32號資料+臨床實驗報告

臨床試驗報告目 錄1. 摘要12. 倫理學(xué)和有關(guān)指導(dǎo)原則13. 縮寫說明24. 引言25. 試驗?zāi)康?6. 試驗管理37. 試驗總體設(shè)計及方案48. 試驗設(shè)計及參比藥選擇的依據(jù)49. 受試者選擇510.試驗藥物911.給藥劑量及給藥途徑912.生物樣本采集913.生物樣品分析方法的建立與確證914.數(shù)據(jù)質(zhì)量保證2315.研究結(jié)果數(shù)據(jù)2316.生物等效性評價3517.臨床不良事件觀察及分析3518.主要參考文獻3519.附件目錄36AAAA分散片人體生物等效性試驗研究報告1.摘要本試驗采用HPLC-MS法測定20名健康男性志愿受試者分別口服BBB制藥有限公司提供的AAAA分散片100mg（受試制劑，規(guī)格：100mg/片）或CCC有限責(zé)任公司生產(chǎn)的AAAA分散片100mg（參比制劑，規(guī)格：100mg /片）后不同時刻血漿中AAAA的濃度，繪制了血藥濃度-時間曲線。由血藥濃度-時間數(shù)據(jù)，獲得受試制劑和參比制劑的主要藥代動力學(xué)參數(shù)，采用方差分析和雙單側(cè)檢驗法進行生物等效性判定。用HPLC-MS法測定血漿中AAAA的濃度，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品測定。AAAA標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為20.07000.0 ng/mL，定量下限為20.0 ng/mL，回收率為86.0% 87.4 %；批內(nèi)和批間精密度與準(zhǔn)確度均符合有關(guān)規(guī)定1，符合生物樣品分析要求。受試制劑AAAA的t1/2：3.5 0.9h，Cmax：3949.1 839.4 ng/mL，Tmax：3.3 0.7 h，AUC0-t：25303.37327.7 ngh/mL；參比制劑AAAA的t1/2：3.6 0.9 h，Cmax：3959.0 936.8ng/mL，Tmax：3.3 0.9 h，AUC0-t：25148.27264.4 ngh/mL。以AUC0-t計算，與參比制劑相比受試制劑AAAA的平均相對生物利用度為102.0 % 16.8 %。主要藥代動力學(xué)參數(shù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行方差分析，并進一步采用雙單側(cè)t檢驗和1-2置信區(qū)間法進行生物等效性評價，其中Tmax采用非參數(shù)檢驗法。結(jié)果表明，BBB制藥有限公司研制的AAAA（受試制劑）的AUC0-t、AUC0-和Cmax均拒絕生物不等效假設(shè)。受試制劑中，AAAAAUC0-t的90 %置信區(qū)間為參比制劑的94.2 107.5 %，AUC0-的90 %置信區(qū)間為參比制劑的93.9 107.6 %，Cmax的90 %置信區(qū)間為參比制劑的95.1 105.4 %，受試制劑和參比制劑間的Tmax差異無統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)以上結(jié)果，判定BBB制藥有限公司提供的AAAA分散片100mg（受試制劑，規(guī)格：100mg片）與CCC有限責(zé)任公司生產(chǎn)的AAAA分散片100mg（參比制劑，規(guī)格：100mg片）具有生物等效性。2. 倫理學(xué)和有關(guān)指導(dǎo)原則赫爾辛基宣言（當(dāng)前版本）國際協(xié)調(diào)會（ICH）的GCP原則中華人民共和國國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）頒布的GCP原則中華人民共和國藥品管理法本試驗嚴(yán)格遵守赫爾辛基宣言的有關(guān)倫理準(zhǔn)則，試驗方案經(jīng)獨立倫理委員會（IEC）審核批準(zhǔn)。實驗開始之前，研究人員向受試者說明試驗藥物的性質(zhì)，試驗的目的、方法、試驗的風(fēng)險和自愿參加的原則，并獲得受試者的書面知情同意書。3. 縮寫說明ANOVA方差分析Cmax 達峰濃度（最大血藥濃度）Tmax 達峰時間（達到最大血藥濃度所需的時間）t1/2 消除半衰期AUC血藥濃度-時間曲線下面積AUC0-t零時間到最終采血點的血藥濃度-時間曲線下面積AUC0-零時間到無限大時間的血藥濃度-時間曲線下面積F相對生物利用度DAS 2.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件SPSS16.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件rpm轉(zhuǎn)/分QC質(zhì)控樣品SD標(biāo)準(zhǔn)差RE相對偏差RSD相對標(biāo)準(zhǔn)差Mean平均值4.引言AAAA，其化學(xué)名稱N-(4-硝基-2-苯氧基)甲基磺酰胺分子式：C13H12N2O5S分子量：308.31結(jié)構(gòu)式：AAAA(nimesulide，NI) 是一種非甾體抗炎藥，可選擇性抑制環(huán)氧合酶-2，具有很強的抗炎、解熱和鎮(zhèn)痛作用，并有抑制人中性粒細(xì)胞的突發(fā)性呼吸，消除炎癥時體內(nèi)過多的自由基等多種作用。臨床上用于呼吸道炎癥、風(fēng)濕性和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、手術(shù)后疼痛和水腫等的治療。本品口服吸收迅速完全，健康志愿者口服AAAA片100mg后，平均血峰濃度2.864.58mg/L，達峰時間1.223.83h之間，食物對其吸收速度均無明顯影響，相對生物利用度為54%96%；口服吸收后，廣泛與血漿蛋白結(jié)合，游離型藥物僅占0.7%4.0%，主要分布在細(xì)胞外液，表觀分布容積為0.190.39L/kg。