《發(fā)酵工程》第3章培養(yǎng)基的制備與滅菌

第三章培養(yǎng)基的制備教學(xué)內(nèi)容（4學(xué)時(shí)）：了解培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，掌握培養(yǎng)基的類型和用途了解發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇，了解原料轉(zhuǎn)換的意義O了解淀粉水解糖的制備方法O了解生物合成的前體物質(zhì)及促進(jìn)劑第一節(jié)培養(yǎng)基的原材料 培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分 培養(yǎng)基的類型 發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇 原料轉(zhuǎn)換及意義一、培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分及用途碳酸氣淀粉水解糖、糖蜜、亞硫酸鹽紙漿廢液等石油、正構(gòu)石蠟、天然氣醋酸、甲醇、乙醇等石油化工產(chǎn)品功能：提供能量、構(gòu)成菌體、代謝產(chǎn)物的物質(zhì)基礎(chǔ);'有機(jī)氮：黃豆餅粉、花生餅粉、玉米漿、蛋白膿、酵母粉、魚粉、發(fā)酵菌絲體、酒糟水等無機(jī)氮：尿素、硫酸銹、氨水、硝酸鹽功能：構(gòu)成菌體、含氮代謝物；磷酸鹽、鉀鹽、鈣鹽等礦物鹽3.無機(jī)鹽鐵、猛、鉆等微量元素功能：構(gòu)成菌體，參與酶的組成，維持酶活性,調(diào)節(jié)滲透壓，調(diào)節(jié)pH值，維持氧化還原電位;4.特殊生長因子：硫胺素、生物素、對(duì)氨基苯甲功能：酶的輔助部分，維持生命活動(dòng);5.發(fā)酵的促進(jìn)劑與抑制劑發(fā)酵培養(yǎng)基中某些成分的加入有利于調(diào)節(jié)產(chǎn)物的形成，而并不促進(jìn)微生物的生長，這些物質(zhì)包括前體、促進(jìn)劑和抑制劑1）、前體：指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)沒有多大的變化，但產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。如：在青霉素生產(chǎn)中加入玉米漿，青霉素產(chǎn)量可從20u/mL增加到100u/mL,研究發(fā)現(xiàn)玉米漿中的苯乙胺被有限結(jié)合到育霉素分子中，從而提高了青霉素G的產(chǎn)量。半胱氨酸側(cè)鏈母核6APA 3）、抑制劑：在發(fā)酵過程中加入抑制劑會(huì)抑制某些代謝途徑的進(jìn)行，同時(shí)會(huì)使另外一些代謝途徑活躍,從而獲得人們所需要的某種產(chǎn)物或使正常代謝的某一代謝中間物積累起來。 例如：微生物發(fā)酵生產(chǎn)甘油中，例如亞硫酸氫鈉，它與代謝過程中的乙醛生成加成物。 6.水分功能：生化反應(yīng)均在水溶液中進(jìn)行二、培養(yǎng)基的類型 1.依營養(yǎng)物質(zhì)的來源分類 天然培養(yǎng)基； 合成培養(yǎng)基，也稱組合培養(yǎng)基（多用于定量研究）： 半合成培養(yǎng)基，（用的最多，在部分天然有機(jī)碳源、氮源、生長因子的基礎(chǔ)上，適當(dāng)加入一些化學(xué)藥品）； 2.依培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來分： 1）固體培養(yǎng)基 A、凝固培養(yǎng)基：即遇熱可融化，冷卻后則凝固的固體培養(yǎng)基 B、非可逆性凝固培養(yǎng)基：指有血清凝固成的固體培養(yǎng)基或由無機(jī)硅膠配成的凝固后即不能再融化的固體培養(yǎng)基 C、天然固體培養(yǎng)基：由天然固體狀基質(zhì)直接制成的培養(yǎng)基，如數(shù)皮，米糠，木屑等 D、濾膜：是一一種堅(jiān)韌且?guī)в袩o數(shù)微孔的醋酸纖維湖膜，把它制成圓片狀覆蓋在營養(yǎng)瓊脂或浸有培養(yǎng)液的纖維襯墊上，形成了具有固體培養(yǎng)基性質(zhì)的培養(yǎng)條件。2）半固體培養(yǎng)基再配置號(hào)的液體培養(yǎng)基中加入0.5%左右的瓊脂作為凝固劑，形成的培養(yǎng)基稱之微半固體培養(yǎng)基。