共聚焦激光掃描熒光顯微鏡簡介以及原理

共聚焦激光掃描熒光顯微鏡什么是共聚焦激光掃描熒光顯微鏡?共聚焦激光掃描熒光顯微鏡(LaserscanningConfocalMicroscopy, LSCM )一以激光作為光源，采用光源針孔與檢測針孔共輒聚焦技 術(shù)，對樣本進行斷層掃描，以獲得高分辨率光學(xué)切片的熒光顯 微鏡系統(tǒng)共聚焦系統(tǒng)細胞CT1WIOE-FIELDCONFOCAL熒光和熒光顯微鏡一、熒光的基礎(chǔ)術(shù)語熒光物質(zhì)：某些物質(zhì)在特定波長范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)出 波長比照射光長的光線一熒光。受激發(fā)后能產(chǎn)生 熒光的物質(zhì)稱熒光物質(zhì)或熒光素激發(fā)光(EXCITATION)：能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內(nèi)的 光線稱為該熒光素的激發(fā)光。;488nm520nm發(fā)射光(EMISSION):異硫氤酸熒光素(FITC)熒光探針：能產(chǎn)生熒光的特異性生物染料(PI,Dapi)、標有熒光素的特異性蛋白結(jié)合物(熒光抗體)自發(fā)熒光(AUTOFLUORESCENCE):漂白(BLEACH)：熒光顯微鏡二、熒光顯微鏡術(shù)的基本原激發(fā)濾鏡:LIGHTBLOCK FILTER光學(xué) 成像DICHROICMinRAR被標記 結(jié)構(gòu)的 熒光光 學(xué)圖像EXCITATIONFIVTFR從光源中分濾出一定波長范圍的激發(fā)光。有寬、窄帶之分。如：BP450-490(LP + KP) : LP450 + KP490雙色鏡：雙色分光鏡；反射短波長，透過長波長。多為長通濾色錢；LP490OBJECTIVESTAGE I488nm520nm450nm490nmFITC1. 無法實現(xiàn)對熒光，透射光的同時采集，無法實現(xiàn)多 重?zé)晒獾耐瑫r采集及共定位。2. 熒光散射光太強，造成實際分辨率的大大下降。3. 熒光漂白及對細胞組織的照射損傷。4. 無法對樣品進行斷層掃描，完成3D的工作。5. 濾鏡對熒光信號衰減大，靈敏度一熒光強度不夠。6. 可以觀查活細胞或組織但細胞或組織內(nèi)結(jié)構(gòu)高度 重疊7. 只能在二維環(huán)境下觀察。&樣品不能太厚。9. 熒光的串繞無法回避。放大倍率小。BE"、/1TZAn ti-vibrat on table 防震臺Computer計算機Microscope 熒 光顯微鏡Laser and electronic Control激光光源及 控制裝置Confocal scan and detector unit共聚焦掃描及檢測裝置 Nikon的 Eclipse Cl Plus 2性能卓越的平場復(fù)消色差TIRF物鏡(60x ,100x) , NA =1.49.o這是當(dāng)前數(shù)值孔徑最 高的油浸物鏡r 2四孔位針孔轉(zhuǎn)盤：用電腦控制針孔的大小, 可在分辨率和光切厚度之間取得最佳平衡。3.時間間隔可變的Time Lapse:可以在拍攝過 程中不同的時間段采用不同的時間間隔。 一、基本組成（一）激光器:多線氮離子（458 nm, 488 nm, 514 nm） > 氨氛綠（543nm）、氨氛紅（633 nm）據(jù)鳳111直信勰魏貞帶）（二）掃描器（內(nèi)裝有針孔光欄、分光鏡、發(fā)射熒光單 色器及檢測器） 4i?的檢測范圍、物鏡和電子放大倍數(shù)（zoom）,以利于采 集容種熒丸【言號。（四）計算機圖像存儲與處理及控制系統(tǒng)：實現(xiàn)了圖像 的優(yōu)化、三維重建，實現(xiàn)了全自動程序化控制采集（檢 測）樣品熒光圖像的時間和空間，并理同時采去樣品中 多重克光信當(dāng)?shù)姆纸饧昂铣蓤D像，對軟進行兔畫測定。 一分辨率（0.1 8|im）二可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)三無損傷、連續(xù)光學(xué)切片（分辨由光源波長，物鏡參數(shù)和針孔直徑等 決定，如60X, NA1.4的物鏡水平分辨率約為0.2 pm,垂直分辨率約為0.5|imo ）（細菌細胞1-2 |im,原核生物細胞1-10 |im）Confocal and Widefield Fluorescence Microscopy(?)(b)(c)利用照明針孔和探測針孔實現(xiàn)點照明和探 測，并且被探測點位于焦平面。照明針孔 與探測針孔對被照射點或被探測點來說是 共杭白勺，因吐被探測點即共焦點。