布病實驗室技術(shù)培訓(xùn)PPT課件
布病病原學(xué)及實驗室診斷,布魯氏菌病,布魯氏菌?。˙rucellosis)是由布魯氏菌屬(Brucella)的細菌侵入機體,引起傳染變態(tài)反應(yīng)性的人畜共患傳染病。 布魯氏菌病簡稱布病。 布魯氏菌簡稱為布氏菌。,布病病原學(xué)及實驗室檢驗,1,2,3,布氏菌的生物學(xué)特性,布氏菌的抗原及毒力,布病實驗室檢驗,1.1 布氏菌的發(fā)現(xiàn),1887年英國軍醫(yī)Bruce首先從死于“馬耳他熱”的英國士兵的脾臟中分離出羊種布氏菌。,1.1布魯氏菌的分類學(xué)位置,微生物分類學(xué)家將布氏菌歸為布魯氏菌屬(Brucella),下分6個種19個生物型。,分類,羊種布氏菌(Bvr.melitensis)1,2,3型; 牛種布氏菌(Br.abortus)1,2,3,4,5,6,7,9型; 豬種布氏菌(Br.suis)1,2,3,4,5型; 沙漠森林鼠種布氏菌(Br.neotemae); 綿羊附睪種布氏菌(Br.ovis); 犬種布氏菌(Br.canis)。,陜西省布魯氏菌病病原學(xué)調(diào)查分析,自1952年起,在人畜間共分離出3個種233株布魯氏菌,其中羊種菌227株,占總數(shù)的97.4%。牛種3株、犬種3株。1991年以前流行優(yōu)勢種型為羊1、2型,1996年后則為羊1、3型 。陜西省是以羊型菌為主、牛、犬種布魯氏菌病的混合疫區(qū)。流行優(yōu)勢種隨時間推移發(fā)生了變化。,1.2形態(tài)和培養(yǎng)特征,布氏菌屬的細菌是一組微小的球桿狀的革蘭氏染色陰性菌。柯氏染色,布氏菌染成紅色,其他菌染成綠色或藍色。 寬0.30.6µm,長0.61.5µm。無芽孢、無鞭毛、無質(zhì)粒、不形成莢膜。 一般說來,羊種菌最小,牛種菌次之,豬種菌最大。,1.2培養(yǎng)特性,營養(yǎng)條件高,生長緩慢,生長所需溫度為20-40,最適溫度為37 .通常要經(jīng)過4-6天,有的甚至要經(jīng)過20-30天(雙相培養(yǎng)基)才能長出菌落。,1.3抵抗力,對物理因子的抵抗力 對化學(xué)因子的抵抗力 不同環(huán)境中的抵抗能力 對抗生素的敏感性,不 同 溫 度 對 布 魯 氏 菌 影響,對物理因子的抵抗力,布魯氏菌對消毒劑的抵抗能力,對化學(xué)因子的抵抗力,不同環(huán)境中的抵抗能力,現(xiàn)已證明,布魯氏菌對四環(huán)素最敏感,其次是鏈霉素,而對枯草桿菌肽、多黏菌素B、多黏菌素M素等有很強的抵抗力。,對抗生素的敏感性,布氏菌的抗原、毒力,2,布氏菌的抗原成分十分復(fù)雜,存在A、M、G成分。A對牛種布氏菌有特異性,M對羊種布氏菌有特異性,G為兩種菌共有。還與多種細菌存在共同抗原,因而有血清交叉反應(yīng)。布氏菌不產(chǎn)生外毒素,只產(chǎn)生內(nèi)毒素,有致熱、致炎作用,可導(dǎo)致休克。,從種上來說,羊種毒力最強,豬種和牛種次之,犬種的毒力很弱,幾乎不引起人致病。,由于菌種毒力等因素的不同,患病后的臨床表現(xiàn)也不完全一樣。羊 種布魯氏菌的毒力最強,患者中毒癥狀嚴重,多有典型的發(fā)燒、多汗、頭痛、虛弱、關(guān)節(jié)痛、肝脾及睪丸腫大等急性癥狀。 豬種、牛種次之。 犬種的毒力很弱,幾乎不引起人致病。,布氏菌實驗室檢驗,3,診斷布病的金標(biāo)準(zhǔn)。 3.1.1實驗室要求布氏菌的分離培養(yǎng)要在生物安全二級以上實驗室中進行。 布氏菌是高致病性病原微生物,從危害程度來說為第二類病原微生物。,3.1.2方法采樣(采血) 雙相培養(yǎng)基 菌株鑒定 (菌落形態(tài)觀察、涂片、染色、鏡檢布氏菌診斷血清玻片凝集試驗) 種型鑒定(CO2需要與否、H2S的產(chǎn)生的測定、染料抑菌試驗、單項因子血清凝集試驗、噬菌體裂解試驗等等),3.1.3 布氏菌培養(yǎng)特性 布氏菌是需氧或微需氧菌 生長緩慢,尤其初代分離 牛種部分型別、綿羊附睪種布氏菌需在5-10% CO2環(huán)境中培養(yǎng) 新長出的菌落無色透明,光滑圓形,突起,均質(zhì),直徑1-2mm 液體培養(yǎng)均勻混濁,無菌膜 