上課血紅蛋白的提取和分離ppt課件

1 蛋白質(zhì)分離的原理 根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異 如分子的形狀和大小 所帶電荷的性質(zhì)和多少 溶解度 吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等等 可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì) 一 基礎(chǔ)知識 2 凝膠色譜法 分配色譜法 1 概念 根據(jù)被分離物質(zhì) 如蛋白質(zhì) 相對分子質(zhì)量的大小 利用具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用 來進(jìn)行分離 性質(zhì) 微小的多孔球體本質(zhì) 多糖類化合物實例 葡聚糖 瓊脂糖 3 4 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì) 5 6 2 凝膠色譜法的原理 7 二 緩沖溶液 能夠抵制外界的酸和堿對溶液PH值的影響 維持PH基本不變 1 作用 2 緩沖溶液的配制 通常由1 2種緩沖劑溶解于水中配制而成 調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液 8 二 緩沖溶液 3 在本課題中使用的緩沖液是 磷酸緩沖液 成分 NaH2PO4 Na2HPO4 9 三 電泳 1 概念 帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程 10 2 原理 許多重要的生物大分子 如多肽 核酸等都具有可解離的基團(tuán) 在一定的PH下 這些基團(tuán)會帶上正電或負(fù)電 在電場的作用下 這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動 電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小 形狀的不同 使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度 從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離 11 3 類型 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 12 聚丙烯酰胺凝膠電泳 在測定蛋白質(zhì)分子量時常用十二烷基硫酸鈉 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N N 亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠 N N 亞甲基雙丙烯酰胺 形成交聯(lián) 丙烯酰胺和交聯(lián)劑N N 亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng) 13 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素 14 SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性 由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈 因此測定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量 SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物 SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量 因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別 使電泳遷移率完全取決于分子的大小 SDS作用機理 15 實驗操作步驟 1 樣品處理2 粗分離3 純化4 純度鑒定 16 血液有哪些成分 17 每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團(tuán) 此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳 血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色 血紅蛋白的特點 18 1 紅細(xì)胞的洗滌2 血紅蛋白的釋放3 分離血紅蛋白溶液4 透析 一 樣品處理 19 問題 1 剛采集的血樣要做怎樣的處理 為什么 加入抗凝血劑 防止血液凝固 2 怎樣洗滌 采樣分離 吸漿倒紅 加液攪拌 重洗三次低速短時間離心生理鹽水 1 紅細(xì)胞的洗滌 20 3 洗滌的目的是什么 去除雜蛋白 以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化 4 洗滌干凈的標(biāo)志是什么 直至上清液不再呈現(xiàn)黃色 表明紅細(xì)胞已洗滌干凈 1 紅細(xì)胞的洗滌 21 2 血紅蛋白的釋放 問題 加蒸餾水和甲苯的作用是什么 使紅細(xì)胞破裂 釋放出血紅蛋白 22 有機溶劑 無色透明的甲苯層 脂類物質(zhì) 白色脂溶性物質(zhì)沉淀層 血紅蛋白溶液 紅色透明液體 紅細(xì)胞破碎物沉淀 暗紅色沉淀物 3 分離血紅蛋白溶液 高速離心 濾紙過濾 漏斗分液 23 血紅蛋白 24 4 透析 過程 取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中 將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol l的磷酸緩沖液中 pH為7 0 透析12小時 透析目的 除去樣品中分子量較小的雜質(zhì) 25 26 2 凝膠色譜操作 1 凝膠色譜柱的制作 27 2 凝膠色譜柱的裝填 凝膠的選擇 A 材料 交聯(lián)葡聚糖凝膠 G 75 B 代表意義 G 表示凝膠的交聯(lián)程度 膨脹程度及分離范圍 75表示凝膠的得水值 即每克凝膠膨脹時吸水7 5克 凝膠的前處理 計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后 配成凝膠懸浮液 28 凝膠色譜柱的裝填方法 A 固定 將色譜柱裝置固定在支架上 B 裝填 將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi) 裝填時輕輕敲動色譜柱 使凝膠填裝均勻 注意 1 凝膠裝填時盡量緊密 以降低凝膠顆粒之間的空隙 2 裝填凝膠柱時不得有氣泡存在 因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序 降低分離效果 2 凝膠色譜柱的裝填 29 洗滌平衡 注意 1 液面不要低于凝膠表面 否則可能有氣泡混入 影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果 2 不能發(fā)生洗脫液流干 露出凝膠顆粒的現(xiàn)象 50cm高 2 凝膠色譜柱的裝填 30 3 樣品加入與洗脫 調(diào)節(jié)緩沖液面 打開下端出口 使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊 關(guān)閉出口 滴加透析樣品 吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端 滴加樣品時 吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣 同時注意不要破壞凝膠面 31 注意 正確的加樣操作是 1 不要觸及并破壞凝膠面 2 貼壁加樣 3 使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動 32 樣品滲入凝膠床 加樣后打開下端出口 使樣品滲入凝膠床內(nèi) 等樣品完全進(jìn)入凝膠層后 關(guān)閉下端出口 洗脫 小心加入pH 7 0的20mmol l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度 連接緩沖液洗脫瓶 打開下端出口進(jìn)行洗脫 收集 待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時 用試管收集流出液 每5ml收集一試管 連續(xù)收集 在分離過程中 如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動 說明色譜柱制作成功 33 34 三 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 選做 鑒定血紅蛋白純度 1 目的 35 1 樣品的處理 通過洗滌紅細(xì)胞 血紅蛋白的釋放 離心等操作收集到血紅蛋白溶液2 樣品的粗分離 經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)3 樣品的純化 通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去4 經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定 小結(jié) 你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎 36 觀察你處理的血液樣品離心后是否分層 見教科書圖5 18 如果分層不明顯 可能是洗滌次數(shù)少 未能除去血漿蛋白的原因 此外 離心速度過高和時間過長 會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀 也得不到純凈的紅細(xì)胞 影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度 三 結(jié)果分析與評價 1 你是否完成了對血液樣品的處理 你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎 37 2 你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生 你的色譜柱裝填得成功嗎 你是如何判斷的 由于凝膠是一種半透明的介質(zhì) 因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈 檢查凝膠是否裝填得均勻 此外 還可以加入大分子的有色物質(zhì) 例如藍(lán)色葡聚糖 2000或紅色葡聚糖 觀察色帶移動的情況 如果色帶均勻 狹窄 平整 說明凝膠色譜柱的性能良好 如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡 輕輕敲打柱體以消除氣泡 消除不了時要重新裝柱 38 如果凝膠色譜柱裝填得很成功 分離操作也正確的話 能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻 狹窄 平整 隨著洗脫液緩慢流出 如果紅色區(qū)帶歪曲 散亂 變寬 說明分離的效果不好 這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān) 3 你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中紅色區(qū)帶的移動嗎 請描述紅色區(qū)帶的移動情況 并據(jù)此判斷分離效果 39