DNA蛋白質(zhì)的相互作用PPT課件

DNA-蛋白質(zhì)相互作用的研究方法,1,引言,1.很多細(xì)胞的生命活動涉及到特定的DNA區(qū)段與特殊蛋白質(zhì) 結(jié)合因子之間的相互作用： DNA的復(fù)制和重組； mRNA的轉(zhuǎn)錄和修飾； 病毒的感染與增殖等 2.隨著人類基因組測序工作的基本完成， 功能基因組學(xué)的研究顯得尤為重要。而基因表達(dá)調(diào)控是 功能基因組學(xué)的一個重要研究領(lǐng)域。而要深入研究基因表 達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制必須要研究DNA與蛋白質(zhì)的相互作用。 3.在重組DNA技術(shù)發(fā)展以來，已相繼分離到大量的具有重要生 物學(xué)意義的基因。在這種情況下科學(xué)工作者開始把自己的研 究興趣逐漸轉(zhuǎn)向DNA結(jié)合蛋白這一課題上。,2,凝膠阻滯試驗 DNaseI足跡試驗 甲基化干擾試驗 體內(nèi)足跡試驗 酵母單雜交技術(shù) 染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù) 噬菌體展示技術(shù) 核酸適體技術(shù) 生物信息學(xué)方法 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)及納米技術(shù),3,一、凝膠阻滯試驗 （DNA遷移率變動試驗 DNA mobility shift assay）,1 原理： 在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的DNA朝正電 極移動的距離與其分子量的對數(shù)成反比。 如果此時DNA分子與某種蛋白質(zhì)結(jié)合， 由于分子量增大，它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯 在特定電壓和時間內(nèi)朝正電極移動的距離也就相應(yīng)縮短了。,4,2 主要步驟及內(nèi)容：制備探針DNA （P32放射性同位素標(biāo)記DNA） 同細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物一道溫育，形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。 將它加樣到非變性的聚丙烯酰胺凝膠中，進(jìn)行電泳分離。 應(yīng)用放射自顯影技術(shù)顯現(xiàn)具放射性標(biāo)記的DNA條帶位置,不存在與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)時 存在與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)時,5,凝膠阻滯試驗不僅可以用來鑒定在特殊類型細(xì)胞的提取物中，是否存在著能夠同某一特定DNA片段結(jié)合的蛋白質(zhì)分子(比如特異的轉(zhuǎn)錄因子等)，而且還可以用來研究發(fā)生此種結(jié)合作用之精確的DNA序列的特異性,超量的非標(biāo)記的競爭DNA (competitor DNA ）,6,7,材料及試劑： 2X結(jié)合緩沖液： 20 mM Tris pH 7.5 、100 mM NaCl、2 mM EDTA、10% 甘油、poly(dI-dC) (5 mg/ml in TE)、 BSA (10 mg/ml)、 P32-標(biāo)記探針 緩沖液C： 20 mM HEPES pH 7.9、25% glycerol、420 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、 0.5 mM 二硫蘇糖醇、0.5 mM 苯甲基磺酰氟化物、0.2 mM EDTA 4%天然的聚丙烯酰胺凝膠(50 ml)：5 ml 40% 丙烯酰胺 (30:1)、2.5 ml 5X 四溴乙烷， 41.95 ml H20、0.5 ml 10% APS（過硫酸銨）、50 ml 四甲基乙二胺、0.25X 四溴 烷電泳緩沖夜。 填充染料： 0.2% 溴酚藍(lán)、0.2%二甲本藍(lán)、50% 甘油 操作步驟： 1.配置反應(yīng)混合液：探針DNA (1 ng/ml) 0.1ml、 dH20 6.3 ml、2x 結(jié)合緩沖液 12.5 ml、BSA (10 mg/ml) 1.0 ml 、 poly(dI-dC) (5 mg/ml) 0.1ml、 2.在細(xì)胞提取物中加入緩沖液C至5 ml。 3.加1015 mg上述溶液（£ 5 ml)到反應(yīng)混合物中，總體積應(yīng)不大于25 ml。 4.在室溫下培養(yǎng)20min。 5.加入2.5 ml的填充染料。 6.裝載樣品到4%的聚丙烯酰胺凝膠柱中。 7.室溫下跑電泳2.5h，至溴酚藍(lán)距底部1cm處停止。 