子量的大小和構(gòu)象來分析的，熔解曲線 是根據(jù)雙鏈核酸的TM值來分析的，這與瓊脂糖電泳及SSCP有異 曲同工之處。,22,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,7、絕對(duì)定量和相對(duì)定量,23,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,7、mRNA差異表達(dá)的相對(duì)定量分析 研究基因表達(dá)的情況，我們只需搞清楚該基因在不同生理階段的變化 趨勢(shì)如何就行了，而無需知道該基因的絕對(duì)量有多少。 實(shí)驗(yàn)操作中，由于樣品選取時(shí)樣品的細(xì)胞個(gè)數(shù)不可能完全相同，RNA提取 時(shí)得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初 始樣品濃度不同，這就造成了比較上的混亂，因此在進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研 究中都會(huì)用一些看內(nèi)參基因來標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成 的差異。常用的內(nèi)參基因是在各種生理?xiàng)l件下表達(dá)量恒定的基因，這些基 因也常被稱為看家基因，該基因表達(dá)一般不隨外界的變化而變化，所以常 被用作內(nèi)參照，常用的內(nèi)參基因有GAPDH基因、-Actin基因，18srRNA基 因等。,24,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,7、mRNA差異表達(dá)的相對(duì)定量分析,以上公式就是引入內(nèi)參基因后相對(duì)定量分析的基本公式，并由此派生出兩種相對(duì)定量的分析方法：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法和Delta-delta Ct法。,25,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,7、mRNA差異表達(dá)的相對(duì)定量分析 （1）、雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法 所謂的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法就是對(duì)每個(gè)樣品的內(nèi)參基因和目的基因都做絕對(duì)定量，求出每個(gè)樣品中內(nèi)參基因和目的基因的絕對(duì)數(shù)量，然后根據(jù)相對(duì)定量的基本公式來求出目的基因的差異表達(dá)。 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法的特點(diǎn)： （a）、考慮到了不同基因擴(kuò)增效率的差異，用標(biāo)準(zhǔn)曲線來校正擴(kuò)增效 率，最大限度的避免了誤差； （b）、思路直觀、條理清晰、應(yīng)用簡(jiǎn)便，操作靈活，無需像Delta- delta CT法那樣對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行反復(fù)的優(yōu)化； （c）、其不足之處是每次實(shí)驗(yàn)都必需對(duì)目的基因和看家基因做標(biāo)準(zhǔn)曲 線； （d）、該方法適合樣品量大，但是所分析目的基因較少的實(shí)驗(yàn)。,26,一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論,7、mRNA差異表達(dá)的相對(duì)定量分析 （2）、2 -CT法,該方法的前提條件是目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相同且都為1，在試驗(yàn)開始前必須分別對(duì)目的基因和內(nèi)參基因作標(biāo)準(zhǔn)曲線，看兩者擴(kuò)增效率的差別，假如兩者擴(kuò)增效率之間的差異小于0.1，就可以用該方法分析。而且在接下來的實(shí)驗(yàn)中，無需再做標(biāo)準(zhǔn)品。 該方法要求嚴(yán)格的重復(fù)，因?yàn)镃T值的差異只要有很小的變化，測(cè)得的結(jié)果就會(huì)有很大的差別。 該方法特別適合于樣品量不大，但是檢測(cè)的基因種類很多的情況。