血紅蛋白的提取和分離ppt課件

課題背景 新華網(wǎng)首爾03年 月 日電韓國(guó)浦項(xiàng)工業(yè)大學(xué)科學(xué)家 日宣布 他們已查明可抑制艾滋病病毒感染的 蛋白質(zhì)核心部分的結(jié)構(gòu) 浦項(xiàng)工業(yè)大學(xué)生物科學(xué)系教授吳秉夏等人 當(dāng)天公開了 蛋白質(zhì)內(nèi)核心部分 的三維分子結(jié)構(gòu) 并稱已弄清楚這一結(jié)構(gòu)的正確位置及它與其他結(jié)構(gòu)之間的相互作用 研究成果發(fā)表在最新一期 分子細(xì)胞 雜志上 2 年英國(guó) 自然 雜志曾刊登論文說 蛋白質(zhì)可有效抑制艾滋病病毒的感染 此后 世界各地的很多科學(xué)家開始研究 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 但到目前為止尚未有人宣稱取得突破性進(jìn)展 對(duì)蛋白質(zhì)的研究有助于人們對(duì)生命過程的認(rèn)識(shí)和理解 通?？茖W(xué)研究需要獲得純度較高的蛋白質(zhì) 怎樣才能從復(fù)雜的混合物中提取和純化蛋白質(zhì)呢 1 2 本課題學(xué)習(xí)目標(biāo) 1 主要概念 凝膠色譜法 電泳法 緩沖溶液 它們?cè)谘t蛋白的提取中分別起到什么作用 主要原理 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理 電泳法分離樣品的原理 緩沖溶液的組成和作用機(jī)理 3 一 蛋白質(zhì)分離和提取的原理 一 基礎(chǔ)知識(shí) 根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異 分子的形狀 大小電荷性質(zhì)和多少溶解度吸附性質(zhì)對(duì)其他分子親和力 4 一 凝膠色譜法 分配色譜法 2 凝膠 大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物 如葡聚糖或瓊脂糖 構(gòu)成的多孔小球體 內(nèi)部有許多貫穿的通道 根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小 利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠 來進(jìn)行分離 1 概念 3 凝膠色譜法的原理 當(dāng)相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí) 相對(duì)分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道 路程較長(zhǎng) 移動(dòng)速度較慢 相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道 只能在凝膠外部移動(dòng) 路程較短 移動(dòng)速度較快 相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離 依據(jù)的特性是 蛋白質(zhì)分子量的大小 5 二 緩沖溶液 1 概念 在一定的范圍內(nèi) 凡是能夠抵制外加少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的影響使原來溶液PH值基本保持不變的混合溶液 能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液PH值的影響 維持PH基本不變 2 作用 3 緩沖溶液的配制 通常由1 2種緩沖劑溶解于水中配制而成 調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液 4 提問 在本課題中使用的緩沖液是 其目的是 利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境 保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能 便于觀察 紅色 和科學(xué)研究 活性 磷酸緩沖液 6 三 電泳 1 概念 帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過程 2 原理 許多重要的生物大分子 如多肽 核酸等都具有可解離的基團(tuán) 在一定的PH下 這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電 在電場(chǎng)的作用下 這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng) 電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小 形狀的不同 使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度 從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離 3 類型 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙稀酰胺凝膠電泳 7 知識(shí)點(diǎn)一 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理和具體過程 8 9 凝膠色譜法的原理 依據(jù)的特性是 蛋白質(zhì)分子量的大小 10 在電場(chǎng)的作用下 這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng) 知識(shí)點(diǎn)二 電泳 11 瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法 其分析原理與其他支持物電泳的最主要區(qū)別是 它兼有 分子篩 和 電泳 的雙重作用 瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu) 物質(zhì)分子通過時(shí)會(huì)受到阻力 大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大 因此在凝膠電泳中 帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量 而且還取決于分子大小 這就大大提高了分辨能力 但由于其孔徑相當(dāng)大 對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道 現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中 蛋白質(zhì)和核酸會(huì)根據(jù)pH不同帶有不同電荷 在電場(chǎng)中受力大小不同 因此跑的速度不同 根據(jù)這個(gè)原理可將其分開 1 瓊脂糖凝膠電泳 12 原理 聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 具有分子篩效應(yīng) 它有兩種形式 非變性聚丙烯酰胺凝膠及SDS 聚丙烯酰胺凝膠 SDS PAGE 非變性聚丙烯酰胺凝膠 在電泳的過程中 蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài) 并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小 蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開 SDS PAGE 僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同就可以分開蛋質(zhì)白 在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后 蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小 可以忽略電荷因素 2 聚丙烯酰胺凝膠電泳 作用原理 教材P66 13 人們用雞的紅細(xì)胞提取DNA 用哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么 雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核 含有DNA 便于進(jìn)行DNA的提取 哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞無細(xì)胞核 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單 血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白 思考 二 血紅蛋白的提取和分離 14 血液組成 注 抗凝劑常用檸檬酸鈉 15 實(shí)驗(yàn)操作 一 樣品處理 血液的組成成分 16 血紅蛋白由四個(gè)肽鏈組成 如圖 包括兩個(gè) 肽鏈和兩個(gè) 肽鏈 其中每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán) 此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分了二氧化碳 血紅蛋白因含有血紅素而呈現(xiàn)紅色 實(shí)驗(yàn)操作 一 樣品處理 17 二 實(shí)驗(yàn)操作 新鮮血液 樣品處理 粗分離 純化 純度鑒定 18 1 紅細(xì)胞的洗滌 閱讀課本內(nèi)容 回答以下問題 1 洗滌的目的 2 怎樣洗滌 3 洗滌干凈的標(biāo)志是什么 直至上清液中沒有黃色 表明紅細(xì)胞已洗滌干凈 實(shí)驗(yàn)操作 一 樣品處理 除去其中的雜蛋白 以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化 血液 檸檬酸鈉 低速短時(shí)離心 吸出上層血漿 紅細(xì)胞 5倍體積生理鹽水 緩慢攪拌10min 低速短時(shí)離心 吸出上清液 反復(fù)洗滌直至上清液無黃色 速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果 能否用蒸餾水或者高濃度的氯化鈉 19 磁力攪拌器 20 2 血紅蛋白的釋放 將洗滌好的紅細(xì)胞倒入燒杯中 加蒸餾水到原血液的體積 再加40 體積的甲苯 置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0min 在蒸餾水和甲苯的作用下 紅細(xì)胞破裂 釋放出血紅蛋白 思考 蒸餾水和甲苯的作用 實(shí)驗(yàn)操作 一 樣品處理 蒸餾水 紅細(xì)胞過度吸水破裂甲苯 溶解細(xì)胞膜 有利于提取和分離血紅蛋白 21 3 分離血紅蛋白溶液 1 采用什么方法分離血紅蛋白 2 離心分層后 各層的成分各是什么 3 用濾紙過濾 去掉什么成分 實(shí)驗(yàn)操作 一 樣品處理 紅細(xì)胞破碎混合液 中速長(zhǎng)時(shí)離心 2000c min 10min 濾紙過濾除去脂質(zhì) 分液漏斗分離出血紅蛋白 得到紅色透明液體 除去脂質(zhì)類和紅細(xì)胞破碎物沉淀層 22 取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中 將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量濃度為20mmol L的磷酸緩沖液中 pH為7 0 透析12h 4 透析 透析過程 透析目的 除去樣品中分子量較小的雜質(zhì) 透析的原理透析袋是一種半透膜 能使小分子自由進(jìn)出 而大分子不能通過 思考 根據(jù)材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 現(xiàn)有燒杯一只 透析袋一個(gè) 碘液 淀粉溶液 