粗糙型菌落較大,生長快,布魯氏菌培養(yǎng)材料,3.1.4 布氏菌培養(yǎng)檢查材料人或動物的全血、動物流產(chǎn)胎兒(胎兒的肝臟、肺、胃內(nèi)容物)動物臟器、動物胎盤、關(guān)節(jié)液、陰道分泌物等新鮮乳汁,布魯氏菌的培養(yǎng),3.1.5 樣品的采集 血培養(yǎng):急性期、體溫反應(yīng)明顯和血清滴度高的病人,血培養(yǎng)陽性率高 血培養(yǎng)陽性率與病期、體溫反應(yīng)、臨床表現(xiàn)以及血清滴度等有關(guān)系 骨髓培養(yǎng):慢性期病人骨髓培養(yǎng)的陽性率比血液高 從胸腔積液、膿腫和關(guān)節(jié)液、痰、乳、陰道分泌物 流產(chǎn)胎盤中分離到布氏菌 新鮮乳汁,布氏菌特異的油滴樣菌落,布氏瓊脂布魯氏菌菌落,血平皿 布氏菌菌落,布氏菌革蘭染色,3.1.6布氏菌鑒定程序,分離培養(yǎng) 純分離傳代 玻片凝集初步鑒定,陽性血清、因子血清凝集 H2S產(chǎn)生試驗,CO2培養(yǎng)依賴試驗 噬菌體裂解試驗 染料抑菌試驗 PCR檢測 其他方法檢測 生化測定 脂肪酸分析 PFGE等,布氏菌噬菌體,我國1981年起從國外引進布氏菌分型噬菌體,對鑒定布氏菌有良好使用價值,可以將布氏菌鑒定到種目前使用的噬菌體有Tb Fi BK 2 Wb R R/O R/C,噬菌體對布氏菌的裂解,羊種布氏菌噬菌體裂解,分離培養(yǎng)基,商用培養(yǎng)基布氏瓊脂 布氏肉湯 制備培養(yǎng)基肝浸液瓊脂 血瓊脂培養(yǎng)基 胰蛋白眎瓊脂培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基 選擇性培養(yǎng)基添加劑(多種抗生素)商品添加劑多粘菌素B 桿菌肽 放線菌酮 制霉菌素注意:PH 7.2 ,瓊脂適量,適當(dāng)容器,布氏菌培養(yǎng)鑒定,新方法的應(yīng)用 細菌生化 鑒定系統(tǒng) PCR鑒定 OMP31AMOS-PCR,雙向血培養(yǎng)瓶,3.2.1 血清學(xué)診斷的意義 3.2.2 針對布病進行的檢驗 3.2.3 血清樣本的采集和保存,3.2.1 血清學(xué)診斷的意義,人的布病診斷方法:綜合性診斷 (1)流行病學(xué)接觸史:密切接觸家畜、野生動物(觀賞動物)、畜產(chǎn)品、布氏菌培養(yǎng)物等或生活在疫區(qū)內(nèi)的居民 (2)臨床癥狀和體征 (3)實驗室檢查:病原菌分離、試管凝集試驗、補體結(jié)合試驗、抗人球蛋白試驗 具備(1)、(2)和(3)項中的任何一項檢查陽性即可確定為布病病人,3.2.2 針對布病進行的檢驗,實驗室檢查陽性判定標(biāo)準(zhǔn) (1)病原菌分離:檢出布魯氏菌 (2)試管凝集試驗:1:100(+)及以上 (3)補體結(jié)合試驗:1:10(+)及以上 (4)抗人球蛋白試驗:1:400(+)及以上 (5)虎紅、平板凝集試驗:出現(xiàn)可見凝集 (6)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng):皮試后24、48小時分別各觀察一次,皮膚紅腫范圍有一次在2.×2.厘米及以上(或.平方厘米及以上),虎紅、平板凝集試驗和皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)供初篩試驗用 對已確診的慢性病人和接種過菌苗的人,應(yīng)以臨床癥狀為主要依據(jù),血清學(xué)試驗效價高低,皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)強弱供參考,布氏菌的血清學(xué)診斷方法,試管凝集試驗 (SAT) 虎紅玻片凝集試驗 (RBPT) 含巰基化物處理血清后的凝集試驗(2ME 試驗) 抗球蛋白試驗 (Coombs試驗) 補體結(jié)合試驗 (CFT) 乳環(huán)凝集試驗 (MRT) 酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA) 金標(biāo)法 熒光偏振方法 (FPA),3.2.2.1、虎紅玻片凝集實驗,原理:利用酸性帶色的抗原與被檢血清作用時能抑制血清中的IgM類抗體的凝集活性,主要檢查血清中的IgG類抗體。 