,27,二、引物及Taqman探針的設(shè)計(jì),1、染料法引物的設(shè)計(jì)原則： （1）、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異； （2）、避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)，避免引物 自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)； （3）、檢測(cè)mRNA時(shí)，為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯 子； （4）、引物之間的TM相差避免超過2； （5）、典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng)； （6）、目的基因和內(nèi)參基因所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度盡量一致，不大于 300bp，這樣有利于使兩種基因PCR效率相同 （7）、將設(shè)計(jì)好的引物用序列分析軟件分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)并做BLAST分析其 特異性,28,二、引物及Taqman探針的設(shè)計(jì),2、Taqman探針及引物的設(shè)計(jì)原則： 在Taqman探針法中，Taq酶除了5-3聚合酶作用之外，還要5-3外切酶 的活性來切斷探針鏈產(chǎn)生熒光，普通PCR的延伸溫度為72，此溫度為Taq 酶聚合作用的最佳溫度；Taqman探針法反應(yīng)中，在要求Taq酶5-3聚合酶活 性的同時(shí)，還需要Taq酶5-3外切酶的活性來切斷探針鏈產(chǎn)生熒光，Taq酶 5-3外切酶活性的最佳溫度為60，所以Taqman PCR反應(yīng)的一般采用兩步 法，即95變性，60復(fù)性延伸。 在Taqman探針及引物的設(shè)計(jì)過程中，引物的TM值已經(jīng)確定為60左 右，在每輪PCR循環(huán)的復(fù)性過程中（9560），為了確保探針先于引物與 模板結(jié)合，這就要求探針的TM值高于引物10左右，所以Taqman探針及引 物一般都是引物TM值為60左右，探針的TM值為70左右。,29,二、引物及Taqman探針的設(shè)計(jì),2、Taqman探針及引物的設(shè)計(jì)原則： （1）、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異； （2）、檢測(cè)mRNA時(shí)，為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯 子； （3）、引物TM值為60左右，探針的TM值為70左右； （4）、探針的5端應(yīng)避免使用鳥嘌呤G，因?yàn)?G會(huì)有淬滅作用，而且即使 是被切割下來還會(huì)存在淬滅作用； （5）、整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量 G含量高會(huì)降低反應(yīng) 效率，這時(shí)就應(yīng)選擇配對(duì)的另一條鏈作為探針； （6）、引物之間的TM相差避免超過2； （7）、典型的引物長(zhǎng)度為18-24bp，探針長(zhǎng)度為15-45bp； （8）、PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度在50-150bp之間，這樣有利于使PCR效率相同； （9）、將設(shè)計(jì)好的引物用序列分析軟件分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)并做BLAST分析其 特異性,30,二、引物及Taqman探針的設(shè)計(jì),2、Taqman探針及引物的設(shè)計(jì)原則：,探針中GC含量的差異對(duì)定量PCR反應(yīng)效率的影響,31,二、引物及Taqman探針的設(shè)計(jì),3、Taqman探針及引物的設(shè)計(jì)舉例 1 ATGAACTACG TTGGACAGTT AGCAGGGCAA GTGTTTGTAA CTGTGAAGGA GCTCTATAAG 61 GGACTAAACC CAGCCACGCT GTCGGGATGT ATCGATATAA TTGTTGTACG TCAGCCAGAT 121 GGGAATCTTC AGTGTTCTCC ATTCCATGTA CGCTTTGGGA AAATGGGAGT TCTGCGTTCC 181 AGGGAGAAAG TGGTTGACAT AGAAATTAAT GGAGAGGCTG TAGATTTGCA CATGAAGCTA 241 GGAGACAATG GAGAAGCCTT TTTCGTCCAG GAGATGGATA ACAATCAGGA GGTAATTCCT 301 TATCATCTGT CTACGTCCCC CATCCTGTCT GAGGGAACTG CGTTAATGGA AGCTCAGCTG 361 AAGAGAAACT CAATTGACAG GATAAGAAAC CTGGACAGCA GTGTATCTTC ACAAGTACCA 421 CCCCAAGCTC ATGGATCCCA GCCTGGTACT GAAACATCTC CAGCCTGTAG CTCTGTGAAA 481 AAGAGGAGGA AAAAGAGGAG GAAGTCTACC