主要用于菌種鑒定，觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)特征及噬菌體的效價(jià)測(cè)定等3）液體培養(yǎng)基；培養(yǎng)基中8090%是水。 3.依培養(yǎng)基的用途來分 1）、池子培養(yǎng)基 2）、種子培養(yǎng)基 3）、發(fā)醉培養(yǎng)基 4）、補(bǔ)料培養(yǎng)基 5）、加富培養(yǎng)基 6）、選擇培養(yǎng)基 7）、鑒別培養(yǎng)基 8）、增殖和保存培養(yǎng)基 9）、富集培養(yǎng)基 10）、測(cè)定培養(yǎng)基三、發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇 一）、配置培養(yǎng)基的原則 1、根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配置不同的培養(yǎng)基 2、注意各營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和配匕 3、調(diào)節(jié)適宜的物理化學(xué)條件 4、根據(jù)培養(yǎng)微生物的FI的配置 5、盡量使用廉價(jià)易得的原料二）、配置培養(yǎng)基的方法 1、生態(tài)模擬 2、查閱文獻(xiàn) 3、借助優(yōu)選法或正交試驗(yàn)法精心設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方 4、實(shí)驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)的規(guī)模-般由定性到定量，由小到大。發(fā)酵培養(yǎng)基的用途與要求、成分、配比經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定，配制時(shí)兼顧原料來源、成本及工藝管理；發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇程序門要了解生產(chǎn)菌種的來源、生活習(xí)慣、生理生化特性和一般的營養(yǎng)要求；»對(duì)生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)條件，生物合成的代謝途徑，代謝產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、一般提煉方法和產(chǎn)品質(zhì)量要求等要有所了解3應(yīng)先以合成培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，先進(jìn)行推瓶試驗(yàn)，再進(jìn)行小型發(fā)醉罐培養(yǎng)，探索此生產(chǎn)菌種對(duì)各種主要有機(jī)碳源和氮源的利用情況和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的能力要注意培養(yǎng)過程中的pH值變化，比較適于菌體生長繁殖和適合于代謝產(chǎn)物形成的pH值差異，不斷調(diào)整在初步研究的基礎(chǔ)之上，先確立一個(gè)培養(yǎng)基配比；再進(jìn)行各種重要的金屬和非金屬離子的影響試驗(yàn)，試驗(yàn)各種無機(jī)鹽的最高、最低和最合的用量在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)基試驗(yàn)，探討各種發(fā)酵條件和培養(yǎng)基的關(guān)系。如培養(yǎng)過程中的pH值變化與培養(yǎng)法各種組成的關(guān)系。I、原料轉(zhuǎn)換及意義1、節(jié)約原料，減低單耗，提高發(fā)酵單位和總收率；2、開拓新的原料資源和微生物資源：野生植物淀粉、植物纖維、木屑水解物、石蠟、醋酸、乙醇日本1959年開始研究由醋酸發(fā)酵生成谷氨酸的工藝，并于1968年由味之索公司設(shè)廠制造，為發(fā)酵法制造谷氨酸由“糧食發(fā)酵”轉(zhuǎn)入“無糧發(fā)酵”奠定了基礎(chǔ)。谷氨酸發(fā)酵原料：最初用葡萄糖，以后改用淀粉水解糖液或普粉水解糖液，產(chǎn)糖地區(qū)則采用價(jià)格低廉的糖蜜為原料隨著石油化工的發(fā)展，合成醋酸和乙醇的產(chǎn)量逐年增加，醋酸和乙醇作為一種新型發(fā)酵原料,越來越受到重視。