顯微操作技術(shù) 熒光顯微鏡技術(shù)的特點和應(yīng)用

熒光顯微鏡技術(shù)的特點和應(yīng)用 透射式落射式 和傳統(tǒng)顯微技術(shù)相比,熒光顯微技術(shù)具有以下優(yōu)點:(1)熒 光 顯 微 鏡 所 用 光 源 的 波 長 比 傳 統(tǒng) 顯 微 鏡 光 源 的波 長 短 1/2,因 此 熒 光 顯 微 鏡 的 分 辨 能 力 超 出 了 傳統(tǒng) 顯 微 鏡 的 分 辨 率 的 極 限(2)熒 光 顯 微 鏡 技 術(shù) 具 有 高 度 靈 敏 性 和 專 一 性 .它 所用 染 料 的 量 是 極 其 微 小 的 ,只 相 當(dāng) 于 傳 統(tǒng) 顯 微 技 術(shù)中 染 料 消 耗 量 的 幾 千 分 之 一 . (3)熒 光 顯 微 鏡 能 夠 直 接 顯 示 細(xì) 胞 內(nèi) 的 生 物 化 學(xué) 成分 ,并 且 顯 示 的 彩 色 效 果 很 明 亮 ,極 易 觀 察 ,極 易 進行 定 量 分 析 ,而 且 能 以 極 低 濃 度 的 染 料 檢 測 出 含 量極 微 的 物 質(zhì) . (4) 隨 著 新 的 熒 光 染 料 的 發(fā) 明 ,可 不 斷 擴 大 被 測 物質(zhì) 的 范 圍 . 生物學(xué)材料，有各種產(chǎn)生熒光:1.自 發(fā) 熒 光 :或 原 發(fā) 熒 光 細(xì) 胞 組 織 中 自 然 存 在 的 某 些 物 質(zhì) 可 被 激 發(fā) 產(chǎn)生 熒 光2.誘 發(fā) 熒 光 材 料 中 的 某 些 物 質(zhì) 經(jīng) 一 定 的 化 學(xué) 處 理 后 ， 可轉(zhuǎn) 化 為 熒 光 色 團 ， 由 此 被 誘 發(fā) 產(chǎn) 生 熒 光 。 最 常 見的 是 甲 醛 誘 發(fā) 蛋 白 質(zhì) 中 所 含 的 芳 香 乙 胺 基 團 轉(zhuǎn) 化為 熒 光 色 團 。 戊 二 醛 也 能 誘 發(fā) 熒 光 3熒 光 染 料 染 色 ： 應(yīng) 用 含 熒 光 色 團 的 物 質(zhì) 作 為 染 料 ， 使 與 生 物組 織 中 和 該 物 質(zhì) 有 特 殊 親 和 力 的 成 分 相 結(jié) 合 ， 即可 被 激 發(fā) 熒 光 。 這 類 染 料 稱 為 熒 光 染 料 或 熒 色 素 。許 多 常 規(guī) 染 色 劑 (如 剛 果 紅 、 曙 紅 、 堿 性 品 紅 、 水溶 性 苯 胺 藍 等 )兼 有 熒 光 染 料 的 性 能 1.DNA研 究 用 細(xì) 胞 熒 光 測 定 技 術(shù) 測 量 DNA,是 熒 光 顯 微 技 術(shù) 和細(xì) 胞 光 度 技 術(shù) 相 結(jié) 合 的 產(chǎn) 物 ,標(biāo) 志 著 前 者 由 定 性 向定 量 測 定 發(fā) 展 . 吖 啶 橙 3， 6 （ 二 甲 胺 基 ） 吖 啶 鹽 酸 鹽 ， 分 子 式C17H19N3 HCl ZnCl , 分 子 量 438.12g/mol,是 一 種 熒 光 色 素 ， 其 檢 測 激 發(fā) 濾 光 片 波 長 488nm,阻 斷 濾 光 片 波 長 515nm。 吖 啶 橙 染 色 原 理 :吖 啶 橙 可 對 細(xì) 胞 中 的 DNA和 RNA同 時 染色 而 顯 示 不 同 顏 色 的 熒 光 。 其 激 發(fā) 峰 為 492nm， 熒光 發(fā) 射 峰 為 530nm（ DNA） 、 640（ RNA） ， 它 與 雙鏈 DNA的 結(jié) 合 方 式 是 嵌 入 雙 鏈 之 間 ， 而 與 單 鏈 DNA和 RNA則 由 靜 電 吸 引 堆 積 在 其 磷 酸 根 上 。 在 藍 光（ 502nm） 激 發(fā) 下 ， 細(xì) 胞 核 發(fā) 亮 綠 色 熒 光 （ 約530nm） ， 胞 質(zhì) RNA發(fā) 橘 紅 色 熒 光 （ 580nm） 。 