由BBB制藥有限公司生產(chǎn)的AAAA分散片（受試制劑），已經(jīng)由國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)進行臨床研究。該藥與CCC有限責(zé)任公司生產(chǎn)的AAAA分散片（參比制劑）具有相同的給藥途徑和活性成分，按藥品注冊管理辦法可進行人體相對生物利用度和生物等效性試驗。5. 試驗?zāi)康谋驹囼灢捎秒S機交叉方法對20例健康成年男性志愿者，以市售AAAA分散片（CCC有限責(zé)任公司）為參比制劑，研究單劑量口服AAAA分散片（BBB制藥有限公司，受試制劑）相對生物利用度并對生物等效性進行評價（批件號：2009L00656）。6. 試驗管理主要研究者接到遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥理基地臨床試驗任務(wù)后，依據(jù)申辦者提供的資料及查閱參考文獻后，召開臨床試驗方案討論會，與申辦方共同撰寫臨床試驗方案、病例報告表及知情同意書，經(jīng)質(zhì)量保證部門審查合格后提交倫理委員會審核，并在臨床試驗機構(gòu)備案。經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)后，由主要研究者主持召開臨床試驗啟動會，對參加本次試驗的所有人員實施GCP培訓(xùn)，制訂試驗過程中的監(jiān)查、實驗室質(zhì)量控制、統(tǒng)計/數(shù)據(jù)管理、嚴(yán)重不良事件的報告等相關(guān)的各種標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，對研究中可能發(fā)生的問題制訂其處理措施。臨床試驗機構(gòu)根據(jù)試驗藥物的特性和要求，組織招募健康志愿者并進行體檢，經(jīng)體檢合格后進行本研究。試驗期間，有專門醫(yī)師負(fù)責(zé)進行并記錄試驗前后受試者的體溫、脈搏、呼吸和血壓，對可能出現(xiàn)的危急情況備有急救措施，并負(fù)責(zé)危急情況時的急救。研究用藥由該藥理基地專人負(fù)責(zé)接收并對其進行編碼和保管。研究用藥的領(lǐng)取根據(jù)參加試驗的受試者人數(shù)，由研究者在試驗當(dāng)天領(lǐng)取試驗藥物，保管人員詳細(xì)記錄并由研究者簽名和注明日期。因試驗人數(shù)的變動，研究者再領(lǐng)取或退還藥物，應(yīng)做詳細(xì)的記錄。7. 試驗總體設(shè)計及方案本試驗采用隨機分組、雙周期雙交叉試驗的設(shè)計方法。將招募的符合入選標(biāo)準(zhǔn)的20名健康男性志愿受試者隨機分配至2組，每組10人，按表1以相同劑量（100mg）進行給藥，每位受試者均分別交叉口服受試制劑和參比制劑，進行交叉對照和自身對照。交叉服藥前有一周清洗期。表1 給藥方案表分組周期AB周期1TR周期2RTT：受試制劑 R：參比制劑8. 試驗設(shè)計及參比藥選擇的依據(jù)參比制劑的選擇符合藥品注冊管理辦法附件二，并按照臨床研究批件的要求選擇。CCC有限責(zé)任公司生產(chǎn)的AAAA分散片，其與受試制劑具有相同的給藥途徑和活性成分，且在市場中已成主導(dǎo)產(chǎn)品，符合國家有關(guān)規(guī)定和要求1，故采用其作參比制劑。9. 受試者選擇9.1 入選標(biāo)準(zhǔn)1. 健康志愿者，男性，年齡1840歲，且同一批受試者的年齡不宜相差10歲。2. 體重指數(shù)（BMI）在1924BMI=體重kg/(身高m)2之間。3. 無心、肝、肺、腎、消化道、神經(jīng)系統(tǒng)、精神異常及代謝異常等病史。4. 經(jīng)體格檢查血壓、心電圖、呼吸狀況及肝、腎功能、血象均無異常者（或經(jīng)臨床醫(yī)師判斷無臨床意義者）。5. 試驗前2周內(nèi)未服過任何其他藥物。6. 3個月內(nèi)無獻血史。7. 試驗前30天內(nèi)未服過任何試驗藥物。8. 自愿簽署知情同意書。 不符合上述條件之一者，不得作為受試者入選。9.2 排除標(biāo)準(zhǔn)1. 篩選時體格檢查，實驗室檢查或心電圖檢查異常。2. 有肝病史或血清轉(zhuǎn)氨酶超過正常范圍者。3. 在過去的一年中，有酗酒史、嗜煙或藥物濫用史者。4. 入選前3個月內(nèi)，參加過另一藥物試驗者。5. 試驗前2周內(nèi)服用過影響試驗的其他藥物。6. 任何對AAAA藥物過敏者。9.3 剔除標(biāo)準(zhǔn)1. 一次藥未用者；2. 無任何記錄者；3. 采血時間錯誤；4. 用藥劑量與方法錯誤；5. 采血后處理、保藏、運輸方法失誤；6. 使用了影響研究結(jié)果的其它藥物。9.4 終止試驗標(biāo)準(zhǔn)1. 在擬用的治療劑量下，出現(xiàn)了嚴(yán)重不良反應(yīng)（危及生命，或影響正常的一般性工作和生活），應(yīng)終止全部試驗；2. 在擬用的治療劑量下，多數(shù)受試者出現(xiàn)中度不良反應(yīng)，應(yīng)終止全部試驗。9.5 替換原則退出、脫落或被剔除的受試者可進行替換。當(dāng)受試者退出、脫落或被剔除時，替換的受試者應(yīng)采用與退出、脫落或被剔除、的受試者相同的試驗過程。替換的受試者編號加“100”，以便與其他受試者區(qū)別。9.6 入選及體檢情況入選的20名健康男性志愿受試者在被告知所有與藥物有關(guān)的可能不良反應(yīng)后，簽署知情同意書。受試者全面體格檢查均正常（其中包括腎功能、肝功能、血常規(guī)及尿常規(guī)等體格檢查指標(biāo)）。詳見表2-1 2-3。