微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強度測定 umu法征求意見稿編制說明

1微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強度測定 umu 法國家標(biāo)準(zhǔn)編制說明（征求意見稿）一、 任務(wù)來源本國家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會 2017 年第三批國家標(biāo)準(zhǔn)制修訂計劃，項目編號“20171811-T-424 ”。該標(biāo)準(zhǔn)由由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口，由 清華大學(xué)等單位承擔(dān)該標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)。二、目的和意義基于 SOS 響應(yīng)系統(tǒng)國內(nèi)外開發(fā)了多種環(huán)境毒性物質(zhì)和致癌物質(zhì)的快速定量檢測方法。這些方法的原理是致癌物質(zhì)通常會引起 DNA 損傷，而細(xì)胞在發(fā)生 DNA 損傷時會誘導(dǎo) SOS 系統(tǒng)響應(yīng)。DNA 損傷程度越高，SOS 響應(yīng)越強。將 SOS 系統(tǒng)調(diào)控基因與指示基因相融合，通過檢測指示基因編碼蛋白活性或信號強度，即可得到 SOS 基因的表達(dá)強度，表征 DNA 損傷強度和環(huán)境致癌物質(zhì)濃度。具體方法有 SOS chromotest, ADP1_recA_lux, umu-test 等。其中 umu-test 因準(zhǔn)確度高被廣泛采用。國際標(biāo)準(zhǔn) ISO 13829-2000 用 umu-test 測定水及廢水的遺傳毒性。國內(nèi)還沒有類似標(biāo)準(zhǔn)出現(xiàn)?；谝陨戏N種情況，我們建立了一種快速、可靠的 DNA 損傷檢測方法同時確立了一種類似標(biāo)準(zhǔn)。三、標(biāo)準(zhǔn)制訂原則1、標(biāo)準(zhǔn)編寫遵循 GB1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第 1 部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則的有關(guān)要求。2、標(biāo)準(zhǔn)編寫內(nèi)容參考的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，包括：GB/T 20001.4-2015 標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則 第 4 部分GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法；YY/T 0588-2005 流式細(xì)胞儀ISO 13829-2000 水質(zhì) 用 UMU 試驗法測定水和廢水的遺傳毒性3、法律、法規(guī)及文件中華人民共和國標(biāo)準(zhǔn)化法中華人民共和國標(biāo)準(zhǔn)化法實施條例2國家標(biāo)準(zhǔn)化體系建設(shè)發(fā)展規(guī)劃（20162020 年） 深化標(biāo)準(zhǔn)化工作改革方案四、標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)方法屬于生物技術(shù)范疇，主要用于微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強度測定，采用方法是 umu-test 和 FACS-umu-test 法?；?umu-test 原理，選擇 -半乳糖苷酶的熒光底物，并以碘化丙啶（PI）作為檢測死細(xì)胞的熒光染料，結(jié)合流式細(xì)胞儀，構(gòu)建單個活細(xì)胞水平的胞內(nèi) DNA 損傷強度定量手段。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微生物誘變育種的術(shù)語和定義、原理、測試微生物及傳代、儀器設(shè)備及器具、化學(xué)誘變、紫外或等離子體誘變、umu-test 測試、umu-test 檢測、umu-test 結(jié)果計算和表示、umu-test 精確度、umu-test 有效準(zhǔn)則、umu-test 測試報告及 FACS-umu-test 測試程序。五、工作過程1、成立工作組微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強度測定 umu 法項目組 2016 年接到編制任務(wù)，開展資料收集、分析和試驗工作。 