高中生物《第五章 第三節(jié) 血紅蛋白的提取和分離》課件5 新人教版選修1

教學目標教學目標教學重點教學重點教學難點教學難點1. 理解色譜法、電泳法等分離大分子的基本原理理解色譜法、電泳法等分離大分子的基本原理2. 了解緩沖液的組成及其作用了解緩沖液的組成及其作用 3. 血紅蛋白的分離樣品處理血紅蛋白的分離樣品處理凝膠色譜法的原理凝膠色譜法的原理電泳法分離大分子的原理電泳法分離大分子的原理選用一定的選用一定的物理或化學物理或化學的方法分離具有的方法分離具有不同物理或化學性質的不同物理或化學性質的生物大分子生物大分子。凝膠色譜法（凝膠色譜法（分配色譜法分配色譜法）是由是由多糖類化合物分子多糖類化合物分子（如（如葡聚糖或瓊脂糖葡聚糖或瓊脂糖）在在一定的條件下互相交聯(lián)在一起構成的一定的條件下互相交聯(lián)在一起構成的多孔小球體多孔小球體（凝膠粒），內部有許多貫穿的通道。（凝膠粒），內部有許多貫穿的通道。凝膠色譜法（凝膠色譜法（分配色譜法分配色譜法）當相對分子量不同的蛋白質通過凝膠時，相對分子量當相對分子量不同的蛋白質通過凝膠時，相對分子量 較小的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程較長，較小的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程較長， 移動速度較慢移動速度較慢; ;而相對而相對分子量較大分子量較大的蛋白質無法進入凝膠內部的通的蛋白質無法進入凝膠內部的通 道，只能在道，只能在凝膠外部凝膠外部移動，路程移動，路程較短較短，移動速度，移動速度較較 快快。相對分子質量不同相對分子質量不同的蛋白質分子因此得以分離。的蛋白質分子因此得以分離。凝膠色譜法分離蛋白質的原理凝膠色譜法分離蛋白質的原理凝膠色譜柱凝膠色譜柱洗脫：洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質分子的差速流動。液，促使蛋白質分子的差速流動。 帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。瓊脂糖瓊脂糖凝膠電泳、凝膠電泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝膠電泳。凝膠電泳。樣品處理樣品處理粗分離粗分離純化純化純度鑒定純度鑒定（一）蛋白質提取和分離步驟（一）蛋白質提取和分離步驟（二）操作過程（二）操作過程 本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎 動物的血液來分離血紅蛋白。動物的血液來分離血紅蛋白。 去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化。分離純化。 1 1、采集血樣。注意、采集血樣。注意要加入檸檬酸鈉要加入檸檬酸鈉防止血液凝固防止血液凝固。2 2、低速短時間低速短時間離心（速度越高和時離心（速度越高和時間越長，會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀，達不間越長，會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀，達不到分離的效果）到分離的效果）3 3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4 4、鹽水洗滌：用五倍體積的質量分數(shù)為、鹽水洗滌：用五倍體積的質量分數(shù)為0.90.9的氯的氯化鈉化鈉溶液洗滌。溶液洗滌。5 5、低速離心（低速短時間）、低速離心（低速短時間）6 6、重、重復三次，直至上清液中已復三次，直至上清液中已沒有黃色沒有黃色，表明洗滌干凈。，表明洗滌干凈。 加蒸餾水到加蒸餾水到原血液體積原血液體積，再加再加4040體積的體積的甲苯甲苯 ，置于置于磁力攪拌器磁力攪拌器上充分攪拌上充分攪拌1010分鐘分鐘（加速細胞破裂加速細胞破裂）, ,細胞破裂釋放出細胞破裂釋放出血紅蛋白。血紅蛋白。將攪拌好混合液轉移到離心管內，以將攪拌好混合液轉移到離心管內，以 2000r/min2000r/min的速度離心的速度離心10 min10 min。第第1 1層（最上層）：甲苯層（層（最上層）：甲苯層（無色無色 透明透明）；第）；第2 2層（中上層）：脂溶性物質沉淀層（層（中上層）：脂溶性物質沉淀層（白白 色薄層固體色薄層固體）；第）；第3 3層（中下層）：血紅蛋白的水溶層（中下層）：血紅蛋白的水溶 液層（液層（紅色透明液體紅色透明液體）；第）；第4 4層（最下層）：雜質沉層（最下層）：雜質沉 淀層（淀層（暗紅色暗紅色）。）。用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏 斗中靜置片刻后，分出下層的斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體紅色透明液體。取取1ml1ml的血紅蛋白溶液裝入的血紅蛋白溶液裝入透析袋透析袋中，將透中，將透 析袋放入盛有析袋放入盛有300ml300ml的物質的量濃度為的物質的量濃度為20mmol/l20mmol/l的的 磷酸緩沖液磷酸緩沖液中（中（pHpH為為7.07.0），透析），透析1212小時。小時。除去樣品中分子量較小的雜質除去樣品中分子量較小的雜質。A A、材料：、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-G-7575）。）。B B、代表意義：、代表意義：“G”G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍脹程度及分離范圍。7575表示凝膠的得水值，即每克凝表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水膠膨脹時吸水7.57.5克?？?。配置凝膠懸浮液：配置凝膠懸浮液：計算并稱計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。配成凝膠懸浮液。A A、固定：、固定：將色譜柱將色譜柱裝置固定在支架上。裝置固定在支架上。B B、裝填：、裝填：將凝膠懸浮液一次性將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠的裝填入色譜柱內，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。填裝均勻。注意：注意：1 1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。凝膠顆粒之間的空隙。 2 2、裝填凝膠柱時不得有氣泡、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果降低分離效果。裝填完畢后，裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm50cm高的操作壓下，用高的操作壓下，用300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的的磷酸緩沖液磷酸緩沖液（pHpH為為7.07.0）充分洗滌平衡充分洗滌平衡1212小時小時。1 1、液面不要低液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣于凝膠表面，否則可能有氣泡混入泡混入，影響液體在柱內的，影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質流動與最終生物大分子物質的分離效果。的分離效果。2 2、不能發(fā)生洗不能發(fā)生洗脫液流干，脫液流干，露出凝膠顆粒的露出凝膠顆粒的現(xiàn)象現(xiàn)象。裝配好的凝膠柱打開下端出口，使柱內緩沖液緩慢打開下端出口，使柱內緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關閉出口。下降到與凝膠面平齊，關閉出口。 吸管吸吸管吸1ml1ml樣品加到色譜柱的頂端，樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。不要破壞凝膠面。 加樣后打開下端出口，使樣品滲加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內，等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口。入凝膠床內，等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口。 小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸緩沖液到的磷酸緩沖液到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每收集流出液，每5ml5ml收集一試管，連續(xù)收集。收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）功）。