表2-1 受試者自然狀況與試驗分組安排一覽表受試者編碼受試者代碼年齡（y）體重（kg）身高（cm）體重指數(shù)（BMI）試驗周期121YUQI207317623.6TR2ZSMI286516623.6RT3CZHU196017519.6TR4SXYO237017323.4RT5HUJU256316224.0TR6MQFU286016821.3RT7BUTA206918719.7TR8CWLO246017220.3RT9CGYA265616520.6TR10NTHU196717621.6RT11GZJI206017619.4TR12LXJI195516819.5RT13YUYA196517421.5TR14LXBI206017020.8RT15JDSH275516520.2TR16LXTI196518020.1RT17DOKA216016522.0TR18LVNI207517823.7RT19ZHCH226517521.2TR20WKYU246017220.3RT均值226317221.3SD3.25.66.11.6T：受試制劑 R：參比制劑表2-2 受試者實驗體格檢測結(jié)果篩選號受試者編碼.體溫WBC109/LRBC1012/LHGBg/LPLT109/LALTg/LASTg/LCrmol/LBUNmol/L心電圖尿常規(guī)備注12136.26.14.591411981916884.95正常正常入選1236.16.35.331662161030696正常正常入選2336.36.64.861401661325673.97正常正常入選5436.57.55.531622464021724.33正常正常入選10536.34.25.11591942329685.6正常正常入選3636.26.74.931512491119673.96正常正常入選6736.45.24.81512471129534.27正常正常入選13836.26.54.811561962624664.33正常正常入選7936.46.15.31168198917644.43正常正常入選81036.36.04.83138271717654.02正常正常入選141136.54.45.481701772318845.32正常正常入選151236.04.95.351551711910706.85正常正常入選161336.06.74.861481692010825.08正常正常入選171436.27.15.171472801918655.26正常正常入選41536.38.95.14216157917653.93正常正常入選181636.37.24.771471761816663.07正常正常入選191736.16.55.191721222215734.71正常正常入選111836.07.94.931492494029683.35正常正常入選201936.27.05.081582204022764.51正常正常入選92036.14.45.151571963421555.17正常正常入選2136.25.74.681441505732863正常正常未入選表2-3 受試者體格檢測結(jié)果(出組)受試者編碼.體溫WBC109/LRBC1012/LHGBg/LPLT109/LALTg/LASTg/LCrmol/LBUNmol/L心電圖尿常規(guī)136.76.14.51402001613783.96正常正常236.55.94.921551936134784.74正常正常336.54.24.731381381617714.35正常正常436.18.85.311572233333683.17正常正常536.24.45.081582285035804.37正常正常636.27.94.55141246920613.7正常正常736.17.55.01572612024633.99正常正常836.15.64.881591901710884.94正常正常936.76.65.111611811812634.47正常正常1036.54.84.481302121612774.91正常正常1136.24.05.161631731334776.16正常正常1236.17.45.06146145913875.62正常正常1336.28.04.711461691912684.01正常正常1436.26.15.051462881612734.35正常正常1536.28.15.071552121718704.29正常正常1636.17.34.681441871514763.44正常正常1736.15.14.881631372111724.43正常正常1836.16.84.761431993924864.56正常正常1936.17.94.751482413718714.7正常正常2036.15.05.11551863217714.38正常正常10. 試驗藥物受試制劑（T）：AAAA分散片，規(guī)格：100mg /片，批號：XXXXX，由BBB制藥有限公司生產(chǎn)提供；參比制劑（R）：AAAA分散片，規(guī)格：100mg /片，批號：XXXXX，由CCC有限責(zé)任公司生產(chǎn)，BBB制藥有限公司提供。11. 給藥劑量及給藥途徑根據(jù)中國藥典臨床用藥須知2005年版（化學(xué)藥和生物制品卷）及有關(guān)生物等效性研究的文獻資料2 5，確定給藥劑量為單次口服100mg。服藥前禁食過夜10h以上，試驗日晨空腹口服受試制劑1片（100mg /片）或參比制劑1片（用250 mL溫開水送服），并做記錄。 12. 生物樣本采集將符合入選標(biāo)準(zhǔn)的20名健康男性志愿受試者隨機分成兩組，每組10人。服藥前禁食10h以上，試驗日晨空腹口服受試制劑1片或參比制劑1片，用250 mL溫開水送服并做記錄。服藥后2h可飲水，4h進統(tǒng)一清淡飲食。分別于給藥前及給藥后的0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，6.0，8.0，12.0，18.0，24.0 h取靜脈血，每一階段總計取13個點（每點取血5 mL）。置肝素抗凝試管中，所有受試者的血樣收集后應(yīng)，3000 rpm離心10 min，分離血漿，分離出的血漿樣本置于已標(biāo)記好的試管中在- 20 以下的冰箱中儲存待測。13. 