、2、調(diào)查研究工作首先研究了國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 13829-2000 水質(zhì) 用 UMU 試驗法測定水和廢水的遺傳毒性 （英文版） ，了解了國外 umu 試驗的相關(guān)要求。通過試驗證實了 FACS-umu-test方法中熒光底物的選擇、流式細(xì)胞儀測定胞內(nèi)熒光素含量的可行性；通過 FACS-umu-test 測試了不同誘變方法對活細(xì)胞的 DNA 損傷強度；比較了 FACS-umu-test 方法和ADP1_RecA_Lux 方法測定結(jié)果（。3、編寫過程說明為了使編制的標(biāo)準(zhǔn)能更好的適用微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強度測定，在2016 年 10 月提出了標(biāo)準(zhǔn)討論提綱，確定了編制原則和主要內(nèi)容。該標(biāo)準(zhǔn)于 2017 年 10月在全國標(biāo)準(zhǔn)信息公共服務(wù)平臺上進(jìn)行公示，于 2019 年 2 月召開專家會，聽取專家意見。六、方法驗證及結(jié)果方法驗證 1：FACS-umu-test 試驗方法的建立驗證材料：熒光素-2-D-吡喃半乳糖苷溶液，氯化氫，c(HCl)=1mol/l，氫氧化鈉 c(NaOH)=1 mol/l，二甲基亞砜(DMSO)，TGA 培養(yǎng)基，磷酸緩沖液 pH(7.0±0.2)，3鄰硝基-D-半乳糖苷溶液，碘化丙啶溶液驗證過程：熒光底物的選擇：熒光素 2-D-吡喃半乳糖苷（Fluorescein di-beta-D-galactopyranoside, FDG）本身不具有熒光，其被 -半乳糖苷酶水解后的產(chǎn)物熒光素具有熒光。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種 DNA 熒光染料，只能進(jìn)入失去細(xì)胞膜選擇通透性的細(xì)胞，即死細(xì)胞中，因此可以用于區(qū)分活死細(xì)胞。通過在 2 mM 的FDG 中，37 水浴中處理 2 min，使得 FDG 快速、均一的進(jìn)入每個細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞的FDG 被 -半乳糖苷酶水解產(chǎn)生熒光素，在一定時間內(nèi)測定，熒光素的濃度和 -半乳糖苷酶活性成正比。但是由于流式細(xì)胞儀只能測定胞內(nèi)的熒光物質(zhì)，因此最主要的問題是如何保證產(chǎn)生的熒光素不泄露到胞外。前期研究表明，在 5 下，熒光素的跨膜速率比 37 降低 200 倍以上，而 -半乳糖苷酶的反應(yīng)速率只降低了 10 倍。為驗證低溫對防止熒光素泄露的作用，測定原始菌株和 ARTP 處理 1 min 的菌株在冰上反應(yīng)和 37 條件下反應(yīng)，產(chǎn)生的熒光素的泄露程度。取反應(yīng)不同時間兩種溫度條件下的菌液，利用 0.22 m 的過濾膜過濾菌體，利用熒光分光光度計測定胞外熒光素濃度。圖 1.在冰上和 37 條件下胞外熒光素的濃度隨反應(yīng)時間變化（n=3）驗證結(jié)果：如圖 1 顯示，冰上反應(yīng)，在反應(yīng)時間增加到 90 min 時，胞外的熒光素濃度仍保持在很低水平。而 37 條件下反應(yīng)，胞外熒光素濃度隨反應(yīng)時間增加而不斷增大，說明隨熒光素在胞內(nèi)產(chǎn)生，不斷泄露到胞外。以上結(jié)果說明，冰上反應(yīng)能有效的防止熒光素的泄露。方法驗證 2：流式細(xì)胞儀測定胞內(nèi)熒光素含量驗證過程：利用流式細(xì)胞儀測定胞內(nèi)熒光素含量，首先通過前向角散射光 FSC 和側(cè)向角散射光 SSC 圈出目標(biāo)菌體。前向角散射光與細(xì)胞相對大小有關(guān)，前向角散射光4設(shè)為線性，前向角散射光太大，有可能是由于多個細(xì)胞粘連在一起，前向角散射光過小，有可能是細(xì)胞碎片或者雜質(zhì)，因此都需要在測定中去除。設(shè)置 FSC 的閾值為100，以去除雜質(zhì)的影響。通過畫門圈出目標(biāo)細(xì)胞，以去除多細(xì)胞粘連對結(jié)果的影響，如圖 2 所示。對圈出細(xì)胞進(jìn)行分析。首先只用 PI 染色，測定 FL-1 通道和 FL-3 通道的熒光值，在 FL-1 坐標(biāo)軸上圈出 PI 染色細(xì)胞，其 FL-1 通道熒光值較低，作為 FL-1 通道背景值（圖 3a） 。 4圖 2 流式細(xì)胞儀目標(biāo)細(xì)胞的劃定驗證結(jié)果：通過測定 FDG 染色的細(xì)胞，作為 FL-3 通道的背景值，即 PI 染色陰性細(xì)胞（圖 3b） 。對 FDG 和 PI 染色細(xì)胞進(jìn)行測定，如圖 4 所示。測定結(jié)果分為 4 個區(qū)域，其中 R1 和 R2 為死細(xì)胞，R3 為熒光素?zé)晒獗尘爸?，可能為雜質(zhì)或不具有 -半乳糖苷酶活性的細(xì)胞，予以扣除。