高中生物 1.2 基因工程的基本操作程序課件 新人教版選修3.ppt

基因工程的基本操作程序 專(zhuān)題 基因工程 基因工程的基本操作程序主要包括四個(gè)基本步驟 1 目的基因的獲取2 基因表達(dá)載體的構(gòu)建3 導(dǎo)入受體細(xì)胞 得到轉(zhuǎn)基因生物4 目的基因的檢測(cè)與鑒定 無(wú)論是核基因還是質(zhì)基因 都能夠貯存 傳遞和表達(dá)遺傳信息 也都可能發(fā)生突變 從而決定生物體的性狀 原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)相同嗎 基因的結(jié)構(gòu) 非編碼區(qū) 非編碼區(qū) 編碼區(qū) 能夠轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的信使RNA 進(jìn)而指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成 也就是說(shuō)能夠編碼蛋白質(zhì) 編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 與RNA聚酶合結(jié)合位點(diǎn) 不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA 不能編碼蛋白質(zhì) 不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA 不能編碼蛋白質(zhì) 一 原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu) RNA聚合酶能夠識(shí)別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn) 并與其結(jié)合 轉(zhuǎn)錄開(kāi)始后 RNA聚合酶沿DNA分子移動(dòng) 并與DNA分子的一條鏈為模板合成RNA 轉(zhuǎn)錄完畢后 RNA鏈釋放出來(lái) 緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來(lái) 編碼區(qū) 非編碼區(qū) 非編碼區(qū) 與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn) 內(nèi)含子 外顯子 能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子 不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA 不能編碼蛋白質(zhì) 不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA 不能編碼蛋白質(zhì) 編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 二 真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu) 原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較 外顯子和內(nèi)含子 真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)的主要特點(diǎn) 編碼區(qū)是間隔的 不連續(xù)的 外顯子在編碼區(qū)能夠編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子在編碼區(qū)不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列真核細(xì)胞中 外顯子和內(nèi)含子數(shù)目不同 增強(qiáng)子 啟動(dòng)子 終止子 啟動(dòng)子 指RNA聚合酶識(shí)別 結(jié)合和開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列 增強(qiáng)子 是增強(qiáng)真核基因轉(zhuǎn)錄的一類(lèi)調(diào)節(jié)序列 終止子 提供轉(zhuǎn)錄停止信號(hào)的DNA序列 步驟一 目的基因的獲取 目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因 獲取目的基因是實(shí)施基因工程的第一步 主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因 如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因 還有植物的抗病 抗病毒 抗細(xì)菌 基因 種子貯藏蛋白的基因 以及人的胰島素基因 干擾素基因等 獲取目的基因的方法 從基因文庫(kù)中獲取目的基因利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因用DNA合成儀人工合成 基因較小 核苷酸序列已知 鳥(niǎo)槍法逆轉(zhuǎn)錄法 1 鳥(niǎo)槍法 散彈射擊法 用限制酶將供體細(xì)胞中DNA切成許多片段 將這些片段分別載入運(yùn)載體 然后通過(guò)運(yùn)載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞 讓供體細(xì)胞提供的外源DNA的所有片段分別在各個(gè)受體細(xì)胞中大量復(fù)制 即擴(kuò)增 從中找出含有目的基因的細(xì)胞 再利用一定的方法將目的基因的DNA片段分離出來(lái) 2 反轉(zhuǎn)錄法 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板 反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA 然后在酶的作用下合成雙鏈DNA 從而獲得所需的基因 目的基因的mRNA 單鏈DNA cDNA 雙鏈DNA 即目的基因 反轉(zhuǎn)錄 合成 從基因文庫(kù)中獲取目的基因 基因文庫(kù) 將含有某種生物不同基因的許多DNA片段 導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存 各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因 稱(chēng)為基因文庫(kù) genelibrary 基因組文庫(kù) 基因文庫(kù)中包含了一種生物所有的基因 這種基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù) 部分基因文庫(kù) 基因文庫(kù)中包含了一種生物的一部分基因 這種基因文庫(kù)叫做部分基因文庫(kù) 如 cDNA文庫(kù) cDNA文庫(kù)用某種生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA反轉(zhuǎn)錄 逆轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)生的多種互補(bǔ)DNA片段 與載體連接后儲(chǔ)存在一個(gè)受體菌群中 這個(gè)受體菌群就叫做這種生物的cDNA文庫(kù) 3 用DNA合成儀人工合成 根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列 推測(cè)出相應(yīng)的信使RNA序列 然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則 推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列 再通過(guò)化學(xué)方法 以單核苷酸為原料合成目的基因 蛋白質(zhì)的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列 推測(cè) 推測(cè) 目的基因 化學(xué)合成 上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點(diǎn) 操作簡(jiǎn)便廣泛使用 工作量大 盲目 分離出來(lái)的有時(shí)并非一個(gè)基因 專(zhuān)一性強(qiáng) 操作過(guò)程麻煩 mRNA很不穩(wěn)定 要求的技術(shù)條件較高 專(zhuān)一性最強(qiáng) 僅限于合成已知且核苷酸對(duì)較少的簡(jiǎn)單基因 PCR技術(shù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) DNA引物 熱穩(wěn)定DNA聚合酶 Taq酶 PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因?yàn)槭裁匆尤胍?