評價:簡便快速、容易操作,適用于基層大面積檢疫,容易出現(xiàn)假陽性,結(jié)果僅供參考,不能作為確診依據(jù)。,布病虎紅玻片凝集試劑,試劑與器材,虎紅平板凝集抗原、被檢血清、清潔脫脂玻片、微量移液器、槍頭。 方法:在玻片上加0.03ml被檢血清,然后加入虎紅平板抗原0.03ml,充分混勻,5min之內(nèi)觀察結(jié)果。 結(jié)果判定:出現(xiàn)可見的凝集反應(yīng)就判為陽性;否則就為陰性。 評價:簡便快速、容易操作,漏檢率極低,適用于基層大面積檢疫;容易出現(xiàn)假陽性,臨床上需要借助SAT來確認。,注意事項,血清靜止的溫度和時間對實驗結(jié)果有很大的影響,在一定的時間和溫度范圍內(nèi),防治時間越長,溫度越高,假陽性率越低; 患者空腹血清出現(xiàn)假陽性少; 凡是試驗中凝集顆粒不規(guī)則,大小不勻,片狀或絮狀,凝集不清澈者,一般為假陽性,否則凝集顆粒規(guī)則,大小均勻,凝集清澈者,一般與SAT結(jié)果相符,為陽性。,原理:布氏菌侵入機體后,就會刺激機體產(chǎn)生特異性抗體,這種抗體可與相應(yīng)的布氏菌抗原發(fā)生特異性結(jié)合,在電解質(zhì)的作用下,就會形成肉眼可見的凝集反應(yīng),也就是用已知抗原查未知抗體。,3.2.2.2、 試管凝集試驗,3.2.2.2、 試管凝集試驗,試管凝集試驗 陰性,布氏菌試管凝集 陽性,布氏菌試管凝集抗原,器材與試劑,實驗?zāi)乖?、被檢血清、生理鹽水 移液器、吸管、凝集管、試管架、稀釋抗原用的玻璃杯、37度溫箱。 方法:每份血清取9支小試管,放于試管架上。 血清稀釋稀釋抗原后;加入抗原溫育18-22小時室溫放置2小時后觀察結(jié)果 比濁管配置,0.2ml血清,2.3ml鹽水,0.5ml抗原,05ml棄去,1:1600,結(jié)果判定:根據(jù)各管中上層液體的清亮度記錄凝集反應(yīng)程度(滴度),特別是50%清亮度(+)對判定結(jié)果關(guān)系較大,一定要與比濁管對比判定。 + 液體完全透明,菌體成傘狀沉淀或塊狀顆粒狀沉淀,呈100%凝集。 + 液體近于完全透明,菌體成傘狀沉淀,呈75%凝集。 + 液體略微透明,菌體呈較薄傘狀沉淀,呈50%凝集。 + 液體不透明,管底有很不明顯的傘狀沉淀,呈25%凝集。 液體不透明,無傘狀沉淀。 效價以產(chǎn)生50%凝集的血清最高稀釋倍數(shù)為受檢血清的效價。 血清對照為清亮透明無沉淀,抗原對照為均勻渾濁,兩種對照管成立,才可判定試驗管,否則重做。人的診斷標(biāo)準(zhǔn):1:100+為陽性,1:50+為可疑。,試管凝集實驗的評價,實驗室診斷標(biāo)準(zhǔn)之一 滴度1100及以上或病程一年以上者滴度為150及以上為陽性 特異好,實用性、敏感性強 主要檢查血清中的IgG和IgM,適合于急性期病人的診斷。 缺點:有前帶現(xiàn)象,有時出現(xiàn)假陰性結(jié)果;長生一定的交叉反應(yīng);出結(jié)果慢,需要兩天,注意事項,受檢血清應(yīng)新鮮、無溶血、無污染,存放血清處溫度不能超過10,采血后應(yīng)于3-4日內(nèi)進行檢查,因放置時間過長可能會導(dǎo)致血清效價降低。 每份血清和抗原要有對照。 個別血清會出現(xiàn)前帶現(xiàn)象,建議多做幾個管,多采用幾個稀釋度。,3.2.2.3、抗人球蛋白實驗(Coombs),原理:機體受布氏菌抗原刺激后可產(chǎn)生“完全抗體”和“不完全抗體”。不完全抗體可與相應(yīng)抗原結(jié)合,但不出現(xiàn)可見反應(yīng)。若將預(yù)測不完全抗體的人血清球蛋白作為抗原,注射于另一種動物(常用家兔)制成抗球蛋白(抗IgG、IgA、IgM)的抗體,再將此球蛋白抗體加入到抗原與不完全抗體復(fù)合體中,即可出現(xiàn)可見反應(yīng)。分為兩個階段: 不完全抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合為不可見階段 抗原抗體復(fù)合物有抗球蛋白抗體凝集而形成可見反應(yīng) 評價:所查抗體主要是IgG、IgA;可以作為早期和追溯診斷;適用于亞急性和慢性病人;操作復(fù)雜,耗時長,一般不作為常規(guī)檢查項目。