CACAAAATAG ACAGCTTAAA AAGAGAAGAC 541 ATTGGAGATA CATCAGAAGA TGAAGACATG TTTCCTATAG AGATTAGCTC AGAGGAAGAA 601 AAGGAACAAT TGGACAATTC AAGGATTCTT GTTCCAGATG TGTTTGTTGA TGAAGTATCT 661 GATATAAAGG CTCCTGCTGT TTCTGCTTAT TCTCAGTCTT CATCTTACCC TCGTTCGGAT 721 GGAGAATGGT CACCCATTCA AAGTAAGCCC ATAGATTACA CAGGGCAATC CTCTCTTCTC,經(jīng)Oligo軟件驗(yàn)證，探針TM值70左右，上下游引物的TM值都為60 左右，二級(jí)結(jié)構(gòu) 分析，引物和探針比較理想，再經(jīng)BLAST分析，引物和探針特異性較好。,32,二、引物及Taqman探針的設(shè)計(jì),4、Taqman探針及引物合成時(shí)注意事項(xiàng) （1）、引物及探針設(shè)計(jì)好之后，委托一家放心的合成公司合成； （2）、先不要急于合成探針，先引物合成，引物合成好以后，做普通 PCR，電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，看是否和設(shè)計(jì)的長(zhǎng)度吻合，再看看非特異 性擴(kuò)增情況，必要時(shí)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的測(cè)序驗(yàn)證； （3）、確定引物沒有問題后，再將探針?biāo)徒缓铣?，這樣安排能避免很多以 外的損失； （4）、探針合成好后，先檢測(cè)一下探針的質(zhì)量，250nm的探針終濃度， 25ul水，反應(yīng)體系中只有水和探針，在熒光定量PCR儀上檢測(cè)， 95，2min; 95，20s，60，20s，40個(gè)cycles；看熒光本底和 熒光強(qiáng)度的變化情況，好的探針熒光本底較低，隨著PCR反應(yīng)，熒 光強(qiáng)度不會(huì)變化，假如熒光強(qiáng)度變化的比較大，說明探針合成質(zhì)量 較差，建議重新合成。,33,三、內(nèi)參基因的選擇,1、理想的內(nèi)參基因具有的特點(diǎn) （1）、不存在假基因； （2）、高度或中度表達(dá)，排除太高或低表達(dá) （3）、穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織(如正常細(xì)胞和癌細(xì)胞)，而且其 表達(dá)量是近似的，無顯著性差別； （4）、表達(dá)水平與細(xì)胞周期以及細(xì)胞是否活化無關(guān)； （5）、其穩(wěn)定的表達(dá)水平與目標(biāo)基因相似； （6）、不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，如不受任何實(shí)驗(yàn)處理措施的 影響。 理想的內(nèi)參基因很少或者說不存在，因?yàn)樗谢蛟诓煌募?xì)胞或組 織中、在細(xì)胞的不同生理時(shí)期、在不同的理化等外界刺激下，其表達(dá)量都 會(huì)有所差異，有時(shí)可以是幾倍、幾十倍甚至是上百倍的差異。盲目地使用 一種看家基因作為內(nèi)參，一方面可能使基因表達(dá)的微小差異難以發(fā)現(xiàn)，另 一方面可能引致錯(cuò)誤甚至相反的結(jié)論。,34,三、內(nèi)參基因的選擇,2、常用內(nèi)參基因的表達(dá)情況 （1）、GAPDH GAPDH mRNA在不同癌組織(包括肺癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌等)中的表達(dá) 升高，在不同個(gè)體間、懷孕期間以及細(xì)胞周期的不同階段等變化很大，在 正常的結(jié)腸上皮、人類前列腺癌的細(xì)胞周期不同階段也呈現(xiàn)出顯著性變 化。在各種因素(例如低氧、胰島素、地塞米松、絲裂原、表皮生長(zhǎng)因子等) 刺激下，培養(yǎng)細(xì)胞GAPDH mRNA的表達(dá)水平也不同。 （2）、-actin 當(dāng)細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化時(shí)，-actin mRNA的表達(dá)水平增加。 （3）、18srRNA 當(dāng)細(xì)胞有絲分裂時(shí)， 18srRNA表達(dá)量顯著上調(diào)。,35,三、內(nèi)參基因的選擇,3、內(nèi)參基因的選擇策略 根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，不同組織、不同細(xì)胞、細(xì)胞的不同生理時(shí)期、 不同的理化條件刺激等，查閱相關(guān)資料，選取三、四合適的內(nèi)參基因，做 熒光定量PCR，先以CT值最小的那條基因作為內(nèi)參，其他幾條內(nèi)參基因與其 相比，分析所得的比值，找出比值穩(wěn)定的幾條基因，比值穩(wěn)定說明該基因 表達(dá)穩(wěn)定，適合作為理想的內(nèi)參。 