引物是什么成分 DNA聚合酶只能催化形成脫氧核苷酸與已有的核苷酸鏈之間的磷酸二酯鍵 而RNA聚合酶不同 只要有DNA模板存在 就可以在其上合成新的RNA鏈 所以DNA復(fù)制需要模板 細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制時(shí) 引物往往為小段RNA 但PCR技術(shù)擴(kuò)增基因時(shí)引物為小段DNA 概念 PCR全稱(chēng)為 是一項(xiàng)在生物 復(fù)制 的核酸合成技術(shù) 條件 等 原理 方式 以 方式擴(kuò)增 即 n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù) 結(jié)果 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 體外 特定DNA片段 DNA復(fù)制 四種脫氧核苷酸 引物 DNA聚合酶 指數(shù) 2n 使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增 要有一段已知目的基因的核苷酸序列 前提條件 過(guò)程 a DNA變性 90 95 雙鏈DNA模板在熱作用下 斷裂 形成 b 退火 復(fù)性55 65 系統(tǒng)溫度降低 引物與DNA模板結(jié)合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 合成與模板互補(bǔ)的 氫鍵 單鏈DNA 雙鏈 DNA鏈 二 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 基因工程的核心 基因重組 1 目的 所需物質(zhì) 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在 并且可以遺傳給下一代 同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用 它們各自的作用是什么 2 基因表達(dá)載體的組成 復(fù)制原點(diǎn) 目的基因 啟動(dòng)子 終止子 標(biāo)記基因 它們各自的作用是什么 啟動(dòng)子 位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷 它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位 有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA 最終獲得蛋白質(zhì)終止子 位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷 能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因 從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái) 載體與表達(dá)載體的區(qū)別 二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段 表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因 啟動(dòng)子 終止子三部分結(jié)構(gòu) 用到的工具酶 既用到限制酶切割載體 又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接 兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵 啟動(dòng)子 終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少 目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞 必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去 注意 三將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 一 轉(zhuǎn)化 二 方法 將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞 將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞 將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管通道法 顯微注射法 感受態(tài)細(xì)胞 目的基因進(jìn)入 內(nèi) 并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持 和 的過(guò)程 受體細(xì)胞 穩(wěn)定 表達(dá) 1 將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法 1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點(diǎn) 易感染雙子葉植物和裸子植物 對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力 原理 Ti質(zhì)粒上的T DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞 并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上 過(guò)程 優(yōu)點(diǎn) 基因槍法 微彈轟擊法 單子葉植物常用 花粉管通道法是我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的一種方法 花粉管通道法就是在植物授粉后 花粉形成的花粉管還未愈合前剪去柱頭 然后 滴加DNA 含目的基因 使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞 我國(guó)目前推廣面積最大的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉就是用花粉管通道法培育出來(lái)的 該法的最大優(yōu)點(diǎn)是不依賴(lài)組織培養(yǎng)人工再生植株 技術(shù)簡(jiǎn)單 不需要裝備精良的實(shí)驗(yàn)室 常規(guī)育種工作者易于掌握 2 將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞 方法 顯微注射法 程序 目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷?受精卵 顯微注射受精卵新性狀動(dòng)物 3 將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞原核生物 特點(diǎn) 繁殖快 單細(xì)胞 遺傳物質(zhì)少 大腸桿菌細(xì)胞最常用的轉(zhuǎn)化方法是 首先用Ca2 處理細(xì)胞 以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性 使細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài) 這種細(xì)胞稱(chēng)為感受態(tài)細(xì)胞 第二步是將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合 在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子 完成轉(zhuǎn)化過(guò)程 第三步目的基因在受體細(xì)胞內(nèi) 隨其繁殖而復(fù)制 由于細(xì)菌繁殖的速度非?？?在很短的時(shí)間內(nèi)就能獲得大量的目的基因 四 目的基因的檢測(cè)與鑒定 檢查是否成功 檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞 一 檢測(cè) 1 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA 用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記 以此做探針 使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交 若顯示出雜交帶 表明染色體已插入染色體DNA中 1 方法 DNA分子雜交 2 過(guò)程 歸納步驟 二 鑒定 個(gè)體生物學(xué)水平 2 檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA 3 檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) 抗蟲(chóng)鑒定 抗病鑒定 活性鑒定等 方法 分子雜交 方法 抗原抗體雜交 過(guò)程 用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交 若出現(xiàn)雜交帶 表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA 不能 受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀 才能說(shuō)明目的基因完成了表達(dá) 受體細(xì)胞攝入DNA分子后就說(shuō)明目的基因完成了表達(dá)嗎 個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定 若不能表達(dá) 要對(duì)抗蟲(chóng)基因再進(jìn)行修飾 練習(xí)1 2008理綜山東卷 為擴(kuò)大可耕地面積 增加糧食產(chǎn)量 黃河三角洲等鹽堿地的開(kāi)發(fā)利用備受關(guān)注 我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系 1 獲得耐鹽基因后 構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的處 DNA連接酶作用于處 填 a 或 b 練習(xí)1 2008理綜山東卷 為擴(kuò)大可耕地面積 增加糧食產(chǎn)量 黃河三角洲等鹽堿地的開(kāi)發(fā)利用備受關(guān)注 我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系 2 將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和法 3 由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用技術(shù) 該技術(shù)的核心是和 4 為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功 既要用放射性同位素標(biāo)記的作探針進(jìn)行分子雜交檢測(cè) 又要用方法從個(gè)體水平鑒定水稻植株的耐鹽性 答案 1 aa 2 基因槍法 花粉管通道法 3 植物組織培養(yǎng) 1分 脫分化 去分化 再分化 4 耐鹽基因 目的基因 一定濃度鹽水澆灌 移栽到鹽堿地中