激光共聚焦顯微鏡原理和操作.ppt

激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 樣品要求原理功能在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用 ThetechniquesandapplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 人眼分辨率 0 2mm光學(xué)顯微鏡分辨率 0 25mm電子顯微鏡分辨率 0 2nm共焦顯微鏡分辨率 0 18mm 二 原理 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 原理小結(jié) Confocal利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測(cè)器前的探測(cè)針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)探測(cè) 來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上 該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測(cè)針孔上 該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測(cè)針孔阻擋 照明針孔與探測(cè)針孔對(duì)被照射點(diǎn)或被探測(cè)點(diǎn)來說是共軛的 因此被探測(cè)點(diǎn)即共焦點(diǎn) 被探測(cè)點(diǎn)所在的平面即共焦平面 計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測(cè)點(diǎn)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上 為了產(chǎn)生一幅完整的圖像 由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描 從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像 只要載物臺(tái)沿著Z軸上下移動(dòng) 將樣品新的一個(gè)層面移動(dòng)到共焦平面上 樣品的新層面又成像在顯示器上 隨著Z軸的不斷移動(dòng) 就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別1 抑制圖像的模糊 獲得清晰的圖像 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別2 具有更高的軸向分辨率 并可獲取連續(xù)光學(xué)切片 conventional confocal 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別3 增加側(cè)向分辨率 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別4 由于點(diǎn)對(duì)點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 三 激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn) 1 點(diǎn)照明2 具有照明pinhole和探測(cè)pinhole3 照明pinhole和探測(cè)pinhole共軛 共焦 共焦點(diǎn)即被探測(cè)點(diǎn) 被探測(cè)點(diǎn)所在的平面為共焦平面4 具有掃描系統(tǒng) 逐點(diǎn)掃描成像5 具有多個(gè) 四個(gè) 熒光通道 可同時(shí)探測(cè)多個(gè)被標(biāo)記物 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 技術(shù)指標(biāo) LeicaTCSSP2 1 xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1 4x傳統(tǒng)顯微鏡 Rxy 0 61 NA 0 25 m Confocal Rxy 0 4 NA 0 18 m 2 樣品的最大厚度 取決于 物鏡的NA 物鏡的工作距離激光的穿透力 樣品的透明度Z軸的最大移動(dòng)范圍 166 m Z wide 3 樣品的最小光切厚度 載物臺(tái)最小移動(dòng)距離為40nm 取決于 物鏡的NA 針孔大小Z軸的最小移動(dòng)步距 40nmZ軸的分辨率 0 35 m 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 4 激光器Ar激光器 458nm 476nm 488nm 514nmGreNe 543nm HeNe 633nmAr激光器 UV 361nm激光器的特點(diǎn) 1 方向性好 激光基本延直線傳播2 單色性好 10 8nm3 高亮度 激光方向性好 其在空間上的能量分布是高度集中的 4 偏振性 激光為平面偏振光 光纖耦合 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 5 四個(gè)熒光通道 一個(gè)透射光通道即除了可同時(shí)采集多標(biāo)記熒光圖像外還可以同時(shí)采集透射光圖像 但透射光圖像為非共焦圖像 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 6 掃描速度 slow220lines s512 5122 3秒slow2440lines s 2 雙向掃描 medium450lines s512 5121 7秒medium2900lines sfast1000lines s512 5120 7秒128 1280 2秒fast22000lines s7 掃描密度 64 64128 128512 5121024 10242048 2048 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用 TheapplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 功能 1 多熒光標(biāo)記樣品的高清晰度 高分辨率圖像采集2 無損傷 連續(xù)光學(xué)切片 顯微 CT 3 真正的三維重組4 假三維圖的顯示5 可沿Z軸 xy平面 和Y軸 xz平面 方向進(jìn)行光切6 定量分析7 時(shí)間序列掃描 xyt xyzt和xt掃描8 圖像處理9 旋轉(zhuǎn)掃描10 感興趣區(qū)域掃描11 光譜掃描 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 應(yīng)用定位 定量三維重組動(dòng)態(tài)測(cè)量 活細(xì)胞或組織內(nèi)游離Ca2 分布和濃度的變化測(cè)量 Mg2 Zn Na K 自由基的檢測(cè) 藥物進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程 定位分布及定量 蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 活細(xì)胞內(nèi)H 濃度 pH值 的測(cè)量線粒體膜電位的測(cè)量熒光漂白恢復(fù) FRAP 的測(cè)量籠鎖解籠鎖的測(cè)量熒光能量共振轉(zhuǎn)移 FRET 的測(cè)量其他應(yīng)用 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 一 定位 定量免疫熒光標(biāo)記 單標(biāo) 雙標(biāo)或三標(biāo) 的定位 定量 如 細(xì)胞膜受體或抗原的分布 微絲 微管的分布 兩種或三種蛋白的共存與共定位 蛋白與細(xì)胞器的共定位 核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位和干細(xì)胞的增值 分化細(xì)胞凋亡 AnnexinV fitc PI末端原位雜交 fitc PI熒光原位雜交 染色體基因定位 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 定位 定量研究中常用熒光探針1 Amine ReactiveProbes與抗體耦聯(lián) 與配體耦聯(lián) 與肽耦聯(lián) 與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針 可用于免疫組化 熒光原位雜交 受體標(biāo)記等GreenRedFura redFITC494 518TRITC544 572Cy5650 690 異硫氰基熒光素 四甲基異硫氰基羅丹明 AlexaFluor488488 530PE565 578 藻紅蛋白 TexasRed595 615 德州紅 Cy3558 568BODIPYFL503 512BODIPYTMR543 569BODIPYTR592 618 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 1 細(xì)胞表面抗原 胞內(nèi)某種蛋白免役熒光標(biāo)記 與抗體耦聯(lián) 直標(biāo) 一抗 熒光探針間標(biāo) 二抗 熒光探針如 微管蛋白tublin 抗tublin抗體 熒光探針 肌動(dòng)蛋白actin Palloidine 熒光探針 2 細(xì)胞膜表面受體配體 熒光探針如 nAchR mAchR 多巴胺受體 D1 D2 標(biāo)記Gm1 霍亂毒素受體霍亂毒素 FITC 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 2 標(biāo)記細(xì)胞器熒光探針1 線粒體MitochondriaRodamin123505 534 可染活細(xì)胞 陽離子 可檢測(cè)線粒體膜電位 且在多數(shù)細(xì)胞中停留時(shí)間短JC1線粒體膜電位低時(shí)為單體490 527發(fā)綠光線粒體膜電位高時(shí)為多聚體490 590發(fā)紅光可標(biāo)記活細(xì)胞線粒體 且為檢測(cè)線粒體膜電位最佳探針MitotrackerGreenFM490 516 染活細(xì)胞或固定細(xì)胞 穩(wěn)定不漏出MitotrackerOrangeCMTMRos551 576 氧化型 MitotrackerOrange還原型 只能染活細(xì)胞 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 2 溶酶體Lysosome中性紅541 640 微偏堿性 可標(biāo)記溶酶體等酸性器官為非特異性AO LysoTrackerGreenDND 26504 511 染活細(xì)胞LysoTrackerBlueLysoTrackerRed3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)EndoplasmicReticulumDiOC6484 500 非特異性 較高濃度標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 較低濃度標(biāo)記線粒體4 高爾基體GolgiapparatusNBDC6 ceramie466 536 可染活或死細(xì)胞 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 3 GFP綠色熒光蛋白GFP的的發(fā)現(xiàn) 60年代 Shimomura等首先從水母中分離出一種水母發(fā)光蛋白 aequoren 該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光 然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色 后經(jīng)證實(shí)在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白GFP 后經(jīng)研究表明 在水母體內(nèi)Ca2 和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后 水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍(lán)色熒光 GFP在藍(lán)光的激發(fā)下 產(chǎn)生綠色熒光 將外源基因與GFPDNA相連 GFP可作為外源基因的報(bào)告基因?