也可用geNorm內(nèi)參分析軟件來選擇合適的內(nèi)參基因。 對(duì)于比較精確的實(shí)驗(yàn)，最好采用兩種或兩種以上表達(dá)穩(wěn)定的基因作為 內(nèi)參，對(duì)每種內(nèi)參基因測(cè)得的基因表達(dá)變化求方差和平均值。 http:/medgen.ugent.be/jvdesomp/genorm/index.php,36,四、反應(yīng)體系的優(yōu)化,1、為什么要優(yōu)化反應(yīng)體系 與普通PCR反應(yīng)相比，熒光定量PCR在反應(yīng)中加入了熒光物質(zhì)，用以實(shí) 時(shí)顯示反應(yīng)的進(jìn)程，Taqman探針法在普通PCR反應(yīng)體系中加入了與擴(kuò)增片段 互補(bǔ)的一段帶熒光標(biāo)記的核酸序列，Taq酶除了5-3聚合酶作用之外，還要 發(fā)揮5-3外切酶的活性來水解探針鏈來產(chǎn)生熒光；SybrGreen法加入了 能與雙鏈核酸結(jié)合的熒光染料，這些熒光物質(zhì)都能影響Taq酶的活性進(jìn)而影 響PCR的反應(yīng)效率。,普通PCR反應(yīng)體系 模板 引物 Taq酶 Buffer Mg2 水,定量PCR反應(yīng)體系 模板 引物 熒光基團(tuán) Taq酶 Buffer Mg2 水,37,四、反應(yīng)體系的優(yōu)化,1、為什么要優(yōu)化反應(yīng)體系,普通PCR結(jié)果電泳圖,添加熒光基團(tuán)后PCR結(jié)果電泳圖,38,四、反應(yīng)體系的優(yōu)化,2、如何優(yōu)化 由上圖可知，添加熒光基團(tuán)后，PCR的反應(yīng)效率幾乎為0，所以必須對(duì) 熒光定量PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)體系中各個(gè)反應(yīng)成分的濃度進(jìn)行調(diào)整。 其中最關(guān)鍵的因素：Mg2濃度、熒光基團(tuán)濃度、引物濃度 對(duì)于SYBR Green熒光染料定量PCR反應(yīng)體系來說， Mg2的最佳濃度 為3.0-4.0mM； 對(duì)于Taqman探針反應(yīng)體系來說， Mg2的最佳濃度為5.0mM左右，引物 最佳濃度為500nM，探針的最佳濃度為250nM。,39,四、反應(yīng)體系的優(yōu)化,2、如何優(yōu)化,SYBR Green反應(yīng)體系中Mg2濃度梯度優(yōu)化PCR電泳結(jié)果,40,四、反應(yīng)體系的優(yōu)化,2、如何優(yōu)化,優(yōu)化后的Taqman探針體系實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Mg2濃度為5.0mM左右，引物濃度為500nM，探針濃度為250nM。,41,四、反應(yīng)體系的優(yōu)化,3、自行配制熒光定量PCR試劑 （1）、常用的SYBR Green預(yù)混酶（2X） HotStar TaqE Buffer Mg2 其中Mg2濃度為67mM （2）、常用的Taqman預(yù)混酶（2X） TaqE Buffer Mg2 其中Mg2濃度為10mM,42,五、實(shí)驗(yàn)方案的選擇,定量PCR實(shí)驗(yàn)方案,定量PCR實(shí)驗(yàn)方案,熒光染料法,Taqman探針法,雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法,2 -CT法,雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法,2 -CT法,43,五、實(shí)驗(yàn)方案的選擇,定量PCR實(shí)驗(yàn)方案 （1）、染料法適合于基因含量及基因表達(dá)變化的粗略分析或初篩；在分析 的基因種類很多，但是樣品量很少時(shí)，尤其適用。 （2）、探針法適合常被用作基因含量的精確檢測(cè)(精確度可達(dá)幾十個(gè)拷貝) 及基因表達(dá)變化的精確分析（精確度可達(dá)0.1倍的變化）。 （3）、雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法適合樣品量大、檢測(cè)的基因種類相對(duì)較少、精度要求 較高的實(shí)驗(yàn)。 （4）、 2 -CT法適合檢測(cè)精度要求一般，樣品量相對(duì)較少，檢測(cè)的基 因種類相對(duì)較多的實(shí)驗(yàn)。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，如檢測(cè)的精度要求、樣品數(shù)量、基因數(shù)量、 經(jīng)費(fèi)情況等來選擇合適的實(shí)驗(yàn)方案。