生物樣品分析方法的建立與確證13.1儀器、試藥與試劑13.1.1儀器LC系統(tǒng)LC-10ATvp輸液泵日本島津公司MS系統(tǒng)2010EV型單重四極桿質(zhì)譜儀（ESI源）日本島津公司數(shù)據(jù)采集LC-MS Solution 3.0日本島津公司分析天平AB135-S分析天平METTLER TOLEDO公司振蕩器XW-80A旋渦混合器上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠蒸發(fā)儀WM-2H型無油壓縮機天津市醫(yī)療儀器二廠數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計軟件DAS2.0中國藥理學(xué)會離心機SC-2546低速離心機科大創(chuàng)新股份有限公司HC-2516高速離心機科大創(chuàng)新股份有限公司超聲儀KQ5200B型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司13.1.2試藥與試劑AAAA對照品（批號：XXXXX）中國藥品生物制品檢定所內(nèi)標(biāo)對照品 （含量：99.8% 批號：XXXXX）中國藥品生物制品檢定所甲醇（色譜純）國藥集團化學(xué)試劑有限公司乙酸乙酯（分析純）天津市大茂化學(xué)試劑廠二氯甲烷（分析純）天津市大茂化學(xué)試劑廠重蒸水實驗室自制空白血漿沈陽軍區(qū)總醫(yī)院13.2溶液的配制 13.2.1AAAA儲備液及標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制 稱取AAAA對照品約5mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度約0.1 mg/mL的AAAA儲備液。以甲醇-水（50: 50,v/v）稀釋儲備液，配制AAAA標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，如表3所示。表3 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液稀釋過程AAAA（g/mL）Sd7儲備液, 3.5 mL10 mL35.0QC3儲備液, 3.0 mL10 mL30.0Sd6儲備液, 1.5 mL10 mL15.0Sd5儲備液, 0.5 mL10 mL5.0QC2儲備液,1.25 mL50 mL2.5Sd4QC2, 6 mL10 mL1.5Sd3QC2, 2mL10 mL0.5QC1QC2, 1mL10 mL0.25Sd2QC2, 0.8mL10 mL0.2Sd1QC2, 0.4mL10 mL0.113.2.2內(nèi)標(biāo)溶液的配制 取內(nèi)標(biāo)對照品約10 mg，精密稱定，置250 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度約為40.0g/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。各儲備液、標(biāo)準(zhǔn)系列溶液及內(nèi)標(biāo)溶液均以相應(yīng)體積、經(jīng)過校正的量瓶配制，并于4 冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?3.3 色譜/質(zhì)譜條件13.3.1 色譜條件色譜柱：ODS C18柱（150 4.6 mm , 5 m） 大連中匯達科學(xué)儀器有限公司預(yù)柱： ODS C18保護柱（10 4.6 mm） 大連中匯達科學(xué)儀器有限公司流動相：甲醇-水（84:16，v/v）流速： 0.8 mL/min進樣量：5 mL柱溫： 3013.3.2 質(zhì)譜條件ESI源CDL溫度： 200加熱塊溫度： 200霧化氣N2流速：1.5mL/min反吹氣N2流速：0.2mL/min檢測電壓：1.5kv 檢測方式：負(fù)離子 掃描方式：選擇離子監(jiān)測m/z 307.00（AAAA）， m/z295.90（內(nèi)標(biāo)）13.4血漿樣品預(yù)處理方法 取血漿樣品100 L，加入甲醇20 L，內(nèi)標(biāo)溶液50 L，渦旋，加二氯甲烷-乙酸乙酯（4:1，v/v）2 mL，渦旋混合3 min，離心5 min（4000 rpm），分取有機相，于空氣流下吹干，殘渣用流動相定容至2mL，超聲5 min，渦旋 3min，轉(zhuǎn)移至EP管中，離心3 min（12000 rpm），取5L進行分析。13.5分析方法確證13.5.1專屬性試驗AAAA和內(nèi)標(biāo)（內(nèi)標(biāo)物）離子化后，主要生成M-H+準(zhǔn)分子離子峰，分別為m/z307.00和m/z 295.90，將兩者作為定量分析時的監(jiān)測離子。全掃描圖如圖1所示。圖1 AAAA（A）和內(nèi)標(biāo)（B）的全掃描質(zhì)譜圖精密量取6名受試者的空白血漿100 L，除不加內(nèi)標(biāo)溶液外，其余按“血漿樣品預(yù)處理”項下操作，得色譜圖2.1；將一定濃度的AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血漿中，依同法操作，得色譜圖2.2。AAAA的保留時間為3.1 min，內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)的保留時間為2.0 min；取受試者5服用受試制劑2.5 h后的血漿樣品100 L，依同法操作，得色譜圖2.3。上述色譜圖結(jié)果表明，AAAA的保留時間為3.1 min左右，內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)的保留時間為2.0 min左右，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾AAAA和內(nèi)標(biāo)物內(nèi)標(biāo)的測定（為AAAA，為內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)）。 圖2.1 空白血漿樣品色譜圖圖 圖2.2 空白血漿樣品加對照品色譜圖圖2.3 受試者5口服受試制劑2.5h的血漿樣品色譜圖 13.