細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)熒光顯微鏡生物樣品的熒光觀察

生物樣品的熒光觀察 生物122 祝洪晨 1202040220目的：初步掌握熒光顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡的結(jié)構(gòu)、原理使用方法及其在細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用。掌握生物材料的熒光染色和活體熒光蛋白的觀察方法。原理：本實(shí)驗(yàn)中微絲的熒光觀察采用熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(phalloidin)，鬼筆環(huán)肽專一的結(jié)合聚合狀態(tài)的肌動蛋白絲上，起到穩(wěn)定微絲的作用?；ǚ奂?xì)胞核的觀察采用DAPI染色。DAPI(4，6聯(lián)瞇2苯基吲哚)是一種熒光染料，它與DNA雙螺旋的凹槽部分相互作用，從而與DNA雙鏈緊密結(jié)合，結(jié)合后產(chǎn)生的熒光基團(tuán)的吸收峰是358nm。植物細(xì)胞的花粉管、篩板、和胞間連絲含有胼胝體成分，其經(jīng)過苯胺藍(lán)染色后，用紫外線激發(fā)，可發(fā)出黃綠色熒光。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果（1） 熒光標(biāo)記觀察煙草花粉管內(nèi)微絲骨架的分布1）煙花新鮮花粉萌發(fā)液已由教師完成。2）固定：取200ul萌發(fā)液放入離心管中， 靜置沉降，3000rpm離心30秒，吸出培養(yǎng)基，加入200ul 3.6%多聚甲醛（50 mmol/L Pipes配制）固定20分鐘。再吸出固定液，用 Pipes緩沖液清洗三次，每次5分鐘。3）染色:3000rpm離心1分鐘，吸凈緩沖液，加入100nm Alexa Fluo 488 phalloidin 50ul，37度染色20分鐘，洗去染液，加入50ul緩沖液，吸取10ul直接進(jìn)行封片。4）熒光顯微鏡觀察（激發(fā)光波長：藍(lán)光激發(fā)，檢測的發(fā)射光波長:510-530nm）5）觀察結(jié)果如下表所示：花粉管微絲呈熒光綠（2） DAPI染色觀察花粉細(xì)胞核 1）DAPI 染色液的配置： 2）制作裝片：用鑷子夾住擬南芥的花，將花粉粘在載玻片上，加入20ul DAPI染色液染液，3-5分鐘后，臨時封片。 3）激發(fā)光：紫外光,發(fā)射光461nm。花粉(白色箭頭所指)內(nèi)有2個生殖核(1)和1個營養(yǎng)核(2)（3） 苯胺藍(lán)染色觀察豌豆下表皮胞間連絲 撕取蠶豆葉片表皮，放在載玻片上，加入20ul 0.1% 苯胺藍(lán)染色3-5分鐘，紫外激發(fā)光下鏡檢。胞間連絲(黑色箭頭所指，略呈綠色)總結(jié)：一、熒光顯微鏡觀察類型原理自發(fā)熒光在生物的某些組織中，經(jīng)紫外線照射后會有熒光發(fā)出，如葉綠素經(jīng)紫外線照射后即可發(fā)出紅色熒光。次生熒光生物組織經(jīng)紫外線照射后，并不立即發(fā)光，它可吸收某些熒光顏料并與之結(jié)合后產(chǎn)生熒光，如鬼筆環(huán)肽、DAPI等。免疫熒光利用抗原抗體反應(yīng)的原理，將熒光染料與抗體結(jié)合，之后再與相應(yīng)抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)一定波長的光激發(fā)后即可發(fā)出熒光。 二、使用熒光顯微鏡觀察裝片時，注意在視野中找到清晰的物象，再移動裝片進(jìn)行觀察取像，避免裝片提前曝光而發(fā)生熒光淬滅。