R4 為目標(biāo)細(xì)胞群，用于后續(xù)分析。如圖 4 所示，R4中的每一個點的橫坐標(biāo)，即 FL-1 通道的熒光值，表示單個活細(xì)胞內(nèi)，在反應(yīng) 60 min后的相對熒光素?zé)晒庵?。相對熒光素?zé)晒庵蹬c體內(nèi)的 -半乳糖苷酶活性成正比，- 半乳糖苷酶活性表征了細(xì)胞的 SOS 誘導(dǎo)水平。利用流式細(xì)胞儀的 Cell Quest 分析可以得到突變庫所有活細(xì)胞的相對熒光素?zé)晒庵档钠骄?，而突變庫?SOS 誘導(dǎo)系數(shù)定義為Fi。=/ 其中 Am 為突變庫中所有活細(xì)胞的平均相對熒光素?zé)晒庵担?Amc 為原始細(xì)胞或5陰性對照的活細(xì)胞的平均相對熒光素?zé)晒庵?。通過定義突變庫的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù) Fi，可以對不同突變庫的 SOS 誘導(dǎo)水平進(jìn)行比較。Fi 值越高表示突變庫的 DNA 損傷強度越大。6圖 3.3 流式細(xì)胞儀 FL1-H 和 FL3-H 陰性細(xì)胞的劃分FL1-HFL3-H圖 4.流式細(xì)胞儀測定結(jié)果（R1，R2 ，PI 陽性細(xì)胞，為死細(xì)胞；R3，熒光素陰性細(xì)胞，未表達(dá) -半乳糖苷酶活性；R4，目標(biāo)細(xì)胞群，具有 -半乳糖苷酶活性的活細(xì)胞）方法驗證 3：FACS-umu-test 定量檢測不同誘變方法對活細(xì)胞的 DNA 損傷強度驗證材料：熒光素-2-D-吡喃半乳糖苷溶液，氯化氫，c(HCl)=1mol/l，氫氧化鈉c(NaOH)=1 mol/l，二甲基亞砜(DMSO)，TGA 培養(yǎng)基，磷酸緩沖液 pH(7.0±0.2)，鄰硝基-D- 半乳糖苷溶液，碘化丙啶溶液方法驗證 2.1：定量表征 ARTP 對活細(xì)胞的 DNA 損傷強度7驗證過程：常壓室溫等離子體（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）作為一種新興的誘變手段，具有操作快速、簡單，安全，突變率高等優(yōu)勢，目前已經(jīng)被成功應(yīng)用于包括細(xì)菌，真菌，藻類在內(nèi)超過 40 種微生物的誘變育種。用 FACS-umu-test 方法定量測定單位活細(xì)胞誘導(dǎo)系數(shù)隨 ARTP 誘變時間的變化。圖 2.1 ARTP 處理不同時間構(gòu)建的突變庫的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)（n=3）驗證結(jié)果：不同 ARTP 處理所產(chǎn)生的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)測定結(jié)果顯示（圖 2.1） ，當(dāng)ARTP 處理時間在 30 s 到 75 s 范圍內(nèi)，隨著 ARTP 處理時間的增長，突變庫的 SOS 誘導(dǎo)水平增加，即突變庫中活細(xì)胞的胞內(nèi) DNA 損傷強度增大。當(dāng) ARTP 處理時間超過75 s 時，繼續(xù)增大 ARTP 處理時間，突變庫的 SOS 誘導(dǎo)水平增加并不明顯，SOS 誘導(dǎo)系數(shù)的最大值為 2.79 ± 0.15。方法驗證：2.2 定量檢測 UV 對活細(xì)胞的 DNA 損傷強度驗證過程：UV 照射可以造成多種 DNA 損傷，包括 DNA 與蛋白質(zhì)的交聯(lián)，氧化性 DNA 損傷以及單鏈的 DNA 斷裂損傷。FACS umu test 方法測定了 UV 照射不同時間對活細(xì)胞的 DNA 損傷強度變化，結(jié)果如圖 2.2 所示。8圖 2.2 UV 照射不同時間的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)（n=3）驗證結(jié)果：隨 UV 照射時間的增加，活細(xì)胞的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)增大，UV 造成的DNA 損傷強度增加。但 UV 構(gòu)成的突變庫的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)同樣存在最大值。在 UV 照射 13 min 時 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)最大，為 1.66±0.11，明顯低于 ARTP 的最大 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)。超過該照射時間，SOS 誘導(dǎo)系數(shù)不再增大，說明活細(xì)胞對 UV 造成的 DNA 損傷同樣存在容忍極限。