鐵架臺(tái)一個(gè) 棉線若干 探究碘液 淀粉是否能通過透析袋 寫出實(shí)驗(yàn)步驟和結(jié)果預(yù)測(cè) 實(shí)驗(yàn)操作 一 樣品處理 23 利用透析袋透析 24 透析過程動(dòng)畫演示 25 二 凝膠色譜操作 1 凝膠色譜柱的制作 取長(zhǎng)40厘米 內(nèi)徑1 6厘米的玻璃管 兩端需用砂紙磨平 底塞的制作 打孔 挖出凹穴 安裝移液管頭部 覆蓋尼龍網(wǎng) 再用100目尼龍紗包好 插到玻璃管的一端 注意事項(xiàng) 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面 否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng) 還會(huì)導(dǎo)致液體殘留 蛋白質(zhì)分離不徹底 頂塞的制作 打孔 安裝玻璃管 組裝 將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體 安裝其他附屬結(jié)構(gòu) 26 2 凝膠色譜柱的裝填 凝膠的選擇 A 材料 交聯(lián)葡聚糖凝膠 G 75 B 代表意義 G 表示凝膠的交聯(lián)程度 膨脹程度及分離范圍 75表示凝膠的得水值 即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7 5克 凝膠的前處理 配置凝膠懸浮液 計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水中充分溶脹后 配成凝膠懸浮液 凝膠色譜柱的裝填方法 A 固定 將色譜柱裝置固定在支架上 B 裝填 將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi) 裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱 使凝膠填裝均勻 注意裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在 因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序 降低分離效果 27 洗滌平衡 裝填完畢后 立即用緩沖液洗脫瓶 在50cm高的操作壓下 用300ml的20mmol l的磷酸緩沖液 pH為7 0 充分洗滌平衡12小時(shí) 使凝膠裝填緊密 注意 1 液面不要低于凝膠表面 否則可能有氣泡混入 影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果 2 不能發(fā)生洗脫液流干 露出凝膠顆粒的現(xiàn)象 28 3 樣品加入與洗脫 調(diào)節(jié)緩沖液面 打開下端出口 使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊 關(guān)閉出口 滴加透析樣品 吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端 滴加樣品時(shí) 吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣 同時(shí)注意不要破壞凝膠面 樣品滲入凝膠床 加樣后打開下端出口 使樣品滲入凝膠床內(nèi) 等樣品完全進(jìn)入凝膠層后 關(guān)閉下端出口 洗脫 小心加入pH 7 0的20mmol l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度 連接緩沖液洗脫瓶 打開下端出口進(jìn)行洗脫 收集 待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí) 用試管收集流出液 每5ml收集一試管 連續(xù)收集 在分離過程中 如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng) 說明色譜柱制作成功 注意 正確的加樣操作 1 不要觸及并破壞凝膠面 2 使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng) 29 三 純度鑒定 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 判斷純化的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求 需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定 30 蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步 1 樣品處理 包括洗滌紅細(xì)胞 血紅蛋白的釋放 離心等操作收集血紅蛋白溶液 2 粗分離 透析除去分子較小的雜質(zhì) 3 純化 通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去 4 純度鑒定 通過SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定 小結(jié) 31 1 用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí) 分子量大的蛋白質(zhì)A 路程較長(zhǎng) 移動(dòng)速度較慢B 路程較長(zhǎng) 移動(dòng)速度較快C 路程較短 移動(dòng)速度較慢D 路程較短 移動(dòng)速度較快 D 2 使用SDS 聚丙烯酰胺電泳過程中 不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異 B 3 下列是有關(guān)血紅蛋白提取和分離的相關(guān)操作 其中正確的是A 可采集豬血作為實(shí)驗(yàn)材料B 用蒸餾水重復(fù)洗滌紅細(xì)胞C 血紅蛋白釋放后應(yīng)低速短時(shí)間離心D 洗脫液接近色譜柱底端時(shí)開始收集流出液 A 32