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)外源基因的表達(dá) 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 GFP主要應(yīng)用 對(duì)活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動(dòng)態(tài)觀察可實(shí)時(shí)原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng) 分裂 分化過程中或外界刺激因子的作用下的時(shí)空表達(dá) 如某種轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)位 蛋白激酶C的膜轉(zhuǎn)位等 GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞 可動(dòng)態(tài)觀察該分泌蛋白分泌到細(xì)胞外的過程GFP基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因相連 就能顯示活細(xì)胞中細(xì)胞核 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 高爾基體 線粒體等細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及病理過程可用于觀察分子的運(yùn)動(dòng) FRAP 蛋白之間的相互作用 FRET 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 三 動(dòng)態(tài)測(cè)量Physiology 細(xì)胞內(nèi)離子動(dòng)態(tài)變化測(cè)量1 游離Ca2 測(cè)量檢測(cè)游離Ca2 變化熒光探針的原理 這類探針多為Ca2 螯合劑 不與Ca2 結(jié)合時(shí)不發(fā)熒光 通常也不能進(jìn)入細(xì)胞膜 只有與乙酰甲酯AM相連方可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) 被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光 Kd值為Ca2 解離常數(shù) 表明檢測(cè)Ca2 濃度的范圍 0 1xKd 10 xkd Kd和很多因素有關(guān) 如pH Mg2 與蛋白的結(jié)合 溫度等 細(xì)胞內(nèi)生理Ca2 濃度值 10 100nM 細(xì)胞內(nèi)Ca2 超載濃度值 基礎(chǔ)Ca2 濃度的10倍左右 熒光探針激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)KdFLuo3 AM K dextran506nm525nm390nMFluo4506nm525nmCalciumGreen 1507nm530nm190nMCalciumGreen 2507nm535nm550nMFurared420 480nm637nm140nMOregonGreen488494nm520nm20 000nMCalciumCrimson583nm602nm328nMIndo 1356nm405 458nm230nMFura 2340 380476nm145nM 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 程序化測(cè)量 用timelapse中的編程按鈕可進(jìn)行不同時(shí)間序列的掃描測(cè)量 F F F Fbase Fbase FBG Ca2 濃度絕對(duì)測(cè)量1 單波長(zhǎng)公式法Fluo3 530nmKd 450nM Ca2 I Kd F Fmin Fmax F Fmin 細(xì)胞內(nèi)無鈣時(shí)的熒光強(qiáng)度 MnCl2 Fmax 細(xì)胞內(nèi)鈣飽和時(shí)的熒光強(qiáng)度 A23187 測(cè)量時(shí)切記細(xì)胞內(nèi)靜息Ca2 濃度的相對(duì)熒光強(qiáng)度值不能太低 F值不低于40 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 細(xì)胞內(nèi)生理Ca2 濃度值 10 8 10 7M 細(xì)胞內(nèi)Ca2 超載濃度值 基礎(chǔ)Ca2 濃度的10倍左右 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線法根據(jù)儀器條件和負(fù)載條件 以不同Ca2 濃度的Buffer EGTA Ca2 做標(biāo)準(zhǔn)曲線 橫軸為Ca2 濃度 縱軸為熒光強(qiáng)度3 比例熒光的測(cè)量 雙波長(zhǎng) 比例熒光 ratio Indo1 360 420 480 fura2 340 380 440 Ca2 I Kd R Rmin Rmax R Ff2 Fs2 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 快速Ca2 變化的測(cè)量1 改變掃描速度2 采用雙向掃描3 減少采樣點(diǎn)數(shù) 犧牲空間分辨率 4 采用線掃描 xt 細(xì)胞器的Ca2 測(cè)量1 線粒體內(nèi)游離Ca2 測(cè)量Fluo 3 TMRM 線粒體熒光探針 紅色 2 特異定位的重組水母發(fā)光蛋白水母發(fā)光蛋白與Ca2 結(jié)合后發(fā)藍(lán)光用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細(xì)胞器蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞 可測(cè)定亞細(xì)胞器內(nèi)的游離Ca2 變化目前已商品化的探針可檢測(cè) 線粒體 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 細(xì)胞核內(nèi)的游離Ca2 因生物發(fā)光很弱不能使用Confocal檢測(cè) 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 細(xì)胞內(nèi)游離Ca2 測(cè)量的應(yīng)用鈣的特性1 細(xì)胞內(nèi)外的電化學(xué)梯度103 104倍2 細(xì)胞膜滲透性稍有改變或鈣庫(kù)釋放稍有增加 導(dǎo)致胞內(nèi)鈣明顯升高3 細(xì)胞內(nèi)鈣為細(xì)胞激活 開關(guān) 細(xì)胞內(nèi)鈣的生理作用1 肌肉的興奮收縮 收縮偶聯(lián)2 神經(jīng)遞質(zhì)的釋放3 學(xué)習(xí)記憶的增強(qiáng)4 卵子受精5 細(xì)胞分裂和再生6 細(xì)胞調(diào)亡7 細(xì)胞間通訊 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 8 細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)9 DNA合成10 基因表達(dá)細(xì)胞內(nèi)鈣超載與疾病1 高血壓 腦缺血 心臟病 內(nèi)分泌病 胞內(nèi)鈣濃度異常2 糖尿病 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 多發(fā)性硬化病 胞內(nèi)鈣濃度增高3 人體缺鈣 骨鈣大量丟失 神經(jīng)細(xì)胞的鈣濃度增高4 老化和老年性癡呆 神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增高細(xì)胞內(nèi)生理Ca2 濃度值 10 8 10 7M 細(xì)胞內(nèi)Ca2 超載濃度值 基礎(chǔ)Ca2 濃度的10倍左右 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 電刺激引起骨骼肌細(xì)胞的Ca2 振蕩 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 pH值的檢測(cè) BCECF AM490nm530nm6 5 7 5Snarf 1 AM488nm580 640nm7 0 8 0 自由基的檢測(cè)熒光探針 H2DCF DA 504nm 529nm 2 氫 2氯熒光素乙酰乙酸鹽胞外H2DCF DA擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi)酯酶脫乙酰DCF H 不熒發(fā)光 DCF 發(fā)熒光 樣品不能在鏡下用汞燈照射及觀察Dihydrorhodamine123 507nm 529nm H2rhod123被動(dòng)擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi)在細(xì)胞內(nèi)被氧化成rod123 發(fā)光 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 藥物進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程及定位分布xyzt掃描 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 四 膜電位的測(cè)量標(biāo)記膜電位探針 慢反應(yīng) JC1510nm530 590nmDioc5 3 548nm573nmDioc6 3 484nm500nm快反應(yīng)探針 Di 4 ANEPPS496nm703nmDi 4 ANEPPS498nm713nm細(xì)胞膜靜息膜電位 70mV線粒體膜電位 150mV以上均屬于陽離子探針 更容易與線粒體親和 為線粒體膜電位探針 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 七 熒光能量共振轉(zhuǎn)移 fluorescenceResonanceEnergyTransfer 能量轉(zhuǎn)移 能量從分子的一個(gè)部位向另一個(gè)部位的傳遞 或能量從一個(gè)分子向另一個(gè)分子傳遞 能量的提供者叫能量供體 能量的接受者叫能量受體 熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條件 兩個(gè)熒光分子 供體 FL1 受體 FL2供體與受體的距離在2 7nm供體的發(fā)射波長(zhǎng)與受體的激發(fā)波長(zhǎng)一致 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 樣品要求 1 經(jīng)熒光探劑標(biāo)記 單標(biāo) 雙標(biāo) 三標(biāo) 2 固定的或活的組織3 固定的或活的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)培養(yǎng)在Confocal專用小培養(yǎng)皿或蓋玻片上4 懸浮細(xì)胞 甩片或滴片后 用蓋玻片封片 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 激光掃描共焦顯微鏡的發(fā)展趨勢(shì) 連續(xù)光譜型Confocal多光子激光掃描顯微鏡 MultiphotonLaserScanningMicroscopy 雙 多 光子激光掃描顯微鏡的優(yōu)勢(shì) 多光子激光掃描顯微鏡簡(jiǎn)介 多光子激光器波長(zhǎng)從700 1000nm連續(xù)可調(diào)雙光子波長(zhǎng) 350 500nm連續(xù)三光子波長(zhǎng) 230 330nm連續(xù)應(yīng)用 可直接清晰活體觀察某些非標(biāo)記神經(jīng)遞質(zhì)的分泌 5 HT 或NADPH的分布 例4長(zhǎng)時(shí)間觀察活體阿爾茨海默病模型小鼠 淀粉蛋白形成的狀況