方法驗證 2.3：定量檢測 4-NQO 對活細(xì)胞的 DNA 損傷強度驗證過程：4-硝基喹啉-1-氧化物（4-Nitroquinoline-N-Oxide，4-NQO）的代謝物為4-乙酰氨基喹啉-1-氧化物，該物質(zhì)可以共價加合到脫氧鳥苷酸的 C8 位和 N2 位，以及脫氧腺苷酸的 N6 位從而形成 DNA 共價加合物。另外 4-NQO 同樣能造成 DNA 的氧化損傷，或者造成 DNA 單鏈斷裂。利用基于 FACS unu-test 法定量測定了不同 4-NQO 處理劑量對 DNA 的損傷強度，如圖 2.3 所示。9圖 2.3 不同 4-NQO 劑量的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)（n=3）驗證結(jié)果：不同 4-NQO 處理劑量造成的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)變化趨勢與 ARTP，UV 相似。在低劑量下，隨劑量增加，SOS 誘導(dǎo)系數(shù)增大，當(dāng) 4-NQO 處理劑量超過 0.8 g/ml后，隨 4-NQO 濃度增加，SOS 誘導(dǎo)系數(shù)不再增大。4-NQO 的最大誘導(dǎo)系數(shù)為 1.50 ± 0.13。方法驗證 2.4：定量檢測 MNNG 對活細(xì)胞的 DNA 損傷強度驗證過程：N-甲基-N- 硝基-N- 亞硝基胍（N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG）主要造成 DNA 的甲基化損傷，可以使 DNA 上的所有氧原子和大部分的氮原子發(fā)生甲基化。最主要的甲基化產(chǎn)物為 N7 甲基鳥嘌呤，甲基磷酸三酯， O6 甲基鳥嘌呤和 N3 甲基腺嘌呤。MNNG 不直接造成 DNA 的斷裂損傷，但通過堿基切除修復(fù)和核苷酸切除修復(fù)會造成 DNA 的鏈斷裂。利用基于 FACS-unu-test 法定量測定了不同 MNNG誘變劑濃度對單個活細(xì)胞的 DNA 損傷強度（圖 2.4） 。10圖 B.4 不同 MNNG 劑量的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)（n=3）驗證結(jié)果：如圖 2.4 所示，隨 MNNG 濃度的增加，SOS 誘導(dǎo)系數(shù)呈現(xiàn)了與前三種誘變方法相同的趨勢。MNNG 造成 DNA 損傷引起的最大 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)值為 1.58 ± 0.07。驗證結(jié)果 2.5：不同誘變方法的活細(xì)胞內(nèi) DNA 損傷的比較驗證過程：通過測定 ARTP，紫外照射，兩種常用化學(xué)誘變劑 4-NQO 和 MNNG的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)，可以看出不同誘變劑量下引起的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)均存在最大值，達(dá)到該最大值后繼續(xù)增加誘變劑量，SOS 誘導(dǎo)系數(shù)不再增加。對于不同的誘變方法，SOS誘導(dǎo)系數(shù)的最大值也不同，ARTP 的最大 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)高于其他三種誘變方法(圖 2.5)。11圖 2.5 不同誘變方法的最大 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)（n=3）驗證結(jié)果：將對照樣品的平均胞內(nèi)熒光素相對熒光強度設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)值，統(tǒng)計了各種突變方法在最大 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)的誘變劑量下，構(gòu)成的突變庫中相對熒光強度高于該標(biāo)準(zhǔn)值的細(xì)胞的比例。ARTP，UV，4-NQO 和 MNNG 四種誘變方法分別為 35%， 26%， 17%，和 16.5%。 方法驗證 3.：FACS-umu-test 方法與 ADP1_RecA_Lux 方法測定結(jié)果的比較驗證材料：熒光素-2-D-吡喃半乳糖苷溶液，氯化氫，c(HCl)=1mol/l，氫氧化鈉 c(NaOH)=1 mol/l，二甲基亞砜(DMSO)，TGA 培養(yǎng)基，磷酸緩沖液 pH(7.0±0.2)，鄰硝基-D-半乳糖苷溶液，碘化丙啶溶液驗證過程：ADP1_RecA_Lux 是一種常用的 DNA 毒性檢測方法，該檢測方法使用Acinetobacterbaylyi ADP1 作為模式菌株，來自 Photorhabdus luminescens 的生物發(fā)光基因 luxCDABE 作為報告基因，將其與 SOS 系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)基因 recA 進(jìn)行融合，導(dǎo)入到Acinetobacterbaylyi ADP1 的基因組。