,44,六、誤差分析及操作規(guī)范,1、誤差分析 （1）、實(shí)驗(yàn)方案本身的誤差 熒光染料法由于染料本身的特性，不可避免的會(huì)引起誤差； 2 -CT法由于也是一種近似的算法，所以不可避免的也會(huì)引起 誤差； Taqman探針法誤差相對(duì)較??； 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法誤差相對(duì)較小。 （2）、儀器設(shè)備引起的誤差 測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品核酸濃度時(shí)，分光光度計(jì)的誤差，從光密度值到質(zhì)量再 到摩爾量，誤差本身就很大（雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法不一定非要測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的 濃度）； 定量PCR儀的誤差 耗材引起的誤差，96空板封口膜透光性的差異等,45,六、誤差分析及操作規(guī)范,1、誤差分析 （3）、相對(duì)定量時(shí)內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定引起的誤差 （4）、操作引起的誤差 樣品處理、選取、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、加樣，操作過程中引起的誤 差。 2、操作規(guī)范 熒光定量PCR是一項(xiàng)對(duì)操作要求很高的實(shí)驗(yàn)，同時(shí)又是花費(fèi)很高的一項(xiàng) 實(shí)驗(yàn)，這就要求必須最大程度的減少誤差或避免錯(cuò)誤。要想達(dá)到這個(gè)目 標(biāo)，我們必須從樣品的選取開始到上樣檢測(cè)，每一步都要規(guī)范操作。 （1）、樣品的處理及選取 處理樣品時(shí)，必須確保樣品都得到了充分的處理。如測(cè)定一種藥物 到小白鼠免疫系統(tǒng)的影響，必須做到每次飼喂時(shí)此藥品完全被小白 鼠攝食；選取試驗(yàn)樣品時(shí)，要保證選取的組織盡可能的純，不要污 染其他組織，如選取脾臟組織時(shí)，盡可能的選取脾臟，不能混有結(jié) 締組織等，樣品選取好后，即可放入液氮或超低溫冰箱保存。,46,六、誤差分析及操作規(guī)范,2、操作規(guī)范 （2）、核酸提取 加入液氮研磨要徹底，蛋白、多糖、多酚類物質(zhì)要去除干凈，確保 得到高質(zhì)量的核酸，分光光度計(jì)檢測(cè)核算質(zhì)量，RNA OD260/280 2.0左右，DNA OD260/2801.8左右，最好再做電泳檢測(cè)；同一樣 品要提取2到3個(gè)RNA，所剩余的樣品不要丟棄，繼續(xù)低溫保存。 （3）、得到的RNA立即反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RNA樣品最好不要存放，反轉(zhuǎn)錄所得 cDNA要用看家基因檢測(cè)。 （4）、對(duì)于精度要求較高的定量PCR，最好先在樣品的所有組織類型內(nèi)做 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析，找出表達(dá)恒定基因作為內(nèi)參。 （5）、做定量PCR時(shí)，先把除模板外的所有試劑預(yù)混，然后分裝到PCR管 中，分裝時(shí)盡量采用排槍，加樣時(shí)盡量最好采用排槍。 （6）、體系中最好摻入ROX參比熒光，消除光程差和加樣的偏差。,47,六、誤差分析及操作規(guī)范,2、操作規(guī)范 （7）、重復(fù)操作 讓重復(fù)操作最大的修正偏差？最有意義的重復(fù)是在提取樣品RNA時(shí) 就重復(fù)，同一個(gè)樣品，分別提取3份RNA，3份RNA都做反轉(zhuǎn)錄，所 得的3份cDNA都做定量PCR檢測(cè)，這樣的重復(fù)之所以最有意義是因 為我們是把RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、上機(jī)檢測(cè)三步做了重復(fù)，這樣得出 的平均值要比只在上機(jī)檢測(cè)時(shí)對(duì)同一cDNA樣品做三個(gè)重復(fù)要有意義 的多。 同一個(gè)cDNA樣品做三個(gè)重復(fù)定量檢測(cè)求平均值主要是消除加樣時(shí)的 誤差，排槍加樣時(shí)，誤差很小，加樣時(shí)的誤差可以通過設(shè)幾個(gè)重復(fù) 檢測(cè)出來。,48,六、誤差分析及操作規(guī)范,2、操作規(guī)范,同一cDNA樣品的三個(gè)重復(fù),49,六、誤差分析及操作規(guī)范,模板濃度越低，染料法的誤差越大。如圖一系列梯度稀釋的模板，理論上它們 在擴(kuò)增曲線上的CT值之差，應(yīng)該相等，但是后邊幾個(gè)濃度低的樣品CT值明顯提 前了，由熔解曲線可知對(duì)于濃度低的樣品，引物二聚體引起的誤差非常嚴(yán)重。