8.80下干燥凝膠，進(jìn)行放射自顯影處理。,8,二、DNaseI足跡試驗 (DNaseI footprinting assay),DNaseI足跡試驗是一種測定DNA結(jié)合蛋白在DNA上的準(zhǔn)確 結(jié)合位點的技術(shù)。 首先是單鏈標(biāo)記， 然后用DNaseI水解單鏈標(biāo)記的雙鏈DNA， 產(chǎn)生“DNaseI保護(hù)”， 尿素變性， PAGE分離及放射性顯影， 形成以相差一個核苷酸為梯度的一系列DNA條帶， 在此顯影圖中相應(yīng)于DNA結(jié)合蛋白的位置上由于DNA結(jié) 合蛋白的保護(hù)作用而形成了空白區(qū)域。,9,如果在電泳時結(jié)合DNA化學(xué)測序，則可準(zhǔn)確判斷出結(jié)合區(qū) 的精確序列。,10,三、甲基化干擾試驗,根據(jù)DMS （二甲基亞藍(lán)）能使G殘基甲基化， 而六氫吡啶又能夠特異切割甲基化的G殘基這一原理而設(shè)計,先用DMS處理DNA； （并控制反應(yīng)條件，使之達(dá)到平均每條DNA分子只有一個殘基被甲基化） 將這些局部甲基化的DNA群體同含有DNA結(jié)合蛋白的適當(dāng)細(xì)胞提取物 一道溫育； 并做凝膠阻滯試驗。 經(jīng)電泳分離后， 從凝膠中切除具有結(jié)合蛋白的DNA條帶和沒有結(jié)合蛋白的DNA條帶， 并用六氫吡啶處理之。,11,檢測靶DNA中特異G殘基的優(yōu)先甲基化對而后的蛋白質(zhì)結(jié)合作用會有什么效應(yīng)，從而更加詳細(xì)地揭示DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用模式。DMS化學(xué)干擾只能在G和A殘基甲基化，不能使T和C甲基化。故本實驗為足跡實驗的補(bǔ)充手段。,12,四、酵母單雜交技術(shù),真核生物中 ，轉(zhuǎn)錄因子中DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain BD)與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域( activationdomain AD) 能夠相互獨立發(fā)生作用。酵母中的轉(zhuǎn)錄因子GAL4 的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換為文庫蛋白編碼基因，只要其表達(dá)的蛋白能與目的基因相互作用同樣可通過轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶啟動下游報告基因的轉(zhuǎn)錄 。,13,設(shè)計含目的基因(稱為誘餌)和下游報告基因的質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)入酵母中; 將文庫蛋白的編碼基因片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達(dá)的cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入同一酵母中; 若文庫蛋白與目的基因相互作用可通過報告基因的表達(dá)將文庫蛋白的編碼基因篩選出來. 注：這里作為誘餌的目的基因就是啟動子DNA 片段，文庫基因所編碼的蛋白就是啟動子基因結(jié)合蛋白. 酵母單雜交技術(shù)廣泛用DNA與蛋白相互作用的研究。,14,不足以充分反映生理條件下，DNA與蛋白質(zhì)相互作用的真實情況。 因為，高等生物的基因組有染色質(zhì)結(jié)構(gòu)， 用以上所提到的方法分析得到的某段DNA與蛋白質(zhì)，在生理狀態(tài)下， 這段DNA很可能并不與其相對應(yīng)的因子相結(jié)合。 另外，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)本身是動態(tài)的，DNA與非組蛋白在生理狀態(tài)下的相互作用通常是瞬時的， 以上方法難以捕捉到發(fā)生在染色質(zhì)上的基因表達(dá)調(diào)控的瞬時事件,以上技術(shù)都有一定的局限性,15,八、染色體免疫沉淀技術(shù) Chromatin immunoprecipitation （ChIp）,1.技術(shù)介紹在生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，超聲波將染色質(zhì)打碎后，用所要研究的目的蛋白特異性的抗體沉淀這種交聯(lián)復(fù)合體。只有與目的蛋白結(jié)合的DNA片段才能夠被沉淀下來,16,2、主要步驟及內(nèi)容,細(xì)胞的甲醛固定 超聲波斷裂染色質(zhì) 氯化銫等密度離心純化交聯(lián)的染色質(zhì) 染色質(zhì)免疫沉淀和免疫沉淀復(fù)合體的純化 交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)和DNA的純化 染色質(zhì)免疫沉淀的DNA的分析和蛋白質(zhì)在DNA上結(jié)合位點的鑒定 目的蛋白和DNA靶序列特異結(jié)合的進(jìn)一步驗證,17,1.