固相萃取——液相色譜法測(cè)定水中毒死蜱等3種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留生物技術(shù)專業(yè)

固相萃取液相色譜法測(cè)定水中毒死蜱等3種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留摘 要 本試驗(yàn)通過固相萃取-高效液相色譜的方法，檢測(cè)了水中三種農(nóng)藥殘留，并且通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最后選擇出最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件，采取C18作為固相萃取劑，乙酸乙酯為洗脫劑，最后進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)分析時(shí)選用了C18反相色譜柱。結(jié)果表明可以用這個(gè)方法來對(duì)水中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量進(jìn)行檢測(cè)。關(guān)鍵詞 固相萃取液相色譜法、丙溴磷、三唑磷、毒死蜱Abstract In this experiment, three pesticide residues in water were detected by solid phase extraction-high performance liquid chromatography (SPE-high performance liquid chromatography), and the optimal experimental conditions were selected through optimization experiments. C18 was used as solid phase extraction agent, ethyl acetate as eluent, and C18 reversed phase chromatographic column was selected for high performance liquid chromatography (HPLC) detection and analysis. The results show that this method can be used to detect organophosphorus pesticide residues in water. Key words Solid phase extraction-liquid chromatography, propyl bromide, Triazophos and chlorpyrifos 丙溴磷能夠殺滅絕大多數(shù)害蟲且藥劑附著力高，是一種分子內(nèi)含有正丙硫基的硫代磷酸酯類的中等毒性殺蟲劑，丙溴磷即使是一些對(duì)農(nóng)藥有抗性的害蟲依舊可以殺滅。三唑磷是現(xiàn)在使用比較廣泛的一款殺蟲、殺螨劑，對(duì)一些對(duì)農(nóng)作物有危害的害蟲有非常好的殺滅效果。毒死蜱對(duì)棉鈴蟲有非常好的效果，是一種乙酰膽堿酯酶的抑制劑，屬于硫逐磷酸酯類的中等毒性殺蟲劑?，F(xiàn)在的農(nóng)業(yè)種植中已經(jīng)禁止使用甲胺磷、對(duì)硫磷等有機(jī)磷殺蟲劑，以上的三種殺蟲劑因?yàn)槠淞己玫臍⑾x效果，在農(nóng)業(yè)中得到了很好的利用，使用量大大增加。這三種殺蟲劑在廣泛使用之后，在水環(huán)境中會(huì)有大量的殺蟲劑殘留，嚴(yán)重的影響到了我們當(dāng)下的水質(zhì)量。但是在現(xiàn)在的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，并沒有對(duì)這三種農(nóng)藥的殘留量做出明確的規(guī)定。并且在對(duì)農(nóng)藥殘留檢測(cè)中，大多數(shù)研究都只是針對(duì)其中一種或者兩種進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)這三種農(nóng)藥殘留同時(shí)檢測(cè)還沒有進(jìn)行有關(guān)的報(bào)道。本文提供了一種通過高效液相色譜法對(duì)水中這三種農(nóng)藥進(jìn)行分離，并且進(jìn)行測(cè)定的方法。一、 實(shí)驗(yàn)部分1、 儀器與試劑Thermo Fisher U3000 液相色譜儀萊伯泰科sepaths-12 全自動(dòng)固相萃取儀實(shí)驗(yàn)中的色譜柱如下：其中固相萃取柱有C18(ODS)、氨基（NH2），弗洛弗羅里硅土（Florisil）。實(shí)驗(yàn)試劑中，毒死蜱、丙溴磷、三唑磷的純度分別為98.9%、96.5%、95.8%，均為標(biāo)準(zhǔn)品；甲醇、乙腈為色譜純級(jí)別；丙酮、正乙烷、乙酸乙酯為優(yōu)級(jí)純級(jí)別；實(shí)驗(yàn)過程的用水均為超純水。1.2色譜條件 DDS-C18色譜柱的流動(dòng)相為乙腈（13+7）溶液，每次實(shí)驗(yàn)的進(jìn)樣體積為5l，每分鐘的流量為1.5ml，實(shí)驗(yàn)所選定的波長(zhǎng)為230nm，柱溫為40.1.3試驗(yàn)方法 將待測(cè)水樣過濾，去除懸浮物雜質(zhì)，用2ml甲醇來活化固相萃取柱，同時(shí)將200ml的待測(cè)水樣流過固相萃取柱，水樣完全通過色譜柱后用10ml乙酸乙酯洗脫，用氮吹儀在40條件下用吹干濃縮后用甲醇定容至2ml，用0.22m濾膜過濾備用。2、結(jié)果與討論2.1色譜條件的優(yōu)化2.1.1波長(zhǎng)的選擇 最大吸收波長(zhǎng)的選擇：通過全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)這幾種待測(cè)試劑中在230nm波長(zhǎng)處，毒死蜱、三唑磷有最大吸收波長(zhǎng)，丙溴磷也有較大的吸收并且受到的干擾較小。因此，通過綜合考慮最大吸收波長(zhǎng)以及干擾等因素，最終選擇230nm為本次實(shí)驗(yàn)的測(cè)定波長(zhǎng)。