熒光顯微鏡的基本使用方法

細(xì) 胞 生 物 學(xué) 實(shí) 驗(yàn)熒 光 顯 微 鏡 的 基 本 使 用 方 法 實(shí) 驗(yàn) 目 的1. 了 解 熒 光 顯 微 鏡 的 基 本 原 理 ； 2. 掌 握 熒 光 顯 微 鏡 的 基 本 結(jié) 構(gòu) 和使 用 注 意 事 項(xiàng) ； 自 發(fā) 性 熒 光 物 質(zhì) 神 經(jīng) 細(xì) 胞 和 心 肌 細(xì) 胞 等 內(nèi) 的 脂 褐 素 呈 棕 黃 色 熒 光 。 肝 貯 脂 細(xì) 胞 和 視 網(wǎng) 膜 色 素 上 皮 細(xì) 胞 內(nèi) 的 維 生 素 A呈綠 色 熒 光 。 某 些 神 經(jīng) 內(nèi) 分 泌 細(xì) 胞 和 神 經(jīng) 纖 維 內(nèi) 的 單 胺 類 物 質(zhì)（ 兒 茶 酚 胺 、 5 羥 色 胺 、 組 胺 等 ） 在 甲 醛 作 用 下呈 不 同 顏 色 的 熒 光 。 組 織 內(nèi) 含 有 的 奎 寧 、 四 環(huán) 素 等 藥 物 也 呈 現(xiàn) 一 定 的熒 光 。 嗜 中 性 粒 細(xì) 胞 中 脫 氫 酶 輔 酶 呈 現(xiàn) 一 定 的 熒 光 。 熒 光 素 激 發(fā) 波 長(zhǎng) 發(fā) 射 波 長(zhǎng) DAPI 372 456 AMCA 350 450 Hoechst33258 365 465 FITC 490 520 AcridineOrange 490 590 AcridineYellow 470 550 CY3 552 565 TRITC 541 572 PropidiumIodide 530 615 優(yōu) 點(diǎn) ：n 檢 出 能 力 高n 對(duì) 細(xì) 胞 的 刺 激 小n 能 進(jìn) 行 多 重 染 色用 途 ：n 物 體 構(gòu) 造 的 觀 察n 熒 光 的 有 無 、 色 調(diào) 比 較 進(jìn) 行 物 質(zhì) 判 別n 發(fā) 熒 光 量 的 測(cè) 定 對(duì) 物 質(zhì) 定 性 、 定 量 分 析熒 光 顯 微 鏡 的 優(yōu) 點(diǎn) 和 用 途 實(shí) 驗(yàn) 原 理光 源 激 發(fā) 濾 色 鏡 分 色 鏡發(fā) 射 濾 色 鏡（ 阻 擋 濾 片 ） 實(shí) 驗(yàn) 原 理熒 光 顯 微 鏡 的 光 路 及 主 要 部 件光 源激 發(fā) 光 擋 片激 發(fā) 濾 色 鏡分 色 鏡發(fā) 射 濾 色 鏡 Microscopes with an upright-style frame are capable of producing fluorescence illumination either through episcopic or diascopic optical pathways, although the latter is rarely used today. Epi-illuminators usually consist of a mercury or xenon lamphouse coupled to a vertical illuminator that is positioned above the main frame in a separate assembly. The microscope nosepiece and transmitted light components (diascopic illuminator, condenser, field diaphragm, filters, etc.) are built into the main frame, while fluorescence components are housed in the vertical illuminator. These illuminators often contain a revolving or sliding turret that houses four to six cubes that contain a mixture of interference filters including a barrier filter, dichroic mirror, and an excitation filter. As illustrated above, light emitted from the lamp positioned in the episcopic lamphouse passes through a collector lens and then the field and aperture diaphragms before