分光鏡ftp.點照明（為作圖方伸已將光線發(fā)散角放大）屯V假設(shè)是場照明（非共聚焦），會導(dǎo)致: 一率堂#謝，使像模糊；二散射光干擾（即除了成像點外，其余 點處有散射光進入探測針孔）;而點照明則不會有這些問題。消除衍射影響消除背景雜光utterfly Wing EpitheliumFigure 3 2焦平面點成像焦前成像焦后成像焦面成像焦平面上的像是最清晰的，從上面的圖可 以看岀，非焦平面點所成的像的光像被探 測針孔擋住，不會進入光探頭，所以焦平 面點成像使像更清晰。所以共聚焦成像方式可以很大的 提高分辨率和成像質(zhì)量。 一. X_Y軸掃描二.Z軸掃描 (1)單光束掃描樓式其中最常見的掃描安排結(jié)合了兩個獨立的 掃描鏡，具有中繼光學(xué)系統(tǒng)。移動的垂直 軸的反射鏡即在試樣上產(chǎn)生XY平面的掃 描。但中間需要增加高級別的像差校正光 學(xué)系統(tǒng)，導(dǎo)致發(fā)光效率降低。(1)單光束掃描模式confocal microscope scanning system掃描鏡中繼光學(xué)系統(tǒng)(2)多光束掃描(尼普可夫圓盤掃描)多光束掃描技術(shù)提供了一個替代的單光束掃描 配置照明效率低，而且掃描速度更快。其中旋 轉(zhuǎn)盤掃描儀有數(shù)百個孔，其功能作為照明和探 測的針孔。由于磁盤掃描顯微鏡形成的實像， 可以直接位于CCD照相機的圖像平面中。盡管 這方面的優(yōu)勢，它允許實時聚焦和成像的動態(tài) 過程，有幾個缺點限制了磁盤掃描共聚焦系統(tǒng) 的實際效用。其中最嚴重的是典型的依賴于傳 統(tǒng)的廣譜光源，和在磁盤發(fā)生極端的光損失。(2)多光束掃描Nipkow Area-S匚日nning 匚onfo匚日I system3Intensity強度調(diào)整密度塔八聰幣“DensityTurret減發(fā)發(fā) Laser Input 射和射 and 柱準首 Beam Collimator 儀Photomultiplier光電倍增器oSupportElectronicsOlympusFluoview 300Laser ConfocalMicroscopeScanningUnitDichromaticMirror雙色鏡Excitation and Emission- Filter Sliders 激發(fā)和 發(fā)射濾 波滑動 器 Figure 1PinholeTurretEmissionDichromaticMirrorX-Y Galvanometer Mirror Scanner ControllerxY檢流計鏡掃描 鍬需neePupil Lens7 SystemScan HeadHousing出入口透 鏡系統(tǒng)奧林巴斯FluoView300激光共聚焦掃描系統(tǒng)同樣可以實現(xiàn)X-Z軸，Y-Z軸掃描通常的方法是通過計算機控制的馬達以預(yù) 先設(shè)定的步距移動顯微鏡的鏡臺然后采集 圖像。（當(dāng)然也有通過改變焦平面位置的方法）通過精細平面光切，形成生物樣品不同平面的精細圖象，將一個連續(xù)的光切圖象Z束 重疊就可形成一個完整的三維圖象Time切片的厚度受物鏡的數(shù)值孔徑和針孔直徑 影響，比如60X, NA1.4的鏡頭當(dāng)針孔設(shè)定 為:Lmm時，光學(xué)切片厚度為0.4微米。Confocal Microscopy information Flow Schematic DiagramComputer3-D ReconstructionCover SlipControlDichroic MirrorVideo Prints, SlidesFrame Store共焦針孔ConfocalPinholeVideo DisplayDigital Hardcopy and BacicupiPhotomuttiplier Tube GamAir Cooled Krypton Argon Laser 空氣冷卻氟激光半Galvanometer檢Scan ControlX-Y Stage Control Fer矗濾光片（屠7 SYNC掃瞄裝置Scanning Unit激發(fā)光濾器E盍蚪一* FifterScanning UnitLow Noise光電倍增管 Photomultiplier Tube-Shutter-Confocal Pinhole Control -Laser PowerFigure 5Filter Wheels 冊 High NA 嘰 Objective - FOptical Lens System|Specimen-I glide