細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)熒光顯微鏡生物樣品的熒光觀察
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細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)熒光顯微鏡生物樣品的熒光觀察
生物樣品的熒光觀察 生物122 祝洪晨 1202040220目的:初步掌握熒光顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡的結(jié)構(gòu)、原理使用方法及其在細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用。掌握生物材料的熒光染色和活體熒光蛋白的觀察方法。原理:本實(shí)驗(yàn)中微絲的熒光觀察采用熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(phalloidin),鬼筆環(huán)肽專一的結(jié)合聚合狀態(tài)的肌動蛋白絲上,起到穩(wěn)定微絲的作用?;ǚ奂?xì)胞核的觀察采用DAPI染色。DAPI(4,6聯(lián)瞇2苯基吲哚)是一種熒光染料,它與DNA雙螺旋的凹槽部分相互作用,從而與DNA雙鏈緊密結(jié)合,結(jié)合后產(chǎn)生的熒光基團(tuán)的吸收峰是358nm。植物細(xì)胞的花粉管、篩板、和胞間連絲含有胼胝體成分,其經(jīng)過苯胺藍(lán)染色后,用紫外線激發(fā),可發(fā)出黃綠色熒光。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果(1) 熒光標(biāo)記觀察煙草花粉管內(nèi)微絲骨架的分布1)煙花新鮮花粉萌發(fā)液已由教師完成。2)固定:取200ul萌發(fā)液放入離心管中, 靜置沉降,3000rpm離心30秒,吸出培養(yǎng)基,加入200ul 3.6%多聚甲醛(50 mmol/L Pipes配制)固定20分鐘。再吸出固定液,用 Pipes緩沖液清洗三次,每次5分鐘。3)染色:3000rpm離心1分鐘,吸凈緩沖液,加入100nm Alexa Fluo 488 phalloidin 50ul,37度染色20分鐘,洗去染液,加入50ul緩沖液,吸取10ul直接進(jìn)行封片。4)熒光顯微鏡觀察(激發(fā)光波長:藍(lán)光激發(fā),檢測的發(fā)射光波長:510-530nm)5)觀察結(jié)果如下表所示:花粉管微絲呈熒光綠(2) DAPI染色觀察花粉細(xì)胞核 1)DAPI 染色液的配置: 2)制作裝片:用鑷子夾住擬南芥的花,將花粉粘在載玻片上,加入20ul DAPI染色液染液,3-5分鐘后,臨時封片。 3)激發(fā)光:紫外光,發(fā)射光461nm。花粉(白色箭頭所指)內(nèi)有2個生殖核(1)和1個營養(yǎng)核(2)(3) 苯胺藍(lán)染色觀察豌豆下表皮胞間連絲 撕取蠶豆葉片表皮,放在載玻片上,加入20ul 0.1% 苯胺藍(lán)染色3-5分鐘,紫外激發(fā)光下鏡檢。胞間連絲(黑色箭頭所指,略呈綠色)總結(jié):一、熒光顯微鏡觀察類型原理自發(fā)熒光在生物的某些組織中,經(jīng)紫外線照射后會有熒光發(fā)出,如葉綠素經(jīng)紫外線照射后即可發(fā)出紅色熒光。次生熒光生物組織經(jīng)紫外線照射后,并不立即發(fā)光,它可吸收某些熒光顏料并與之結(jié)合后產(chǎn)生熒光,如鬼筆環(huán)肽、DAPI等。免疫熒光利用抗原抗體反應(yīng)的原理,將熒光染料與抗體結(jié)合,之后再與相應(yīng)抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物,經(jīng)一定波長的光激發(fā)后即可發(fā)出熒光。 二、使用熒光顯微鏡觀察裝片時,注意在視野中找到清晰的物象,再移動裝片進(jìn)行觀察取像,避免裝片提前曝光而發(fā)生熒光淬滅。