entering the first interference filter in the cube set, the emission filter. This light is then directed through the objective and onto the specimen by a special dichroic mirror that reflects certain wavelengths while passing others. Secondary fluorescence, emitted by fluorophores residing in the specimen, travels back through the objective and the dichroic mirror before passing through a barrier filter and into the microscope eyepieces or camera system. 激 發(fā) 光 源 高 壓 汞 燈 擁 有 313, 337, 365, 405, 436, 546, and 577 納 米 的 峰 值 譜 。 高 壓 Xenon燈 有 連 續(xù) 的 可 見 光 光譜 范 圍 , 光 源 強(qiáng) 度 比 較 平 均 。 汞 燈 光 譜 激 發(fā) 濾 色 塊 具 有 多 套 激 發(fā) 濾 色 塊 ： 激 發(fā) 濾 色 鏡 （ Excitation Filter） ， 分光 鏡 （ Dichromatic Mirror） ， 發(fā) 射 濾 色 鏡 （ Emission Filter） 。 激 發(fā) 濾 色 塊 六 孔 激 發(fā) 塊 轉(zhuǎn) 盤 多 用 途 型 BX-RFA(適 合 多 種 科 研 要 求 )及 通 用 型 BX-URA2。 可 同 時(shí) 使 用 6種 熒 光激 發(fā) 塊 ， “ 輕 撥 式 ” 激 發(fā) 塊 轉(zhuǎn) 換 功 能 ， 使 不 同 熒 光 激 發(fā) 之 間 的 迅 速 轉(zhuǎn) 換 非 常 方便 ， 并 可 消 除 震 動(dòng) ， 有 利 于 復(fù) 染 樣 品 的 熒 光 觀 察 。 激 發(fā) 塊 標(biāo) 識(shí) 在 暗 室 環(huán) 境 中 發(fā)光 ， 在 暗 室 中 也 能 很 容 易 地 選 擇 需 要 的 熒 光 激 發(fā) 塊 。 另 外 ， 根 據(jù) 需 要 還 可 以 選擇 6孔 濾 色 片 滑 塊 (U-RSL6/U-RSL6EM)安 放 激 發(fā) 濾 色 片 和 發(fā) 射 濾 色 片 進(jìn) 行 熒 光觀 察 。 BX51 在 鏡 基 上 裝 有 3個(gè) 濾 色片 （ ND6， ND25， LBD） ，另 外 ， 還 可 以 選 裝 第 四 個(gè) 。鏡 基 側(cè) 面 的 拉 桿 可 以 很 容 易地 插 入 /取 出 濾 色 鏡 。Specimen color fading can be delayed by reducing the excitation light intensity with ND filters. Use the ND filters as far as they do not hinder observations. Insert the ND filters (U-25ND6 and/or U-25ND25) with the marked side facing toward the observer. 1、 該 鏡 可 作 為 明 視 場(chǎng) 顯 微 鏡 使 用 ， 也 可 作 為 熒 光顯 微 鏡 使 用 ， 根 據(jù) 需 要 ， 做 相 應(yīng) 的 附 件 連 接 ， 開 啟相 應(yīng) 的 電 源 。 禁 止 亂 調(diào) 設(shè) 置 ， 以 免 影 響 他 人 正 常 使用 。2、 作 為 明 視 場(chǎng) 顯 微 鏡 使 用 ； A、 接 通 電 源 后 ， 打 開顯 微 鏡 底 座 前 的 電 源 開 關(guān) ， 按 光 亮 需 要 調(diào) 節(jié) 底 座 右側(cè) 的 滑 竿 。 B、 根 據(jù) 需 要 ， 調(diào) 節(jié) 底 座 光 柵 和 聚 光 器光 柵 及 其 高 度 ， 可 獲 得 最 佳 的 圖 象 效 果 。 C、 需 要圖 片 ， 要 把 鏡 體 上 的 相 應(yīng) 拉 桿 拉 到 綠 線 位 子 。 按 下相 應(yīng) 附 件 上 的 照 相 按 扭 。3、 作 為 熒 光 顯 微 鏡 使 用 ； A、 先 關(guān) 閉 熒 光 通 道 ， 再打 開 熒 光 激 發(fā) 器 電 源 ， 等 待 15分 鐘 。 