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生 DNA 損傷時，誘導(dǎo) SOS 系統(tǒng)的響應(yīng)，recA 表達(dá)，其表達(dá)強度可以通過生物發(fā)光信號進(jìn)行檢測。相對發(fā)光強度定義為光強度除以細(xì)胞的光密度（OD 600） ，誘導(dǎo)系數(shù) Fi 定義為樣品的相對發(fā)光強度除以沒有毒性處理的對照樣品的相對生物發(fā)光強度。將 ADP1_RecA_Lux 方法應(yīng)用于檢測 ARTP 對DNA 的損傷強度。驗證結(jié)果：ADP1_RecA_Lux 方法對 ARTP 不同時間的 DNA 損傷結(jié)果顯示（圖3.1） ，在 ARTP 處理時間不高于 90 s 時，隨著處理時間的增長，樣品中總細(xì)胞的 SOS12誘導(dǎo)系數(shù)增加，ARTP 對 DNA 損傷強度增大。當(dāng) ARTP 處理時間增加到 105 s 時，樣品中總細(xì)胞的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)反而降低，而用流式細(xì)胞儀的測定結(jié)果顯示，ARTP 處理時間為 105 s 時，其對胞內(nèi) DNA 的損傷程度持續(xù)增高達(dá)到最大值。兩種測定方法結(jié)果的差異主要是由于采用流式細(xì)胞儀的方法，我們檢測的是突變庫中活細(xì)胞的 DNA 損傷，而 ADP1_RecA_Lux 方法我們檢測的是樣品中總細(xì)胞的DNA 損傷，包括活細(xì)胞和由于 ARTP 處理而造成死亡的細(xì)胞。這些死細(xì)胞在細(xì)胞密度測量時同樣有貢獻(xiàn)。當(dāng) ARTP 處理時間低于 90 s 時，ARTP 作用劑量較低，對菌體的致死率低，因此少量的死細(xì)胞對細(xì)胞密度測定結(jié)果影響不大。而當(dāng) ARTP 處理時間達(dá)到 105 s 時，ARTP 對細(xì)胞的致死率升高，大量的死細(xì)胞對細(xì)胞的光密度測定影響較大，而死細(xì)胞通常具有較低的發(fā)光強度，因此造成相對發(fā)光強度的下降，影響 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)的測定結(jié)果。而基于 unu-test 的流式細(xì)胞儀測定方法，通過 PI 染色可以排除死細(xì)胞的影響。圖 3.1 ARTP 處理后 3 h 和 6h 用 ADP1_RecA_Lux 方法檢測 ARTP 處理不同時間的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)（n=3 ）采用 ADP1_RecA_Lux 方法檢測得到的最大 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)值為 1.49 ± 0.25，低于基于 unu-test 的流式細(xì)胞儀測定結(jié)果。這主要是由于 ADP1_RecA_Lux 方法中選用 recA作為 SOS 響應(yīng)檢測基因， recA 編碼的蛋白作為 DNA 同源重組的重要相關(guān)蛋白，其在SOS 未誘導(dǎo)的菌體中具有較高的含量，導(dǎo)致 ADP1_RecA_Lux 測定方法的背景值較高。而隨著 ARTP 處理時間的增加，死細(xì)胞的增多導(dǎo)致相對發(fā)光強度的進(jìn)一步降低，因此造成了采用 ADP1_RecA_Lux 方法測得的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)較流式細(xì)胞儀方法低。七、與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強制性國家標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系13本標(biāo)準(zhǔn)符合國家現(xiàn)行法律、法規(guī)、規(guī)章和強制性國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。本標(biāo)準(zhǔn)的實施不涉及對現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的廢止情況。八、標(biāo)準(zhǔn)屬性的建議本標(biāo)準(zhǔn)為推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)。九、貫徹國家標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布實施后，建議由標(biāo)準(zhǔn)編制單位組織有關(guān)生產(chǎn)、檢驗、設(shè)計等單位進(jìn)行宣傳貫徹。十、其他應(yīng)予說明的事項無其他事項說明。