聚丙烯酰胺凝膠電泳分離大腸桿菌全蛋白ppt課件

SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離大腸桿菌全蛋白 實(shí)驗(yàn)六 1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理 掌握SDS 聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)的操作技術(shù) 基礎(chǔ)性很強(qiáng) 使用范圍廣泛 學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)的考馬斯亮藍(lán)染色鑒定 2 實(shí)驗(yàn)原理 聚丙烯酰胺凝膠 是由單體丙烯酰胺 Acr 和交聯(lián)劑N N 甲叉雙丙烯酰胺 Bis 在催化劑N N N N 四甲基乙二胺 TEMED 和過硫酸銨 AP 或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠 以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳 PAGE AP提供自由基 TEMED是催化劑 催化自由基引起的聚合反應(yīng)進(jìn)行 3 實(shí)驗(yàn)原理 聚丙烯酰胺 4 實(shí)驗(yàn)原理 5 聚丙烯酰胺凝膠有下列特性 凝膠透明 有彈性 機(jī)械性能好 化學(xué)性能穩(wěn)定 與被分離物不起化學(xué)反應(yīng) 對pH和溫度變化較穩(wěn)定 幾乎無吸附和電滲作用 樣品用量少 靈敏度可達(dá)10 6g 凝膠孔徑可調(diào)節(jié) 分辨率高 6 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS 十二烷基磺酸鈉 蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中 與SDS分子按比例結(jié)合 形成帶負(fù)電荷的SDS 蛋白質(zhì)復(fù)合物 7 由于十二烷基硫酸根帶負(fù)電 使各種蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷 它的量大大超過了原蛋白質(zhì)分子的電荷量 因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有的電荷差別 SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后 還可引起構(gòu)象改變 蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物形成近似 雪茄煙 形的長橢圓棒 因此在進(jìn)行電泳時(shí) 蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量 而與所帶電荷和形狀無關(guān) 因此 可以利用SDS PAGE測定蛋白質(zhì)分子量 8 凝膠系統(tǒng)的分類 連續(xù)性凝膠電泳 不連續(xù)凝膠電泳 連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同 帶電顆粒在電場作用下 主要靠電荷和分子篩效應(yīng) 不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分 pH 凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性 帶電顆粒在電場中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng) 分子篩效應(yīng) 還具有濃縮效應(yīng) 9 實(shí)驗(yàn)原理 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳的三種效應(yīng) 濃縮效應(yīng)電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng) 10 濃縮效應(yīng) 不連續(xù)體系由電極緩沖液 濃縮膠及分離膠組成 濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠 凝膠緩沖液為pH6 8的Tris HC1 分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠 凝膠緩沖液為pH8 8的Tris HC1 電極緩沖液是pH8 3的Tris 甘氨酸緩沖液 11 濃縮效應(yīng) 1 凝膠孔徑的不連續(xù)性 濃縮膠的凝膠濃度較小 孔徑較大 把較稀的樣品加在濃縮膠上 樣品的移動(dòng)速度較快 最終使樣品 堆積 在濃縮膠和分離膠之間而被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶 大大提高了電泳的靈敏度 12 在pH6 8的凝膠緩沖體系中 前導(dǎo)離子或快離子 HCl 解離 Cl Cl 泳動(dòng)速度最快 尾隨離子 trailingion 或慢離子 CH2 NH2 COOH CH2 NH2 COO 泳動(dòng)速度最慢 蛋白質(zhì) P 泳動(dòng)速度介于快慢離子之間 電泳時(shí) Cl 超過P走在最前面 其后形成一個(gè)離子濃度較低的低電導(dǎo)區(qū) 較高電位梯度 P和慢離子加速移動(dòng) P壓縮成層 mcl cl mp p mG G Cl代表氯離子 P代表蛋白質(zhì) G代表甘氨酸根離子 有效遷移率 m m為遷移率 為解離度 當(dāng)進(jìn)入pH8 8的分離膠時(shí)甘氨酸解離度增加 其有效遷移率超過蛋白質(zhì)時(shí) 不再形成高電壓 濃縮效應(yīng) 2 緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性 13 實(shí)驗(yàn)原理 考馬斯亮藍(lán)是一種染料 和蛋白質(zhì)結(jié)合呈藍(lán)色 G250用來測定蛋白質(zhì)含量 R250用來對電泳條帶染色 14 SDS PAGE 15 實(shí)驗(yàn)方法 分離膠的制備 濃縮膠的制備 加樣 待分離樣品的準(zhǔn)備 電泳 染色 脫色 16 分離膠的制備 置小燒杯中 混勻 迅速用移液器滴入二塊玻璃板之間 短玻璃朝外 凝膠加至橫板的2 3 用滴管加少許水 在室溫中聚合20 30分鐘 注意 acr bis有神經(jīng)毒 制膠時(shí)避免產(chǎn)生氣泡 17 濃縮膠的制備 將分離膠上層的水倒去 并用濾紙擦干置小燒杯中 混勻 迅速加入配制好的濃縮膠溶液至接近短玻璃的頂端 插入加樣梳 聚合30分鐘 18 加樣 樣品制備 取大腸桿菌培養(yǎng)物1ml 6000rpm離心5分鐘 棄上清 用100ul蒸餾水重懸 加25ulloadingbuffer沸水煮沸5分鐘 10000rpm離心5min 聚合后 將凝膠板取出 置于電泳槽中 短玻璃朝內(nèi) 加入電泳緩沖液 小心拔去加樣梳 用微量進(jìn)樣器吸取10ul樣品 加入凝膠的每個(gè)凹槽中 注意 加樣前先倒入電泳緩沖液 沒過短玻璃 上樣時(shí)不要扎破加樣孔 也要避免樣品溢出 19 電泳 在電泳槽中注入Tris 甘氨酸緩沖液 樣品端接負(fù)極 短玻璃的一邊 電壓控制在180V 電泳約1 1 5小時(shí) 溴酚藍(lán)距離分離膠底端1cm 20 染色和脫色 染色 電泳結(jié)束后 撬開玻璃板 將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi) 加入染色液 染色30min 脫色 染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次 再用脫色液脫色20min 更換脫色液過夜 剝膠時(shí)要小心 保持膠完好無損 21 結(jié)果觀察 Marker 第二天觀察結(jié)果 蛋白質(zhì)Marker 22 思考題 樣品為什么會(huì)在濃縮膠內(nèi)被壓縮成狹窄的一條帶 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)蛋白質(zhì)的什么性質(zhì)將其分離 23