基因工程原理PPT演示課件

.,基因工程原理,Principle of Gene Engineering,第一章,.,.,基因研究的發(fā)展階段：,染色體遺傳學(xué),分子生物學(xué),反向生物學(xué),50s,70s,染色體水平,DNA水平,DNA重組,1909年，丹麥W. Johannsen，Gene專業(yè)名詞誕生，“給予生命”,18571864：孟德爾碗豆雜交試驗(yàn)（遺傳因子的獨(dú)立分配規(guī)律）1910年：摩爾根果蠅遺傳學(xué)研究（遺傳的染色體理論）,1944年：Avery細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（基因的化學(xué)本質(zhì)是DNA）1953年：Watson-Crick DNA雙螺旋模型,.,.,.,.,學(xué)習(xí)內(nèi)容,概論DNA重組（限制性內(nèi)切酶）運(yùn)輸工具基因克隆載體目的基因的制備目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞外源基因的表達(dá)基因工程的應(yīng)用,.,.,基本要求,掌握基因克隆的基本工具，特別是不同的載體?？寺』虻幕痉椒?。怎樣利用基因重組技術(shù)研究基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)和調(diào)控。利用基因工程生產(chǎn)重組蛋白，基因工程在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。能夠設(shè)計(jì)一個(gè)基因克隆的程序。PCR技術(shù)基本原理和應(yīng)用能夠根據(jù)酶切結(jié)果判讀酶切圖譜，以及判讀DNA序列的能力。,.,.,基因工程，龍敏南 等著，科學(xué)出版社，普通高等教育“十一五”國(guó)家級(jí)規(guī)劃教材,.,.,參考書,Gene cloning, T.A. Brown. Third edition.基因工程原理，吳乃虎編著，科學(xué)出版社基因工程概論，張惠展編著，華東理工大學(xué)出版社。植物基因工程原理與技術(shù)，王關(guān)林，方宏筠主編，科學(xué)出版社。分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，J. Sambtook, EF Frish, T Maniatis, 金冬雁，黎孟楓等譯，科學(xué)出版社。,.,.,第一章 緒論基因工程概況,1.1引言1.1.1基因工程含義 指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使其摻入到原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定繁殖。 基因工程英文： genetic engineering, gene manipulation, recombinant DNA technique, gene cloning, molecular cloning,.,.,目的基因的制備DNA重組（限制性內(nèi)切酶）運(yùn)輸工具基因克隆載體目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞外源基因的表達(dá),基因工程：在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使其摻入到原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定繁殖。,關(guān)鍵要素：,.,.,1.1.2 基因工程理論依據(jù),基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)：DNA基因可切割基因可轉(zhuǎn)移多肽基因遺傳密碼通用性：三聯(lián)密碼基因遺傳,.,.,1.1.3 基因工程研究的基本路線,基因工程：在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使其摻入到原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定繁殖。,.,.,1.1.4基因工程發(fā)展史（1）理論上的三大發(fā)現(xiàn)：,1944, Avery的肺炎雙球菌實(shí)驗(yàn),確定了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA。DNA的分子結(jié)構(gòu)及復(fù)制機(jī)理：50年代，Watson和Crick提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制的機(jī)理。1958，Crick提出“中心法則”；1961年，Jacob和Monod “操縱子學(xué)說(shuō)” DNARNA-蛋白質(zhì) 闡明了遺傳物質(zhì)的流向和表達(dá)問題。,.,.,.,.,1.1.4基因工程發(fā)展史（1）理論上的三大發(fā)現(xiàn)：,1944, Avery的肺炎雙球菌實(shí)驗(yàn),確定了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA。DNA的分子結(jié)構(gòu)及復(fù)制機(jī)理：50年代，Watson和Crick提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制的機(jī)理。1958，Crick提出“中心法則”；1961年，Jacob和Monod “操縱子學(xué)說(shuō)” DNARNA-蛋白質(zhì) 闡明了遺傳物質(zhì)的流向和表達(dá)問題。,.,.,.,.,1.1.4基因工程發(fā)展史（1）理論上的三大發(fā)現(xiàn)：,1944, Avery的肺炎雙球菌實(shí)驗(yàn),確定了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA。DNA的分子結(jié)構(gòu)及復(fù)制機(jī)理：50年代，Watson和Crick提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制的機(jī)理。1958，Crick提出“中心法則”；1961年，Jacob和Monod “操縱子學(xué)說(shuō)” DNARNA-蛋白質(zhì) 闡明了遺傳物質(zhì)的流向和表達(dá)問題。,.,.,.,.,DNA分子的體外切割與連接技術(shù)1970年，Smith等在流感嗜血桿菌中分離純化了核酸限制性內(nèi)切酶Hind；1972年，EcoR 。DNA分子的核苷酸序列分析技術(shù)基因工程載體pBR322和pUC13等載體。Cohen發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pSC101，并作為基因工程的載體使用.,（2）技術(shù)上的三大發(fā)明：,.,.,（3）基因工程的誕生,1972年,美國(guó)斯坦福大學(xué)的 P.Berg 第一次實(shí)現(xiàn)了DNA 體外重組。