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍取空白血漿100 L，分別加入AAAA系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20 L，配制成相當(dāng)于血漿中AAAA濃度為20.0，40.0, 100.0，300.0，1000.0，3000.0和7000.0 ng/mL的血漿樣品，按“血漿樣品預(yù)處理方法”項下同法試驗，每一濃度進行雙樣本分析，制備AAAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測物濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)X，待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值（AS/Ai）為縱坐標(biāo)Y，用加權(quán)最小二乘法3（權(quán)重系數(shù)：1/X2）進行線性回歸運算，求得的線性回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，用SPSS16.0軟件計算三條標(biāo)準(zhǔn)曲線的差異。結(jié)果表明，AAAA在20.0 7000.0 ng/mLl范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。三天方法學(xué)確證的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見表4，方法學(xué)確證的典型曲線見圖3。表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線（方法確證）測 日線性血漿樣品濃度（ng/mL）20.040.0100.0300.01000.03000.07000.0第一天Y =6.865 10-4 X -8.12010-4R = 0.996719.542.495.3318.11117.82962.56363.020.239.597.4312.51095.62818.26260.4第二天Y = 6.845 10-4 X+1.17010-4R = 0.994522.037.893.9311.21124.52845.86206.219.636.496.4307.91115.83376.26258.9第三天Y = 6.938 10-4 X +1.71310-3R = 0.994420.442.399.2318.61147.52804.96115.019.337.999.8323.91134.02766.96056.0Mean20.239.497.0315.41122.52929.16209.9SD1.02.52.35.817.6228.9110.5日內(nèi)RSD（%）5.5 5.7 1.4 1.1 1.0 7.7 0.9 日間RSD（%）3.8 7.3 3.3 2.6 2.2 8.0 2.6 RE（%）10.0-9.0-6.18.014.712.5-13.5Y =6.865 10-4 X -8.12010-4R = 0.9967 圖3 HPLC-MS法測定血漿中AAAA的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線（方法學(xué)確證第一天）13.5.3 定量下限取空白血漿100 L，加入AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液（100.0 ng/mL）20 L，配制成血漿中AAAA濃度為20.0 ng/mL的血漿樣品（5樣本），按“血漿樣品預(yù)處理方法”項下同法試驗，并根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算每一樣本測得濃度。結(jié)果表明，本試驗所建立的HPLC-MS法測定血漿中AAAA的定量下限可達20.0 ng/mL。詳見表5。表5 AAAA的定量下限血漿樣品濃度（ng/mL）RE%RSD%LLOQ117.9-10.48.2LLOQ220.73.6LLOQ319.3-3.4LLOQ421.99.4LLOQ521.68.213.5.4方法準(zhǔn)確度與精密度取空白血漿100 L，分別加入不同濃度的AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液20 L，配制成相當(dāng)于血漿中AAAA濃度為50.0、500.0和6000.0 ng/mL的血漿樣品（每濃度5樣本），按“血漿樣品預(yù)處理方法”項下同法試驗，并根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血漿樣品的濃度，用SPSS16.0軟件，求得方法的準(zhǔn)確度與精密度。結(jié)果表明，本試驗所建立的HPLC-MS法測定的日內(nèi)和日間精密度的RSD%達到試驗要求1。詳見表6。表6 AAAA準(zhǔn)確度與精密度run血漿樣品濃度（ng/mL）50.0500.06000.0153.4468.36293.648.0501.85928.253.8483.75759.646.5507.46221.154.7511.46545.8252.7504.16262.043.9508.76322.853.1523.26644.947.8491.25844.048.5490.35828.3353.0465.36238.446.1460.15505.947.1521.36189.953.4526.05761.746.6511.36192.7樣品數(shù)151515Mean49.9498.36102.6SD3.621.2317.5RE（%）-12.3-8.010.7日內(nèi)RSD（%）7.5 4.5 5.4 日間RSD（%）5.3 2.1 4.0 13.5.5 重復(fù)進樣考察本試驗考察了在相同試驗條件下重復(fù)進樣的準(zhǔn)確度和精密度。按“方法準(zhǔn)確度與精密度”項下的方法配制低、中、高三濃度的QC樣品（各1個樣本），每個樣品重復(fù)進樣5次，計算血漿樣品的濃度，求得重復(fù)進樣的準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果表明，本試驗所建立的HPLC-MS法重復(fù)進樣的準(zhǔn)確度和精密度達到試驗要求。