近年來，國外乙醛代糧發(fā)酵的研究取得了重大進(jìn)展，除抗生素外，幾乎所有用糧食發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)品，如氨基酸、有機(jī)酸、酶制劑、單細(xì)胞蛋白、糖類、脂肪、維生素、核酸類物質(zhì)等，都可以用乙醇為碳源發(fā)酵生產(chǎn)。第二節(jié)淀粉水解糖的制備 一、淀粉水解糖的制備方法 1、酸解法： 定義：以酸（無機(jī)酸或有機(jī)酸）為催化劑，在高溫高壓下將淀粉水解為葡萄糖的方法. 優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備要求簡單，水解時(shí)間短（20min）,設(shè)備生產(chǎn)能力大 缺點(diǎn)：高溫高壓下進(jìn)行，設(shè)備要求耐腐蝕、耐高溫、耐高壓，副反應(yīng)多，對(duì)原料要求嚴(yán)格，淀粉顆粒不宜過大，淀粉乳濃度不能過高。 2、酶解法：（雙酶水解法） 定義：用淀粉酶將淀粉水解為葡萄糖的過程。一般分為兩步：第一步是利用a淀粉酶將淀粉液化轉(zhuǎn)為糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，這個(gè)過程稱為液化。第二步是利用糖化酶將糊精或低聚糖進(jìn)一步水解，轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟堑倪^程，稱為糖化。也稱雙酶法a淀粉隨（液化）葡萄糖淀粉酶（糖化）優(yōu)點(diǎn)：1、反應(yīng)條件溫和。2、酶的專一性強(qiáng)，副反應(yīng)少3、可在較高的淀粉乳濃度下水解4、糖液的營養(yǎng)物質(zhì)豐富5、糖液色澤淺，無苦味，有利于糖液的精制缺點(diǎn)：時(shí)間長（2-3）天，要求的設(shè)備多，糖液過濾困難。酶結(jié)合法酸醯法酣酸法1）酸酶法 事先將淀粉酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酣將其水解為葡萄糖 玉米、小麥等谷類淀粉，淀粉顆粒堅(jiān)實(shí)，如用。一淀粉酶在短時(shí)間內(nèi)液化往往不徹底。 酸液化速度快，且糖化是由酶來進(jìn)行的，對(duì)液化液要求不高，可采用較高的淀粉乳濃度，提高生產(chǎn)效率。用酸量較少，產(chǎn)品顏色淺，糖液質(zhì)量高。2）酶酸法 先用Q淀粉酶液化到一定程度，然后用酸水解成葡萄糖 有些原料（如碎米淀粉），顆粒大小不一，酸法水解不均勻，出糖率低，故采用先經(jīng)淀粉酶液化，過濾除雜質(zhì)后再酸水解 能采用粗原料淀粉，淀粉濃度較酸法高，生產(chǎn)較易控制，時(shí)間短。而且酸水解pH稍高，可減少副產(chǎn)物的形成，糖液色澤較淺。表2-2不同糖化工藝糖化質(zhì)量比較二、淀粉酸水解理論基礎(chǔ) 淀粉水解成葡萄糖的反應(yīng)過程中同時(shí)發(fā)生著：水解反應(yīng)、復(fù)合反應(yīng)、分解反應(yīng)；其中水解反應(yīng)是主要的。 復(fù)合反應(yīng)：葡萄糖分子問經(jīng)16糖苜鍵結(jié)合成龍膽二糖（有苦味）、異麥芽糖和其他低聚糖（合稱復(fù)合低聚糖）。 分解反應(yīng)：葡萄糖O羥甲基糠醛仃機(jī)酸、色素等淀粉的水解反應(yīng)2、淀粉酸水解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)屬于單分子一級(jí)反應(yīng)de1類型：=K9CK：反應(yīng)速度常數(shù)，出由反應(yīng)條件（如溫度、酸度等）而定C:淀粉濃度de一了濃度對(duì)時(shí)間求導(dǎo)，濃度的降低 3、影響酸水解的因素 酸的種類 主要因素濃度（酸的濃度、淀粉的濃度）水解溫度 （二）、葡萄糖的復(fù)合反應(yīng)及其影響因素 復(fù)合反應(yīng)：在淀粉的酸糖化過程中，水解生成的葡萄糖受酸和熱的影響，葡萄糖分子之間通過糖昔鍵相聚合，生成二糖、三糖及其他低聚糖。2.、酸的影響:（三）葡萄糖的分解反應(yīng)及其影響因素 葡萄糖羥甲基糠醛二乙酰丙酸、蟻酸、有色素物質(zhì)； 影響因素：濃度、溫度、pH值;第三節(jié)糖蜜前處理一、糖蜜的來源與特點(diǎn)糖蜜的干物質(zhì)濃度很高，約8090Bx,含糖量在50%以上，另含5%12%的膠體物質(zhì)和10%12%灰分，此外產(chǎn)酸細(xì)菌多，某些糖蜜還含有較多的生物素。