,50,七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控,1、熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中污染源的分析 （1）、PCR產(chǎn)物引起的污染 在檢測(cè)過程中，熒光定量PCR產(chǎn)物都是封閉在PCR管中的，不存在開 管檢測(cè)，所以有污染的話，最有可能是因?yàn)殡娪緳z測(cè)熒光定量PCR 產(chǎn)物時(shí)引起的污染，只要將電泳室與PCR加樣室隔離開，就能有效 的避免PCR產(chǎn)物的污染。 （2）、標(biāo)準(zhǔn)品引起的污染 常用的標(biāo)準(zhǔn)品有含有目的基因的質(zhì)粒、純化后的PCR產(chǎn)物等，由于 標(biāo)準(zhǔn)品的濃度是一系列從高到低梯度稀釋的，所以在稀釋過程中， 有可能引起污染。 （3）、高濃度的樣品引起的污染 高濃度的陽(yáng)性樣品在加樣過程中可能會(huì)形成氣溶膠，造成污染。,51,七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控,2、熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中污染的防控 （1）、對(duì)于PCR產(chǎn)物引起的污染 最簡(jiǎn)單有效地辦法就是將電泳室與加樣室徹底隔離開，做到每個(gè)房 間都有專屬的移液器，做到移液器專用；或者采用dU代替dT配合 UNG酶，是解決PCR產(chǎn)物污染的有效辦法，但是成本較高。 （2）、對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品引起的污染 目前只能是以預(yù)防，加標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)最好采用專用移液器，不要和加樣 的移液器交叉使用，加標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)最好在通風(fēng)廚中進(jìn)行，和加樣的操 作臺(tái)隔離開。 （3）、對(duì)于樣品間的檢查污染 樣品間的交叉污染往往是因?yàn)楦邼舛鹊臉悠吩诩訕邮倚纬闪藲馊?膠，因?yàn)闃悠返腸DNA鏈較長(zhǎng)，經(jīng)常開紫外燈，把長(zhǎng)鏈cDNA打斷，能 有效避免此類污染的發(fā)生，另外保持加樣室空氣流通也有助于防止 此類污染。,52,七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控,2、熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中污染的防控 （4）、對(duì)于未知污染源的頑固的污染的防控 這類污染也經(jīng)常出現(xiàn)，找不到明確的污染源，而且此類污染又非常 頑固，對(duì)于這種情況，最好的辦法就是不去管它，在采用絕對(duì)定量 和雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法時(shí)，污染的初始模板量可由陰性對(duì)照檢測(cè)出來，知 道了污染的初始模板量后，我們可以把測(cè)得樣品的初始模板量減去 污染的初始模板量，在分析時(shí)就避免了污染造成的誤差。,53,七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控,圖中最后一個(gè)樣品為陰性對(duì)照，本來應(yīng)該是一直線，但是儀器也檢測(cè)到了熒光信號(hào),54,七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控,電泳結(jié)果顯示，該陰性對(duì)照確實(shí)有PCR產(chǎn)物出現(xiàn),55,七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控,通過定量PCR檢測(cè)，測(cè)得該陰性樣品中含有227個(gè)初始模板。假如這個(gè)污染屬于是頑 固的未知污染，可以用正常樣品測(cè)得的初始模板量減去227，來避免污染引起的誤差,56,八、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將得到的結(jié)果進(jìn)行分析，現(xiàn)在很多軟件都帶有結(jié)果的自動(dòng)分 析功能，可以將結(jié)果直接轉(zhuǎn)化為各種圖表及柱狀圖。對(duì)于和實(shí)驗(yàn)預(yù)期偏離 比較大的樣品，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)。,57,謝 謝！,電話：15238020968，QQ ：458261751，都市巡洋艦 如有問題需要交流，請(qǐng)隨時(shí)聯(lián)系！,58,