它 與 細(xì) 胞 中 DNA和 RNA結(jié) 合 量 存 在 差 別 ， 可 發(fā) 出 不同 顏 色 的 熒 光 ， 與 DNA結(jié) 合 量 少 發(fā) 綠 色 熒 光 ， 與RNA結(jié) 合 量 多 發(fā) 桔 黃 色 或 桔 紅 色 熒 光 。 該 染 料 具 有膜 通 透 性 ， 能 透 過 細(xì) 胞 膜 ， 使 核 DNA和 RNA染 色 。因 此 ， 在 熒 光 顯 微 鏡 下 觀 察 ， 吖 啶 橙 可 透 過 正 常細(xì) 胞 膜 ， 使 細(xì) 胞 核 呈 綠 色 或 黃 綠 色 均 勻 熒 光 。 體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞吖啶橙熒光染色可見含DNA的細(xì)胞核顯示黃綠色熒光，含RNA的細(xì)胞質(zhì)顯示橘紅色熒光 DAPI DAPI即 4,6-二 脒 基 -2-苯 基 吲 哚 (4,6-diamidino-2-phenylindole)， 是 一 種 能 夠 與 DNA強 力 結(jié) 合 的 熒 光 染 料 ， 最 大 吸 收 波 長 為 358nm， 最大 發(fā) 射 波 長 為 461nm。 DAPI染 色 原 理 ： DAPI 為 一 種 熒 光 染 料 ， 可 以 穿 透 細(xì) 胞 膜 與 細(xì)胞 核 中 的 雙 鏈 DNA結(jié) 合 而 發(fā) 揮 標(biāo) 記 的 作 用 ， 可 以 產(chǎn)生 比 DAPI自 身 強 20多 倍 的 熒 光 ， 和 EB相 比 ， 對 雙 鏈DNA的 染 色 靈 敏 度 要 高 很 多 倍 。 顯 微 鏡 下 可 以 看 到顯 藍 色 熒 光 的 細(xì) 胞 ， 熒 光 顯 微 鏡 觀 察 細(xì) 胞 標(biāo) 記 的 效率 高 (幾 乎 為 100 %) ， 且 對 活 細(xì) 胞 無 毒 副 作 用 。 2.細(xì) 胞 壁 研 究 熒 光 顯 微 技 術(shù) 在 植 物 細(xì) 胞 學(xué) 中 應(yīng) 用 的 一 個 突 出方 面 ,是 用 于 鑒 定 細(xì) 胞 壁 成 分 ,研 究 壁 形 成 和 再 生 ,以 及 壁 在 植 物 發(fā) 育 過 程 中 和 環(huán) 境 影 響 下 性 質(zhì) 的 變 化 觀 察 細(xì) 胞 壁 的 方 法 很 多 ,如 用 專 一 的 染 料 染 色或 利 用 纖 維 素 的 偏 振 光 性 質(zhì) 等 。 現(xiàn) 在 國 外 常 用 的 方法 是 熒 光 增 白 劑 染 色 ,在 4QOnm左 右 的 激 發(fā) 光 照 射 下觀 察 細(xì) 胞 壁 (纖 維 素 )所 產(chǎn) 生 的 綠 色 熒 光 來 判 斷 細(xì) 胞壁 的 有 無 熒 光 增 白 劑 染 色 熒 光 增 白 劑 和 細(xì) 胞 壁 成 分 有 強 烈 親 和 力 ,當(dāng) 前 常 用的 熒 光 增 白 劑 有 ST,M2R,VBL.ST開 始 被 用 于 顯 示 細(xì)菌 ,放 線 菌 與 真 菌 的 細(xì) 胞 壁 ,在 粘 菌 材 料 中 ,它 被 證明 與 纖 維 素 和 幾 丁 質(zhì) 有 親 和 力 胼 胝 質(zhì) 是 一 種 以 -1,3鍵 結(jié) 合 的 葡 聚 糖 。 在 植 物的 篩 管 代 謝 、 配 子 體 發(fā) 育 等 生 命 活 動 中 發(fā) 揮 著 重要 的 調(diào) 節(jié) 作 用 ， 其 合 成 、 分 解 直 接 關(guān) 系 植 物 正 常的 生 長 代 謝 過 程 。 胼 胝 質(zhì) 是 一 種 以 -1,3鍵 結(jié) 合 的 葡 聚 糖 。 在 植 物的 篩 管 代 謝 、 配 子 體 發(fā) 育 等 生 命 活 動 中 發(fā) 揮 著 重要 的 調(diào) 節(jié) 作 用 ， 其 合 成 、 分 解 直 接 關(guān) 系 植 物 正 常的 生 長 代 謝 過 程 。 