課題3 分解纖維素的微生物的分離

植物果實(shí)在收獲以后，大量的秸稈、葉子剩余植物果實(shí)在收獲以后，大量的秸稈、葉子剩余下來，不僅污染環(huán)境，而且造成了大量的浪費(fèi)。下來，不僅污染環(huán)境，而且造成了大量的浪費(fèi)。導(dǎo)入新課 植物的根、莖、葉植物的根、莖、葉等器官中都含有大量的等器官中都含有大量的纖維素，麻、棉花、麥纖維素，麻、棉花、麥稈、稻草、甘蔗渣等，稈、稻草、甘蔗渣等，都是纖維素的豐富來源。都是纖維素的豐富來源。一般木材中，纖維素占一般木材中，纖維素占4050%。 纖維素是一種重要的碳水化合物，土壤纖維素是一種重要的碳水化合物，土壤中的某些微生物能將其分解利用。中的某些微生物能將其分解利用。 這些微生物之所以能夠?qū)⒗w維素分解利用，這些微生物之所以能夠?qū)⒗w維素分解利用，是因?yàn)樗麄兡軌虍a(chǎn)生是因?yàn)樗麄兡軌虍a(chǎn)生纖維素酶纖維素酶。 為了能更好的應(yīng)用這些微生物造福人類，我為了能更好的應(yīng)用這些微生物造福人類，我們首先要將他們從土壤環(huán)境中種類眾多的微生物們首先要將他們從土壤環(huán)境中種類眾多的微生物中分離出來。中分離出來。 我們已經(jīng)學(xué)習(xí)了怎樣從土壤中我們已經(jīng)學(xué)習(xí)了怎樣從土壤中分離分解尿素的細(xì)菌，你能自己動分離分解尿素的細(xì)菌，你能自己動手設(shè)計(jì)從土壤中分離分解纖維素微手設(shè)計(jì)從土壤中分離分解纖維素微生物的方法嗎？生物的方法嗎？想一想想一想專題專題2 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用從土壤中分離分解維生素的微生物。從土壤中分離分解維生素的微生物。重點(diǎn)與難點(diǎn)（一）（一） 纖維素與纖維素酶纖維素與纖維素酶1、纖維素（、纖維素（cellulose）組成：組成：纖維素是由葡萄糖組纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖。成的大分子多糖。 分布：分布： 纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一類纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一類多糖，占植物界碳含量的多糖，占植物界碳含量的50%以上。棉花中纖維素以上。棉花中纖維素的含量接近的含量接近100%，是最純的天然纖維素來源。，是最純的天然纖維素來源。 作用：作用：纖維素在造紙業(yè)中大量使用，是重要的造紙?jiān)?。纖維素在造紙業(yè)中大量使用，是重要的造紙?jiān)稀?纖維素可以制成甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖纖維素可以制成甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、微晶纖維素等衍生物。維素、微晶纖維素等衍生物。食物中的纖維素（即膳食纖維）對人體的健康也有著食物中的纖維素（即膳食纖維）對人體的健康也有著重要的作用。重要的作用。纖維素纖維素纖維二糖纖維二糖C1酶、酶、Cx酶酶2、纖維素酶、纖維素酶纖維素酶是一種復(fù)合酶纖維素酶是一種復(fù)合酶組成組成 纖維素酶包括三種組成：纖維素酶包括三種組成： 外切酶（外切酶（C1酶）、內(nèi)切酶（酶）、內(nèi)切酶（Cx酶酶) 葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶纖維二糖纖維二糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶作用：作用： 內(nèi)切酶作用于無定形的纖維素區(qū)域，使纖內(nèi)切酶作用于無定形的纖維素區(qū)域，使纖維素?cái)嗔殉善?；維素?cái)嗔殉善危?外切酶作用于纖維素的結(jié)晶區(qū)域或小片段外切酶作用于纖維素的結(jié)晶區(qū)域或小片段纖維素，產(chǎn)生纖維二糖；纖維素，產(chǎn)生纖維二糖； 纖維二糖再由葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。纖維二糖再由葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。 葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶內(nèi)切酶內(nèi)切酶外切酶外切酶內(nèi)切酶內(nèi)切酶葡萄糖葡萄糖（二）（二） 纖維素分解菌的篩選纖維素分解菌的篩選1、剛果紅染色法、剛果紅染色法 在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅剛果紅，在培養(yǎng)基表面生長的纖維素分解菌周圍會在培養(yǎng)基表面生長的纖維素分解菌周圍會產(chǎn)生以菌落為中心透明圈。產(chǎn)生以菌落為中心透明圈。方法一：方法一：先培養(yǎng)微生物，再加入剛果先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)。紅進(jìn)行顏色反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)：這樣顯示出的顏色反應(yīng)基本上是優(yōu)點(diǎn)：這樣顯示出的顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用。纖維素分解菌的作用。缺點(diǎn)：操作繁瑣，加入剛果紅溶液會缺點(diǎn)：操作繁瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發(fā)生混雜。使菌落之間發(fā)生混雜。方法二：方法二：在倒平板時(shí)加入剛果紅。在倒平板時(shí)加入剛果紅。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，不存在菌落混雜問題。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，不存在菌落混雜問題。