詳見表7。表7 重復(fù)進樣考察結(jié)果血漿樣品濃度（ng/mL）50.0500.06000.048.1 489.4 5451.4 47.8 488.1 5463.1 49.7 494.1 5453.0 47.3 493.1 5473.2 47.4 487.0 5485.2 樣品數(shù)555Mean48.1 490.3 5465.2 SD1.0 3.1 14.2 RE（%）-5.4-2.6-9.1RSD（%）2.0 0.6 0.3 13.5.6 殘留考察取空白血漿100 L，除不加內(nèi)標(biāo)溶液外，其余按“血漿樣品預(yù)處理”項下操作，制得空白血漿樣品（6樣本分析）；另取空白血漿100 L，加入AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液（35000.0 ng/mL）20 L，配制成血漿中AAAA濃度為7000.0 ng/mL的血漿樣品（4樣本分析），按“血漿樣品預(yù)處理方法”項下操作，于方法學(xué)確證第一天將含藥血漿樣品（濃度7000.0 ng/mL，6樣本，其中兩樣本為標(biāo)準(zhǔn)曲線Sd7）和空白血漿樣品（6樣本）交替進樣。結(jié)果表明，本試驗所建立的HPLC-MS法AAAA和內(nèi)標(biāo)（內(nèi)標(biāo)）均無殘留。13.5.7 提取回收率取空白血漿100 L，按“血漿樣品預(yù)處理”項下的方法配制低、中、高三個濃度（AAAA濃度分別為50.0，500.0，6000.0 ng/mL）的樣品，每一濃度進行5樣本分析；同時另取空白血漿100 L，除不加AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液外，按“血漿樣品處理”項下操作，向獲得的有機相中加入相應(yīng)濃度的AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液20 L和內(nèi)標(biāo)溶液50 L，渦旋混合，空氣流下吹干，以2mL流動相溶解后進樣分析，獲得相應(yīng)峰面積（5次測定的平均值）。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算提取回收率。結(jié)果表明，AAAA血漿樣品的提取回收率符合有關(guān)規(guī)定1，內(nèi)標(biāo)回收率穩(wěn)定。詳見表8。表8 血漿樣品中AAAA和內(nèi)標(biāo)物（內(nèi)標(biāo)）的提取回收率回收率（%）AAAA的血漿濃度(ng/mL)內(nèi)標(biāo)血漿濃度（ng/mL）50.0500.06000.040000.082.289.482.175.080.286.584.187.989.696.996.181.189.283.183.789.888.781.284.488.0樣品數(shù)5555Mean（%）86.087.486.184.4SD（%）4.46.25.76.2RSD（%）5.27.06.67.313.5.8基質(zhì)效應(yīng)本試驗考察了在相同試驗條件下的基質(zhì)效應(yīng)。取空白血漿100 L，除不加AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液外，按“血漿樣品處理”項下操作，向獲得的有機相中加入低、中、高三種濃度的AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液20 L和內(nèi)標(biāo)溶液50 L，渦旋混合，空氣流下吹干，以2mL流動相溶解后進樣分析，獲得相應(yīng)峰面積，每一濃度進行5樣本分析；同時另取相應(yīng)濃度的AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液20 L和內(nèi)標(biāo)溶液50 L，渦旋混合，空氣流下吹干，以2mL流動相溶解后進樣分析，獲得相應(yīng)峰面積（5次測定的平均值）。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，AAAA（低、中、高濃度）和內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果均在85%-115%之間，AAAA和內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)在上述試驗條件下均無基質(zhì)效應(yīng)。詳見表9。表9 基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果基質(zhì)效應(yīng)（%）AAAA的血漿濃度(ng/mL)內(nèi)標(biāo)血漿濃度（ng/mL）50.0500.06000.040000.0104.1108.9102.4106.3135.7103.092.9111.6118.5105.8102.282.7107.9140.295.2111.5114.7103.697.0113.4樣品數(shù)5555Mean（%）114.7112.397.9105.1SD（%）12.915.84.212.8RSD（%）11.314.14.312.213.5.9 穩(wěn)定性試驗 本試驗考察了血漿樣品預(yù)處理前室溫放置24h的穩(wěn)定性、樣品處理后在自動進樣器中（4）放置6h的穩(wěn)定性、血漿樣品經(jīng)歷三次冷凍-解凍循環(huán)的穩(wěn)定性、血漿樣品于冰箱-20保存45天的長期穩(wěn)定性及儲備液的穩(wěn)定性，以試驗樣品的測得值與理論值比較所得結(jié)果考察樣品的穩(wěn)定性。取空白血漿100 L，分別加入不同濃度的AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液20 L，配制成血漿中AAAA濃度為50.0 ,500.0和6000.0 ng/mL的血漿樣品（每濃度5樣本），在室溫下放置24h后，按“血漿樣品處理方法”項下同法試驗。