,器材及試劑,試劑:試管凝集抗原、被檢血清、抗被檢對象的血清球蛋白抗體、生理鹽水 器材:普通離心機、溫箱、1ml及10ml吸管。 方法:試管凝集試驗階段抗球蛋白反應(yīng)階段 吸取上項試驗的可疑管和全部陰性管,4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘,反復(fù)洗滌3次。向各管中加入生理鹽水0.5ml,混勻,再向各管中加0.5ml一定稀釋度的抗球蛋白血清,將反應(yīng)管置37溫箱中20-22小時,取出室溫放置2小時后判定結(jié)果。 判定標(biāo)準(zhǔn)同試管凝集試驗,對照,被檢血清對照(被檢血清+鹽水) 試管凝集抗原對照(試管抗原+鹽水) 抗球蛋白血清加生理鹽水對照 抗球蛋白血清加試管凝集抗原對照 抗球蛋白血清加被檢血清對照 對照全部為陰性時,實驗才有意義 我國試行的用于診斷人布病標(biāo)準(zhǔn)1:400及以上滴度。,注意事項,在進行Coombs試驗時,洗滌抗原很重要,如不認真洗滌,在抗原表面上吸附血清中的某些其他蛋白物質(zhì),會干擾下一步加入抗球蛋白血清的反應(yīng),掩蓋真正結(jié)果。 一般采用加入抗球蛋白血清1:20-1:50之間的稀釋度。,評價,(1)布氏菌感染后,約在15天出現(xiàn)不完全抗體,3個月左右達到高峰。可持續(xù)一年左右。該實驗可作為早期和追溯診斷。 (2)該試驗特異性較強,尤其適用于診斷亞急性和慢性病人,所查抗體主要為IgG、IgA類。 (3)一般不作為常規(guī)項目,在試管凝集試驗為可疑,患者又處于慢性期時,可考慮抗球蛋白試驗予以診斷。,3.2.2. 4、布氏菌補體結(jié)合試驗,原理:綿羊紅細胞和溶血素可以形成結(jié)合物,在補體的作用下,發(fā)生溶血。在反應(yīng)體系中,他們作為指示系統(tǒng),與布氏菌的特異性抗原、抗體復(fù)合物競爭結(jié)合補體。如果發(fā)生溶血,說明血清中沒有特異性抗體,判為陰性,即不是布病患者。,評價:主要檢查IgG類抗體,特異性強,適用于各型各期病人的診斷,準(zhǔn)確性高,敏感性差,對慢性病人有漏診現(xiàn)象,操作復(fù)雜,影響因素多,難以在基層推廣。,補體試驗的5種成分,補體 溶血素 綿羊紅血球 布氏菌抗原 待檢血清(以及對照血清),補體結(jié)合試驗注意事項,血清滅活 恒溫水浴箱 結(jié)果的判讀 出現(xiàn)問題的分析,3.2.2.5、皮膚變態(tài)實驗,原理:IV型變態(tài)反應(yīng),為細胞免疫。當(dāng)機體受布氏菌抗原刺激后,導(dǎo)致T淋巴細胞致敏,致敏的T淋巴細胞再遇到相同抗原后進行分化、衍變、產(chǎn)生能釋放各種淋巴因子的效應(yīng)細胞。局部的變態(tài)反應(yīng)就是各種淋巴因子綜合作用的結(jié)果。 方法:前臂內(nèi)側(cè)前1/3處,酒精消毒,皮內(nèi)注射布氏菌素0.1毫升,24、48小時各觀察一次。 評價:呈陽性反應(yīng)的人只表示受過布氏菌感染;副作用大。,3.2.2.6、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA),間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(iELISA) 競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(cELISA) 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗 雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗,酶聯(lián)免疫吸附試驗注意事項,試驗的穩(wěn)定性,重復(fù)性 試驗對照的設(shè)置,強、弱陽性,陰性血清對照的ct值要在規(guī)定的范圍 稀釋倍數(shù),3.2.3 血清樣本的采集和保存,采血盡量使用負壓采血管,便于無菌操作編號,造表,妥善攜帶回實驗室,實驗時的無菌操作 妥善保存有意義的樣本編號,凍存,背景資料,謝謝大家!,