缺點(diǎn)缺點(diǎn)1：由于在纖維素粉和瓊脂、土豆汁：由于在纖維素粉和瓊脂、土豆汁中都含有淀粉類物質(zhì)，可以使能夠產(chǎn)生淀中都含有淀粉類物質(zhì)，可以使能夠產(chǎn)生淀粉酶的微生物出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。粉酶的微生物出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。缺點(diǎn)缺點(diǎn)2：有些微生物具有降解色素的能力，：有些微生物具有降解色素的能力，他們在長時(shí)間培養(yǎng)過程中會降解剛果紅而他們在長時(shí)間培養(yǎng)過程中會降解剛果紅而形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區(qū)分。區(qū)分。2、剛果紅染色法的原理、剛果紅染色法的原理 剛果紅能與纖維素形成剛果紅能與纖維素形成紅色紅色復(fù)合物，而不與復(fù)合物，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生此反應(yīng)。水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生此反應(yīng)。 當(dāng)在含有纖維素的培養(yǎng)集中加入剛果紅時(shí)，當(dāng)在含有纖維素的培養(yǎng)集中加入剛果紅時(shí)，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅剛果紅纖維素纖維素的復(fù)合物的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。分解菌為中心的透明圈。將樣品涂布到鑒別纖維素分解將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上菌的培養(yǎng)基上土壤取樣土壤取樣選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)梯度稀釋梯度稀釋分離分解纖維素微生物實(shí)驗(yàn)流程示意圖分離分解纖維素微生物實(shí)驗(yàn)流程示意圖挑選產(chǎn)生透明挑選產(chǎn)生透明圈的菌落圈的菌落討論討論 本實(shí)驗(yàn)的流程與課題本實(shí)驗(yàn)的流程與課題2中的實(shí)驗(yàn)流程中的實(shí)驗(yàn)流程有哪些異同？有哪些異同？ 答：課題答：課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分在以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。離得到菌落。 本實(shí)驗(yàn)通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到本實(shí)驗(yàn)通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到繁殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步繁殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。驟基本一致。具體操作步驟：具體操作步驟：1、土樣采集、土樣采集 方法與課題方法與課題2類似。土樣采集要在富含類似。土樣采集要在富含纖維素的環(huán)境中進(jìn)行，如果找不到適合的環(huán)纖維素的環(huán)境中進(jìn)行，如果找不到適合的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，過一個(gè)月左右境，可以將濾紙埋在土壤中，過一個(gè)月左右也會有能分解纖維素的微生物生長。也會有能分解纖維素的微生物生長。思考思考 為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌？素分解菌？ 答：由于生物與環(huán)境的相互依存關(guān)系，答：由于生物與環(huán)境的相互依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分解菌的含在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土樣中獲得目的微量相對提高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。生物的幾率要高于普通環(huán)境。思考思考 將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋進(jìn)土壤多深？濾紙應(yīng)該埋進(jìn)土壤多深？ 答：將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相答：將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的對聚集，實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。適宜環(huán)境。 一般應(yīng)將紙埋于深約一般應(yīng)將紙埋于深約10cm的腐殖土壤中。的腐殖土壤中。2、選擇培養(yǎng)、選擇培養(yǎng) 稱取土樣稱取土樣20g，在無菌條件下加入裝有，在無菌條件下加入裝有30mL培養(yǎng)基的搖瓶中。培養(yǎng)基的搖瓶中。30震蕩培養(yǎng)震蕩培養(yǎng)1-2天，天，至培養(yǎng)基變渾濁。進(jìn)行梯度稀釋和涂布平至培養(yǎng)基變渾濁。進(jìn)行梯度稀釋和涂布平板。板。纖維素粉纖維素粉5.0gNaNO31.0gKH2PO40.9gNa2HPO47H2O1.2gMgSO47H200.5gKCl0.5g水解酪素水解酪素0.5g酵母膏酵母膏0.5g蒸餾水蒸餾水1000mL纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基配方纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基配方鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基配方鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基配方CMC-Na5-10gKH2PO40.25g瓊脂瓊脂15g土豆汁土豆汁100mL酵母膏酵母膏0.5g蒸餾水蒸餾水1000mL3、 剛果紅染色法分離纖維素分解菌剛果紅染色法分離纖維素分解菌 將滅菌后的固體培養(yǎng)基熔化，按無菌操作將滅菌后的固體培養(yǎng)基熔化，按無菌操作要求，在無菌培養(yǎng)皿中倒入要求，在無菌培養(yǎng)皿中倒入15-20mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)基，凝固后待用。