結(jié)果表明，AAAA血漿樣品室溫放置24h穩(wěn)定。詳見表10-1。取空白血漿100 L，分別加入不同濃度的AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液20 L，配制成相當(dāng)于血漿中AAAA濃度為50.0 , 500.0和6000.0 ng/mL的血漿樣品（每濃度5樣本），按“血漿樣品預(yù)處理方法”項下同法試驗，在自動進樣器中（4）放置6h后測定。結(jié)果表明，AAAA血漿樣品預(yù)處理后在進樣器中（4）放置6h穩(wěn)定。詳見表10-2。表10-1AAAA血漿樣品室溫放置24h穩(wěn)定性考察結(jié)果AAAA的血漿濃度(ng/mL)50.0500.06000.045.2488.66263.751.5480.06195.243.6468.95883.347.8466.05880.344.3499.35845.3樣品數(shù)555Mean46.5480.66013.6RE（%）-12.8-6.84.4RSD（%）6.92.93.3表10-2 AAAA血漿樣品預(yù)處理后在自動進樣器中（4）放置6h的穩(wěn)定性AAAA的血漿濃度(ng/mL)50.0500.06000.053.0454.15428.746.5494.95473.050.3461.65922.755.7461.96257.554.6455.76266.5樣品數(shù)555Mean52.0465.65869.7RE（%）11.5-9.2-9.5RSD（%）7.13.66.9取空白血漿100 L，分別加入不同濃度的AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液20 L，配制成相當(dāng)于血漿中AAAA濃度為50.0 , 500.0和6000 .0ng/mL的血漿樣品（每濃度5樣本），在- 20 下冷凍24h，然后在室溫自然解凍。完全解凍后，放回-20 下冷凍不少于12h。第二次在室溫自然解凍，再放回-20 下冷凍不少于12h，第三次在室溫自然解凍后，按“血漿樣品處理方法”項下同法試驗。結(jié)果表明，AAAA血漿樣品經(jīng)過三次冷凍-解凍循環(huán)后穩(wěn)定。詳見表10-3。表10-3 AAAA血漿樣品經(jīng)過三次冷凍-解凍循環(huán)后的穩(wěn)定性AAAA的血漿濃度(ng/mL)50.0500.06000.043.4453.76281.244.8470.25484.143.6468.05501.843.9475.15742.348.0468.76364.1樣品數(shù)555Mean44.8467.15874.7RE（%）-13.2-9.3-8.6RSD（%）4.21.77.2取空白血漿100 L，分別加入不同濃度的AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液20 L，配制成血漿中AAAA濃度為50.0 , 500.0和6000.0 ng/mL的血漿樣品（每濃度5樣本），于冰箱-20保存，45天后按“血漿樣品處理方法”項下同法試驗。結(jié)果表明，于冰箱-20保存的AAAA血漿樣品在45天內(nèi)穩(wěn)定。詳見表10-4。表10-4 AAAA血漿樣品-20保存長期穩(wěn)定性考察結(jié)果AAAA的血漿濃度(ng/mL)50.0500.06000.045.5514.65938.156.9520.55746.548.6505.25694.649.3523.75744.856.9483.96159.5樣品數(shù)555Mean51.4509.65856.7RE（%）13.84.7-5.1RSD（%）10.13.13.3分別于方法學(xué)驗證前十天和方法學(xué)第一天考察AAAA與內(nèi)標(biāo)溶液4 保存的穩(wěn)定性。于方法學(xué)驗證前十天稱取AAAA對照品約5mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度約0.1 mg/mL的AAAA儲備液；精密量取0.5mL儲備液，置50 mL量瓶中，以甲醇-水（50:50,v/v）稀釋至刻度，搖勻，制得濃度約為1.0g/mL的AAAA儲備液；以甲醇-水（50:50,v/v）稀釋儲備液，配制供儲備液穩(wěn)定性分析的AAAA標(biāo)準(zhǔn)系列溶液及樣品1，配制過程如下所示：表10-5 AAAA標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制（供儲備液穩(wěn)定性分析）標(biāo)準(zhǔn)系列溶液稀釋過程AAAA（ng/mL）Sd5儲備液， 0.5mL10mL50.0Sd4儲備液, 0.4mL10 mL40.0Sd3（樣品1） 儲備液， 0.3mL10 mL30.0Sd2儲備液, 0.2mL10 mL20.0Sd1儲備液， 0.1mL10 mL10.0將上述標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分別進樣，制備供儲備液穩(wěn)定性分析的AAAA標(biāo)準(zhǔn)曲線(1)，方程如下：Y=2.972103X+4.383103 (1)測定樣品1的峰面積，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(1)計算樣品1的濃度，結(jié)果見表10-7；稱取內(nèi)標(biāo)對照品約5 mg，精密稱定, 置250 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度約20.0g/mL的內(nèi)標(biāo)（內(nèi)標(biāo)）儲備液；以甲醇-水（50:50,v/v）稀釋儲備液，配制供儲備液穩(wěn)定性分析的內(nèi)標(biāo)（內(nèi)標(biāo)）標(biāo)準(zhǔn)系列溶液及樣品2，配制過程如下所示：表10-6 