如不進(jìn)行預(yù)處理，則微生物難于生長和發(fā)酵。近年來，由于制糖技術(shù)提高，糖蜜中糖的含量大大降低，可發(fā)酯性糖減少，非發(fā)醉性糖增加，膠體物質(zhì)和灰分也顯著增加，因此，糖蜜發(fā)醉前必須進(jìn)行預(yù)處理。一、糖蜜的來源與特點(diǎn)二、糖蜜前處理的方法1、加酸通風(fēng)沉淀法（冷酸通風(fēng)處理法）：糖蜜加水稀釋到500Bx=加入0.20.3%濃硫酸，通入壓縮空氣1h靜置澄清8h,取上清液。2、加熱加酸沉淀法（熱酸通風(fēng)沉淀法）：糖蜜加水稀釋到40%=加適量硫酸調(diào)節(jié)pH值到44.5=放入澄清槽加熱至8090,通風(fēng)30min保，0808紿心時(shí)，取上清液。糖蜜稀釋至3040Bx-加硫酸調(diào)pH33.8=加熱至90添加8Ppm聚丙烯酰胺（PAM）,攪拌均勻一靜置1小時(shí)，取上清液。三、谷氨酸發(fā)酵糖蜜預(yù)處理 樹脂處理法 亞硝酸處理法 2.添加化學(xué)藥劑處理法 添加青霉素法 添加表面活性劑 添加抗氧劑法 3,追加糖蜜法 4.營養(yǎng)缺陷型變異株法心磷脂一 磷膈跳甘油 磷脂酰肌葬磷脂質(zhì)n 石蠟璘脂皖肌醉二甘II糖昔量氣乙二靜 十七酸鹽細(xì)胞膜細(xì)胞壁小磷酸甘油N酸二峻丙酮石蠟為碳源的磷脂合成途徑乙酰CoA（拮抗）-檸椽戰(zhàn)3 瞬酸甘油聯(lián)乙限 IIH / /ci*KG AL-GA-糖質(zhì)或18酸為碳源的磷腳合成途徑表面活性劑拮抗作用部位皿 油酸缺陷型遺傳阻礙部位=甘油缺陷我的遺傳阻礙部位細(xì)前細(xì)胞谷氨酸排出控制機(jī)制一、纖維素及發(fā)酵廢液的處理 （一）、利用纖維素廢料生產(chǎn)SCP 稻草、麥稈、玉米的莖和葉、甘蔗渣、廢紙等 流程如下：I濃縮I干燥|磨碎）|成品）酸中和濾液生產(chǎn)慟:用茵利a:面卜級(jí)種司JL一級(jí)種A»中和廢液IIk鹽酸調(diào)PH3.5P發(fā)酵1離心分離）13膂鶻.輸J粉碎J包裝）二、亞硫酸鹽廢液的處理（一）亞硫酸鹽制漿廢液生產(chǎn)酒精和蛋臼質(zhì)1、亞硫酸鹽造紙制漿廢液生產(chǎn)酒精2、亞硫酸鹽紙漿廢液發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì)3、亞硫酸鐵法非木材制漿廢液培養(yǎng)SCP（-）亞硫酸鹽廢液發(fā)醉生產(chǎn)乳酸三、木屑水解液發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸第五節(jié)培養(yǎng)基滅菌 W消毒與滅菌在發(fā)酵工業(yè)中的. 消戲：指用物理和化學(xué)方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病源微生物。一般只能殺死營養(yǎng)細(xì)胞而不能殺死細(xì)菌芽抱。 火苗：用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽泡和泡子。 消滅雜菌和防止雜菌污染 二、滅菌方法：干熱滅菌、濕熱滅菌、物理滅菌（射線、微波等）、化學(xué)滅菌（各種化學(xué)藥品）； 1、干熱滅菌法 灼燒滅菌、在電熱或紅外線在設(shè)備內(nèi)加熱主要用于保持干燥的物料、器具等紫外線、高速電子流的陰極射線、X射線和Y射線化學(xué)藥品滅菌法（1）第一大類：表面消毒劑優(yōu)點(diǎn)：1）蒸汽來源容易，操作費(fèi)用低廉，本身無毒2）蒸汽具有很強(qiáng)的穿透力，滅菌易于徹底3）蒸汽均有很大的潛熱，冷凝后的水分有利于濕熱滅菌4）蒸汽輸送可.借助本身的壓強(qiáng)，調(diào)直方便，技術(shù)管理容易缺點(diǎn)：1）設(shè)備費(fèi)用高2）不能用于怕受潮的物料滅菌 3、射線滅菌2、濕熱滅菌法借助蒸汽釋放的熱使微生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、酶和核酸分子內(nèi)部的化學(xué)鍵，特別是氫鍵受到破壞，引起不可逆的變性，使微生物死亡。高鎰酸鉀溶液：0.10.25%、漂白粉、75%的酒精、新潔爾滅和杜滅芬、甲醛37%、戊二醛、過氧乙酸、焦碳酸二乙酯、酚類