凝固后待用。 將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋至將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋至106。 將稀釋好的菌懸液涂布在培養(yǎng)基上，進(jìn)行將稀釋好的菌懸液涂布在培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)至有菌落長出。同時(shí)設(shè)置對照。培養(yǎng)至有菌落長出。同時(shí)設(shè)置對照。1、復(fù)習(xí)微生物技術(shù)、復(fù)習(xí)微生物技術(shù)a培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制b無菌操作技術(shù)無菌操作技術(shù)c稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法d選擇培養(yǎng)基的作用選擇培養(yǎng)基的作用e土壤取樣土壤取樣2、選擇培養(yǎng)的操作方法、選擇培養(yǎng)的操作方法土樣土樣選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)吸取部分吸取部分培養(yǎng)液培養(yǎng)液新鮮的選新鮮的選擇培養(yǎng)基擇培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)稀釋涂布稀釋涂布想想一一想想 為什么選擇培養(yǎng)能夠?yàn)槭裁催x擇培養(yǎng)能夠“濃濃縮縮”所需的微生物？所需的微生物？ 答：在選擇培養(yǎng)條件下，答：在選擇培養(yǎng)條件下，可以使那些能夠適應(yīng)這種營養(yǎng)可以使那些能夠適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的而那些不適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可微生物的繁殖被抑制，因此可以起到以起到“濃縮濃縮”的作用。的作用。視頻一：視頻一：分解纖維素的微生物的分離分解纖維素的微生物的分離1視頻二：視頻二：分解纖維素的微生物的分離分解纖維素的微生物的分離2視頻三：視頻三：分解纖維素的微生物的分離分解纖維素的微生物的分離31、培養(yǎng)基的制作是否合格以及、培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落？選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落？u 對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落長對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落長出說明培養(yǎng)基制作合格。出說明培養(yǎng)基制作合格。u 如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物?？赡塬@得了分解纖維素的微生物。2、分離的結(jié)果是否一致？、分離的結(jié)果是否一致？u 由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)高于真菌和由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細(xì)菌。細(xì)菌。u 由于所取土樣的環(huán)境不同，可能得到真由于所取土樣的環(huán)境不同，可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。纖維素酶發(fā)酵方法纖維素酶發(fā)酵方法:液體發(fā)酵液體發(fā)酵固體發(fā)酵固體發(fā)酵纖維素酶測定方法纖維素酶測定方法: 對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進(jìn)行定量測定生的葡萄糖進(jìn)行定量測定基礎(chǔ)基礎(chǔ)知識知識實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)纖維素纖維素組成組成纖維素酶纖維素酶操作提示操作提示復(fù)習(xí)微生物技術(shù)復(fù)習(xí)微生物技術(shù)分布分布組成組成作用作用剛果紅法剛果紅法作用作用實(shí)驗(yàn)流程圖實(shí)驗(yàn)流程圖纖維素酶測定方法纖維素酶測定方法選擇培養(yǎng)的操作方法選擇培養(yǎng)的操作方法分解分解纖維纖維素的素的微生微生物的物的分離分離 纖維素分解纖維素分解菌的篩選菌的篩選纖維素酶發(fā)酵方法纖維素酶發(fā)酵方法具體操作步驟具體操作步驟原理原理結(jié)果分析與評價(jià)結(jié)果分析與評價(jià)課題延伸課題延伸課堂小結(jié)2 答：流程圖如下。答：流程圖如下。土壤取樣土壤取樣選擇培養(yǎng)（此步是否需要，應(yīng)根選擇培養(yǎng)（此步是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量得多少來確定）據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量得多少來確定） 梯梯度稀釋度稀釋將菌懸液涂布到有特定選擇作用的將菌懸液涂布到有特定選擇作用的培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上挑選單菌落挑選單菌落發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)習(xí)題答案