內(nèi)標(biāo)（內(nèi)標(biāo)）標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制（供儲備液穩(wěn)定性分析）標(biāo)準(zhǔn)系列溶液稀釋過程內(nèi)標(biāo)（ng/mL）Sd5儲備液， 1.0mL10mL2000.0Sd4儲備液, 0.8 mL10 mL1600.0Sd3 儲備液， 0.6mL10 mL1200.0樣品2儲備液， 0.5mL10 mL1000.0Sd2儲備液, 0.4mL10 mL800.0Sd1儲備液， 0.2mL10 mL400.0將上述標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分別進樣，制備供儲備液穩(wěn)定性分析的內(nèi)標(biāo)（內(nèi)標(biāo)）標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=3.051105X+2.240102 (2)測定樣品2的峰面積，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(2)計算樣品2的濃度，結(jié)果見表10-7；樣品1，樣品2 于4冰箱保存，備用。于方法學(xué)第一天分別稱取AAAA對照品和內(nèi)標(biāo)對照品，同法配制供儲備液穩(wěn)定性分析的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別制備供儲備液穩(wěn)定性分析的AAAA和內(nèi)標(biāo)（內(nèi)標(biāo)）標(biāo)準(zhǔn)曲線3,4Y=2.960103X-4.158103 (3)Y=3.133105X+5.126103 (4)取十天前配制的樣品1和樣品2，分別進樣，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(3), (4)計算各自的濃度；將兩次測得的樣品1和樣品2的濃度分別進行獨立樣本t檢驗，結(jié)果表明，AAAA與內(nèi)標(biāo)溶液兩次測得濃度間的差異無統(tǒng)計意義（Sig.> 0.05），AAAA和內(nèi)標(biāo)（內(nèi)標(biāo)）溶液在4 保存十天穩(wěn)定。詳見表10-7，10-8。表10-7 AAAA儲備液穩(wěn)定性考察結(jié)果 AAAA濃度（ng/mL）樣品1（0天）樣品1（10天）MeanSdRSDSig. (2-tailed)表10-8 AAAA標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制（供儲備液穩(wěn)定性分析）內(nèi)標(biāo)（內(nèi)標(biāo)）濃度（g/mL）樣品2（0天）樣品2（10天）MeanSdRSDSig. (2-tailed)13.6 小結(jié) 本試驗建立了HPLC-MS法，測定20名男性健康受試者口服AAAA受試制劑和參比制劑后不同時刻血漿中AAAA的濃度，并進行了方法確證。實驗結(jié)果表明，本方法具有準(zhǔn)確性好、靈敏度高等特點，符合有關(guān)要求1，可以用于AAAA人體相對生物利用度和生物等效性研究。14數(shù)據(jù)質(zhì)量保證試驗過程中監(jiān)察員按規(guī)定進行監(jiān)察，并及時報告。數(shù)據(jù)錄入時，均由2人以上復(fù)核，采用DAS2.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，以保證數(shù)據(jù)的一致性及準(zhǔn)確性，以下給出的數(shù)據(jù)表均按入選號排序。15研究結(jié)果數(shù)據(jù)15.1受試者血漿樣品的測定和質(zhì)量控制受試者血漿樣品由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥物臨床試驗機構(gòu)在冷凍條件下提供。樣品測定按“血漿樣品處理”項下操作，每一分析批建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時分析低、中、高多樣本的質(zhì)控樣品，并穿插于受試者血漿樣品測定中。根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線求算受試者血漿樣品濃度和質(zhì)控樣品濃度，質(zhì)控樣品測定結(jié)果的相對偏差在15%之內(nèi)，低濃度點偏差小于20%，最多允許1/3不在同一濃度的質(zhì)控樣品結(jié)果超限，則當(dāng)日數(shù)據(jù)方可接受。共測試5個分析批樣品，每一分析批標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控樣品結(jié)果分別見表11和表12。表11 測定受試者血漿樣品中AAAA濃度時各分析批的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析日期血藥濃度：20.0，40.0，100.0，300.0，1000.0， 3000.0，7000.0ng/mL受試者斜率10-4截距10-3相關(guān)系數(shù)（R）表12 測定受試者血漿樣品AAAA濃度時各分析批的質(zhì)控樣品測試結(jié)果分析日期AAAA血藥濃度（ng/mL）50.0500.06000.0 測得濃度RE%測得濃度RE%測得濃度RE%15.2 色譜圖詳見附件方法學(xué)確證與100 %受試者樣品測試圖譜。15.3 AAAA血藥濃度-時間曲線20名健康受試者口服AAAA分散片受試制劑和AAAA分散片參比制劑后AAAA的血藥濃度-時間曲線圖及均數(shù)對比圖，見圖4 7。圖4 20名受試者口服受試制劑或參比制劑后AAAA的血藥濃度-時間曲線圖圖5 20名受試者口服AAAA分散片（受試制劑）后AAAA的血藥濃度-時間曲線圖 圖6 20名受試者口服AAAA分散片（參比制劑）后AAAA的血藥