,.,.,1973年，Cohen等獲得了抗四環(huán)素和新霉素的重組菌落TcrNer，標(biāo)志著基因工程的誕生：,.,.,Cohen體外重組實(shí)驗(yàn)的意義：,1. pSC101質(zhì)粒可以作為基因克隆的載體.2. 能夠?qū)⑼庠碊NA導(dǎo)入寄主細(xì)胞.3. 質(zhì)粒-大腸桿菌是一種成功的基因克隆體系.,.,.,1977年，E. coli中合成了人生長(zhǎng)激素基因。1978-1979胰島素基因在大腸桿菌中表達(dá)。 1982年，培育出了超級(jí)鼠。1985年Horsch發(fā)明了植物基因工程的基本方法：葉圓盤法，并獲得轉(zhuǎn)基因植株。1990年，患有遺傳免疫疾病的4歲女孩接受了基因療法。1990年，Perlak 將B.T.基因?qū)朊藁ǐ@得抗蟲棉 。1991年，美國(guó)開始人類基因組計(jì)劃。1997年，“多利”綿羊誕生。,（4） 發(fā)展過程中的重大事件,.,.,轉(zhuǎn)移大鼠生長(zhǎng)素基因的小鼠,.,.,.,.,1.2 基因工程研究?jī)?nèi)容,目的基因分離制備重組DNA分子重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆提取已擴(kuò)增的目的基因目的基因克隆到表達(dá)載體上，表達(dá)，產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物,.,.,.,.,第一次課結(jié)束,.,.,瓊脂糖凝膠電泳(0.2-50kb DNA)聚丙烯酰胺凝膠電泳(1-1000bp DNA),1.3 基因操作的基本技術(shù),（1）凝膠電泳：一種分子放置在電場(chǎng)中,會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。,凝膠的分辨能力: 凝膠的類型和凝膠的濃度有關(guān)凝膠電泳的作用: 分析,制備和純化溴化乙錠:簡(jiǎn)稱EB.,.,.,.,.,EB的工作原理：,溴化乙啶,.,.,-,+,電泳方向,EB分辨率：,0.05g/帶,.,.,原理:帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合，互補(bǔ)區(qū)段會(huì)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。,（2）核酸的分子雜交 1968年華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院 Roy Britten等,常見的分子雜交：,.,.,Southern Blotting雜交:,1975年，英國(guó)人Southern創(chuàng)建，是研究DNA圖譜的基本技術(shù)。,.,.,Southern印跡雜交顯色圖片,用途：確定DNA 大小，鑒定DNA轉(zhuǎn)化結(jié)果。,.,.,Northern Blotting雜交:1979年，J.C.Alwine等，應(yīng)用于特定性狀基因在mRNA水平上的動(dòng)態(tài)表達(dá)研究。,流程：RNA混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離得到的RNA轉(zhuǎn)膜與放射性標(biāo)記的探針雜交 結(jié)果分析,.,.,（3）細(xì)菌的轉(zhuǎn)化（Transformation）,一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳性改變的生命過程。,.,.,雙脫氧鏈終止法（Sanger法）：英國(guó)生物化學(xué)家Frederick Sanger于1977年發(fā)明,（4）DNA核苷酸序列分析,模板標(biāo)記的引物DNA聚合酶dNTP雙脫氧鏈終止物ddNTP,反應(yīng)組成,檢測(cè)方法：電泳放射自顯影讀出DNA序列長(zhǎng)度：250bp,.,.,.,.,DNA Sequencing via the Sanger Method,模板標(biāo)記的引物DNA聚合酶dNTP雙脫氧鏈終止物ddNTP,.,.,Frederick Sanger,1918年8月13日2013年11月19日，英國(guó)生物化學(xué)家。是第四位兩度獲得諾貝爾獎(jiǎng)，以及唯一獲得兩次化學(xué)獎(jiǎng)的人。,1958年：確定胰島素結(jié)構(gòu)，獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1980年：發(fā)明Sanger測(cè)序法，再諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),.,.,化學(xué)降解法(Maxam-Gilbert法）：250bp 1977年，A.M.Maxam和W.Gilbert建立的DNA片段序列的測(cè)定方法,.,.,DNA分子末端放射性標(biāo)記,電泳,四個(gè)獨(dú)立的降解體系,放射自顯影,G反應(yīng)：G甲基化（硫酸二甲酯）G+A反應(yīng)：A和G質(zhì)子化（甲酸）T+C反應(yīng)：T和C嘧啶環(huán)斷裂（肼）C反應(yīng)：C嘧啶環(huán)斷裂（高鹽、肼）,.,.,DNA序列分析儀,.,.,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR ）1985年，美國(guó)，Mullis：體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。成果發(fā)表在Science上。,（5）基因擴(kuò)增（gene amplification）,1993年因發(fā)明PCR技術(shù)，與邁克爾·史密斯分享諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),Kary Banks Mullis，1944年12月28日,“我感謝諾貝爾評(píng)獎(jiǎng)委員會(huì),在我還能夠盡情享受生活的年齡及時(shí)地把諾貝爾獎(jiǎng)授予給我.”,“Fish dont know much about water, and people didnt know much about air.” “Play! Experiment! Discover!”,.,.,.,.,基本原理：,.,.,.,.,.,.,1.4 基因克隆需要特殊的工具和技術(shù),運(yùn)輸工具：細(xì)菌質(zhì)粒病毒染色體DNA操作技術(shù)純化DNA剪切DNA分子分析DNA片段大小連接DNA分子將DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞重組子的鑒定,.,.,1.5 基因工程的意義,大規(guī)模的生產(chǎn)生物分子設(shè)計(jì)構(gòu)建新物種搜尋、分離和鑒定生物體尤其是人體內(nèi)的遺傳信息。,.,.,醫(yī)藥重組藥物基因治療檢測(cè)遺傳疾病、病原農(nóng)業(yè)抗病蟲提高品質(zhì)提高花卉的觀賞價(jià)值抗逆性家畜：瘦肉比；飼料利用率；加快生長(zhǎng),.,.,主要基因工程產(chǎn)品的研制、開發(fā)、上市時(shí)間,.,.,.,謝謝聆聽,2018/7/21,53,