3細(xì) 胞 生 活 力 測 定 熒 光 素 雙 醋 酸 酯 （ FDA） 是 一 種 常 用 的 培 養(yǎng) 動 植 物 細(xì) 胞 以及 植 物 細(xì) 胞 原 生 質(zhì) 體 的 生 活 力 鑒 定 染 料 ， 其 染 色 機 理 也 利用 了 死 活 細(xì) 胞 在 代 謝 上 的 差 異 ： FDA本 身 不 產(chǎn) 生 熒 光 ， 也無 極 性 ， 能 自 由 滲 透 出 入 完 整 的 細(xì) 胞 膜 。 當(dāng) FDA進 入 活 細(xì)胞 后 ， 被 細(xì) 胞 內(nèi) 的 脂 酶 分 解 ， 生 成 有 極 性 的 、 能 產(chǎn) 生 熒 光的 物 質(zhì) 熒 光 素 ， 該 物 質(zhì) 不 能 自 由 透 過 活 的 細(xì) 胞 膜 ， 積累 在 細(xì) 胞 膜 內(nèi) ， 因 而 使 有 活 力 的 細(xì) 胞 產(chǎn) 生 綠 色 熒 光 ； 而 無活 力 的 細(xì) 胞 因 不 能 使 FDA分 解 ， 而 無 法 產(chǎn) 生 熒 光 活體染色vital staining 將無毒或毒性較小的某種染料注入動物體內(nèi),可被機體內(nèi)某些組織或細(xì)胞所攝取,稱為活體. 影 響 熒 光 的 因 素1. pH的 影 響 帶 有 酸 性 或 堿 性 官 能 團 的 大 多 數(shù) 芳 香 族 化 合 物的 熒 光 一 般 都 與 溶 液 PH值 有 關(guān) ， 例 如 ： 在 pH=7-12的 溶 液 中 苯 胺 以 分 子 形 式 存 在 ， 會 發(fā) 出 藍 色 熒 光 ；而 在 pH13的 溶 液 中 苯 胺 以 離 子 形 式 存 在 ，都 不 會 發(fā) 出 熒 光 。 同 時 所 用 酸 的 種 類 也 影 響 熒 光 的 強 度 ， 例 如 ：奎 寧 在 硫 酸 溶 液 中 的 熒 光 比 在 鹽 酸 中 的 要 強 。 2.溫 度 的 影 響 溫 度 對 熒 光 強 度 的 影 響 較 敏 感 。 溶 液 溫 度 下 降時 ， 介 質(zhì) 的 粘 度 增 大 ， 熒 光 物 質(zhì) 與 分 子 的 碰 撞 也 隨之 減 少 ， 去 活 化 過 程 也 減 少 ， 則 熒 光 強 度 增 加 。 相反 ， 隨 著 溫 度 上 升 ， 熒 光 物 質(zhì) 與 分 子 的 碰 撞 頻 率 增加 ， 使 去 活 化 幾 率 增 加 ， 則 熒 光 強 度 下 降 。 3.熒 光 強 度 與 溶 液 濃 度 的 關(guān) 系 在 稀 溶 液 中 ： F Kc F 為 熒 光 強 度 K-檢測 效 率 （ 由 儀 器 決 定 ） c 為 液 體 的 濃 度 高 濃 度 時 ，熒 光 物 質(zhì) 發(fā) 生 熄 滅 和 自 吸 收 現(xiàn) 象 ， 使 F與 c不 呈 線性 關(guān) 系 4猝滅劑 何 為 猝 滅 ? 由 于 某 些 原 因 使 發(fā) 光 材 料 發(fā) 生 非 輻 射 躍 遷 ， 從而 降 低 了 發(fā) 光 效 率 的 現(xiàn) 象 叫 做 猝 滅 在 熒 光 物 質(zhì) 溶 液 中 ,加 入 某 種 化 合 物 ,使 溶 液 的熒 光 強 度 顯 著 降 低 ,這 種 化 合 物 稱 為 猝 滅 劑 猝 滅 作 用 可 能 是 由 于 一 部 分 熒 光 物 質(zhì) 分 子 M與 猝 滅劑 Q作 用 而 生 成 了 配 合 物 MQ,如 配 合 物 MQ的 形 成 是由 于 微 弱 的 范 德 華 引 力 的 作 用 ,則 所 形 成 的 配 合 物并 不 發(fā) 生 熒 光 .在 這 種 情 況 下 ,熒 光 物 質(zhì) 分 子 M和 配合 物 MQ相 對 都 吸 收 光 ,但 配 合 物 吸 收 光 后 不 發(fā) 生 熒光 ,而 將 所 吸 收 的 光 降 解 為 熱 ,唯 有 熒 光 物 質(zhì) M在 吸收 光 之 后 發(fā) 生 熒 光 ,因 此 猝 滅 劑 的 加 入 將 使 熒 光 強度 大 大 降 低 .