2.1.2 流動(dòng)相的選擇在選擇流動(dòng)相時(shí)，測(cè)定了甲醇、甲醇（6+4）、乙晴（14+6）溶液，乙晴（4+6）溶液這幾種試劑作為流動(dòng)相對(duì)幾種農(nóng)藥的分離效果。最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)選用乙晴（14+6）溶液作為流動(dòng)相時(shí)，所取得的分離效果最好，能夠很好的分離這三種農(nóng)藥，選用其他的流動(dòng)相都不能使幾種農(nóng)藥得到很好的分離。并且選用乙晴（14+6）溶液作為流動(dòng)相時(shí)產(chǎn)生峰形和其他的峰形相比相對(duì)對(duì)稱。所以，本試驗(yàn)選用的流動(dòng)相為乙腈（14+6）溶液。2.1.3 流量的選擇為了確定實(shí)驗(yàn)的流量，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的流量選用了0.7ml/min、1.5ml/min、2.0ml/min三種流量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：選用的流量為0.7ml/min時(shí)，幾種農(nóng)藥的出峰時(shí)間都比較晚；當(dāng)選用2.0ml.min進(jìn)行流量分析時(shí)，實(shí)驗(yàn)時(shí)出峰速度太快，實(shí)驗(yàn)不好操作影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；當(dāng)選用1.5ml/min進(jìn)行流量分析時(shí)，不僅出峰的時(shí)間合適，并且也能較好的將這幾種農(nóng)藥分離。因此，本次實(shí)驗(yàn)所選用的流量為 1.5 ml/min。2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)樣品的液相色譜圖 在進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，圖1為實(shí)驗(yàn)三種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)中選用的幾種農(nóng)藥的極性相差比較大，實(shí)驗(yàn)過程中為了在保證幾種農(nóng)藥有較好的分離度的同時(shí)也能防止雜質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，因此在對(duì)色譜條件進(jìn)行選擇的時(shí)候所選用的農(nóng)藥保留時(shí)間均不超過十分鐘。毒死蜱丙溴磷三唑磷7.5102.550圖一標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖 2.2樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化2.2.1固柱萃取柱的選擇在進(jìn)行萃取柱的選擇實(shí)驗(yàn)中，選用了C14、NH2、TPS、Florisil這四種進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。試驗(yàn)表明：當(dāng)選用NH2柱和TPS柱時(shí)作萃取柱時(shí)對(duì)三種農(nóng)藥的富集作用都比較差；Florisil萃取柱雖然對(duì)這幾種農(nóng)藥都有一定的回收效果，但是回收效果一般，回收效果最好的毒死蜱的回收率都只能達(dá)到60.8%；C18柱對(duì)毒死蜱、三唑磷、丙溴磷的回收率分別為：82.8%、79.6%、85.5%，回收率穩(wěn)定在80%左右；因?yàn)镃18柱的烷基多，萃取柱的碳含量較高，另外該萃取柱的疏水性也比較好，因此對(duì)這幾種農(nóng)藥也有了更好的保留能力。因此，本次實(shí)驗(yàn)所選用的固相萃取柱為C18柱。根據(jù)上述的實(shí)驗(yàn)，選用了C18固相萃取柱，根據(jù)其性質(zhì)以及溶液的極性，實(shí)驗(yàn)另外選取了六種洗脫劑來進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：甲醇、乙晴幾乎不能將這幾種農(nóng)藥洗脫下來；當(dāng)選用丙酮、正己烷以及丙酮-正已烷（1+1）混合洗脫作為洗脫劑的時(shí)候，對(duì)丙溴磷的回收率分別為70.0%、75.6%、55.7%，對(duì)三唑磷的回收率分別為44.0%、64.0%、33.0%；對(duì)毒死蜱的回收率分別為62.0%、64.8%、34.0%?？梢钥闯?，選用這三種洗脫劑的洗脫效果均不理想，沒有達(dá)到我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)于農(nóng)藥殘留的要求。當(dāng)乙酸乙酯為洗脫劑時(shí)，對(duì)這三種農(nóng)藥均有很好的洗脫效果。因此，乙酸乙酯為本次實(shí)驗(yàn)所選用的洗脫劑。2.2.3 洗脫劑用量的選擇 通過上述的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最終選擇了乙酸乙酯作為實(shí)驗(yàn)的洗脫劑，另外對(duì)乙酸乙酯的用量進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，測(cè)定不同的實(shí)驗(yàn)用量對(duì)幾種農(nóng)藥的回收率影響。實(shí)驗(yàn)表明表明：當(dāng)乙酸乙酯的用量為10ml時(shí)，對(duì)這幾種農(nóng)藥的回收效果最好，回收率均超過85%，滿足對(duì)農(nóng)藥殘留的要求。因此實(shí)驗(yàn)所選用的乙酸乙酯用量為10ml。2.3 方法的檢出限和測(cè)定下限 分配配置三種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，使溶液的濃度為0.05，0.1，0.5，1.0，2.0 mg. L-1，根據(jù)以上選用的優(yōu)化條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定，實(shí)驗(yàn)得出，三種農(nóng)藥在3種農(nóng)藥0.052.00 mg. L-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性關(guān)系，結(jié)果如表1所示。 