細(xì)胞的甲醛固定在1%甲醛的作用下，DNA堿基上的氨基或亞氨基和蛋白質(zhì)上的氨基包括賴氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸的側(cè)鏈氨基與另外的DNA和蛋白質(zhì)上的氨基或亞氨基交聯(lián)在一起，在幾分鐘內(nèi)形成生物復(fù)合體，防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布。 加入甘氨酸來終止交聯(lián)反應(yīng)。,18,2.超聲波斷裂染色質(zhì) 甲醛交聯(lián)后的染色質(zhì)對限制酶和DnaseI高度抵抗， 因此通常使用超聲波使得染色質(zhì)斷裂。 打斷后的染色質(zhì)片段的平均長度應(yīng)該在500-1000bp左右。 （可以用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定）,19,3.氯化銫等密度離心純化交聯(lián)的染色質(zhì) 氯化銫等密度離心可以除去未交聯(lián)的蛋白質(zhì)、 DNA和RNA樣品中加入0.5%的十二烷基肌氨酸鈉， 通常在4000rpm離心72h。 離心后，用連接到蠕動泵的0.25mm毛細(xì)管從梯度的底部分步收集染色質(zhì)組分，在4透析過夜。,20,4.染色質(zhì)免疫沉淀和免疫沉淀復(fù)合體的純化 用目的蛋白特異性的抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀。 抗體的量要進(jìn)行優(yōu)化防止非特異的結(jié)合。 用ProteinA/G-Agarose/Sepharose回收免疫沉淀復(fù)合體。 經(jīng)過洗滌除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后， 用1%SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復(fù)合體。,21,5.交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)和DNA的純化在免疫沉淀復(fù)合體中加入不含Dnase的Rnase，proteinase K。 65保溫6h使交聯(lián)逆轉(zhuǎn)。 經(jīng)酚氯仿抽提-乙醇沉淀純化DNA。 純化的DNA極少，可用色譜定量。,22,6.染色質(zhì)免疫沉淀的DNA的分析和蛋白質(zhì)在DNA 上結(jié)合位點的鑒定 染色質(zhì)免疫沉淀的DNA的分析方法有許多種。 如果目的蛋白的靶序列是已知的或者懷疑某個序列 是目的蛋白的靶序列，可以采用狹縫雜交和PCR分析; 如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量的研究目的蛋 白在基因組上的分布情況,找出反式作用因子的結(jié)合位 點,可以采用Southern雜交、ChIP克隆和DNA芯片方法。,23,7.目的蛋白和DNA靶序列特異結(jié)合的進(jìn)一步驗證染色質(zhì)免疫沉淀分析得到的結(jié)果有很大一部分是假陽性，需要采用其他方法驗證結(jié)果的真實性。 用PCR方法進(jìn)行獨立的ChIP分析、電泳遷移率變動分析、酵母單雜交系統(tǒng)及熒光素酶報告系統(tǒng)最終確定目的蛋白與靶DNA序列的特異性結(jié)合。,24,近年來發(fā)展起來的基因芯片（chip）染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù) 相結(jié)合(chip-ChIP)的方法要一個PCR步驟來擴(kuò)增染色質(zhì)免疫沉淀富集的DNA。 特異性染色質(zhì)免疫沉淀的DNA和對照DNA的PCR產(chǎn)物 分別用Cy5和Cy3熒光光標(biāo)記， 用于與含有整個基因組的DNA芯片進(jìn)行雜交 。 通過比較兩種熒光信號的強(qiáng)度篩選出目的蛋白可能的結(jié)合序列 在基因組的水平上繪制出目的蛋白的分布圖譜 。chip-ChIP法大大促進(jìn)了在基因組水平上高通量 對DNA和蛋白質(zhì)的相互作用的研究 。,25,前景與展望：進(jìn)一步研究DNA蛋白質(zhì)的相互作用需要 生物學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、物理學(xué)、計算機(jī)學(xué)及電子學(xué)等多學(xué)科的協(xié)作 。 隨著各種新技術(shù)在這個研究領(lǐng)域的應(yīng)用， 人類一定能在不遠(yuǎn)的將來揭開蛋白質(zhì)與核酸相互作用的規(guī)律。,26,謝謝！,27,