實(shí)驗(yàn)的檢出限和測(cè)定下限如下表1所示，分別是通過空白樣的三倍、十倍信噪比計(jì)算而來。 表1線性參數(shù)、檢出限與測(cè)定下限農(nóng)藥線性范圍/mg. L-1）線性回歸方程相關(guān)系數(shù)檢出限/mg. L-1）測(cè)定下限/mg. L-1）毒死蜱0.052.0=1.24×103+6.240.9987.7×10-42.6×10-3三唑磷0.052.0=1.21×103+29.40.9999.9×10-43.3×10-3丙溴磷0.052.0=7.30×102_5.270.9971.6×10-35.2×10-3從上表可知，水中這三種農(nóng)藥的殘留量可以根據(jù)該方法測(cè)定。2.4方法的準(zhǔn)確度和精密度為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，通過在空白水樣中添加0.05、0.10、0.50mg. L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液來進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，其相對(duì)偏差（RSD）和加標(biāo)回收率如下表所示表2精密度與回收試驗(yàn)結(jié)果（N=8）農(nóng)藥加標(biāo)量/mg. L-1）回收率/%RSD/%毒死蜱0.0575.21.40.1084.31.70.5085.08.2三唑磷0.0588.00.410.1085.52.40.5089.04.0丙溴磷0.0586.60.550.1085.82.80.5089.04.2從上表的RSD和回收率可以看出，該方法的準(zhǔn)確度和精密度都比較高，可以用于對(duì)水中農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)分析。2.5 實(shí)際水樣的測(cè)定實(shí)驗(yàn)的待測(cè)水樣選自采集安徽省某工業(yè)園區(qū)7個(gè)采樣點(diǎn)，分別對(duì)這幾個(gè)地區(qū)的水樣進(jìn)行了這幾種農(nóng)藥殘留檢測(cè)實(shí)驗(yàn)以及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，在測(cè)定的7個(gè)水樣中，三號(hào)水樣的檢測(cè)結(jié)果中含有三唑磷，五號(hào)水樣中檢測(cè)出了毒死蜱，其他的水平均為測(cè)出這幾種農(nóng)藥。 表3水樣分析結(jié)果（N=5）序號(hào)丙溴磷三唑磷毒死蜱測(cè)定值 /mg. L-1回收率測(cè)定值 /mg. L-1回收率測(cè)定值 /mg. L-1回收率186.088.582.7285.085.381.8386.00.003595.182.5487.288.585.1589.589.50.002089.5688.785.783.5786.884.884.0由表3可以看出實(shí)驗(yàn)的加標(biāo)回收率均在80%以上，符合現(xiàn)在我國(guó)對(duì)于水中農(nóng)藥殘留的要求，表明可以用這種方法檢測(cè)水中這三種農(nóng)藥的殘留。本試驗(yàn)通過固相萃取-高效液相色譜的方法，檢測(cè)了水中三種農(nóng)藥殘留，并且通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最后選擇出最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件，采取C18作為固相萃取劑，乙酸乙酯為洗脫劑，最后進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)分析時(shí)選用了C18反相色譜柱。結(jié)果表明可以用這個(gè)方法來對(duì)水中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量進(jìn)行檢測(cè)。本次實(shí)驗(yàn)同國(guó)家現(xiàn)有的檢測(cè)這三種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)方法相比，這種方法更加簡(jiǎn)單，可以一次性檢測(cè)出這三種農(nóng)藥的殘留量而不需要逐一檢測(cè)。在同一個(gè)條件下就可以檢測(cè)出這三種農(nóng)藥的殘留量且實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性高，因此可以廣泛運(yùn)用到現(xiàn)在的水樣中農(nóng)藥殘留檢測(cè)中。參考文獻(xiàn)1 程運(yùn)斌、劉育清。 丙溴磷、毒死蜱30%。乳油氣相色譜分析【J】。農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究2014.4 9-24。2 李秀杰、姜敏怡。 三唑磷的氣相色譜分析【J】農(nóng)藥 2014.36：32-34。3 王川、周巧紅，吳振斌。 有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱研究進(jìn)展【J】。環(huán)境科學(xué)與技術(shù)2011.7（34:124-125）。4 李永剛、毛燕妮、陳子亮。凝膠滲透色譜高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定咸魚中7中有機(jī)磷農(nóng)藥【J】食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)。2014.9（5）:2670-2677）。5 HG3626-1999 40% 丙溴磷乳油【S】。6 GB19605-2064 毒死蜱乳油【S】。7 HG2847-1997 三唑磷乳油【S】。