B、 等 待 期 間 ，打 開 顯 微 鏡 光 源 ， 找 到 需 要 觀 察 的 樣 品 ， 選 用 合 適的 物 鏡 ， 調(diào) 整 焦 距 。 C、 關(guān) 閉 顯 微 鏡 光 源 ， 打 開 熒光 通 道 。 D、 需 要 圖 片 ， 要 把 鏡 體 上 的 相 應(yīng) 拉 桿 拉到 綠 線 位 子 。 按 下 相 應(yīng) 附 件 上 的 照 相 按 扭 。 細(xì) 胞 核 與 細(xì) 胞 質(zhì) DNA的 直 接 熒 光 染 色 線 粒 體 GFP轉(zhuǎn) 基 因 擬 南 芥根 （ 顯 示葉 綠 體 ） 葉 片 注 意 事 項(xiàng)激 發(fā) 光 擋 片 的 使 用 -減 少 淬 滅 注 意 事 項(xiàng) 熒 光 的 淬 滅 與 激 發(fā) 光 的 照 射 時(shí) 間 成 正 比 ， 因 此 應(yīng) 盡量 減 少 觀 察 時(shí) 間 外 激 發(fā) 光 對(duì) 樣 品 的 照 射 。 激 發(fā) 光 擋片 可 以 部 分 或 完 全 阻 斷 激 發(fā) 光 光 路 。 在 正 式 觀 察 樣品 之 前 ， 激 發(fā) 光 光 路 應(yīng) 該 處 于 完 全 阻 斷 狀 態(tài) 。 否 則 ，在 我 們 將 樣 品 放 到 載 物 臺(tái) 上 ， 移 動(dòng) 樣 品 臺(tái) 將 樣 品 調(diào)整 到 物 鏡 位 置 ， 找 到 要 觀 察 的 細(xì) 胞 并 進(jìn) 行 調(diào) 焦 的 過程 中 ， 樣 品 上 的 熒 光 可 能 已 經(jīng) 發(fā) 生 了 相 當(dāng) 程 度 的 淬滅 。 為 了 避 免 觀 察 前 不 必 要 的 淬 滅 ， 上 述 一 系 列 操作 需 要 在 透 射 光 源 下 進(jìn) 行 。 當(dāng) 眼 睛 離 開 物 鏡 進(jìn) 行 記 錄 或 將 顯 微 鏡 交 給 合 作 實(shí) 驗(yàn)者 觀 察 時(shí) ， 要 隨 手 阻 斷 激 發(fā) 光 光 路 。 實(shí) 踐 結(jié) 果 表 明 ，熟 練 、 規(guī) 范 和 合 理 的 觀 察 操 作 可 以 將 樣 品 淬 滅 對(duì) 觀察 和 記 錄 造 成 的 影 響 降 低 到 最 小 限 度 。 熒 光 信 號(hào) 的 淬 滅 還 與 激 發(fā) 光 的 強(qiáng) 度 成 正 比 。 因 此 ，在 可 以 觀 察 到 熒 光 信 號(hào) 的 情 況 下 ， 應(yīng) 該 盡 量 降 低 激發(fā) 光 的 強(qiáng) 度 。 這 樣 做 還 有 利 于 降 低 背 景 。 NOTES1. The inside of the ultrahigh-pressure mercury burner is very hot and hazardous during lighting and for about 10 minutes after turning off. Do not open the lamp housing in this period.2. The mercury burner has a service life period of 200 hours (USH102D) or 300 hours (HBD103W/2). When the hour counter on the power supply unit indicates this value, set the main switch to “O ” (OFF) and wait for more than 10 minutes before replacing the mercury burner. Unlike electric bulbs, the mercury burner seals high-pressure gas inside. If it continues to be used after the service life has expired, the glass tube may eventually explode due to accumulated distortion. 思 考 題1 根 據(jù) 你 的 觀 察 ， 熒 光 顯 微 鏡 和 光 學(xué) 顯 微 鏡除 了 使 用 同 一 個(gè) 機(jī) 架 以 外 ， 還 共 用 哪 些 部件 ？ 2 一 臺(tái) 高 質(zhì) 量 的 熒 光 顯 微 鏡 在 要 求 熒 光 信 號(hào)充 分 明 亮 的 同 時(shí) ， 還 需 要 沒 有 信 號(hào) 的 視 野充 分 黑 暗 。 請(qǐng) 問 視 野 的 黑 暗 是 怎 樣 實(shí) 現(xiàn) 的 ？3. 你 在 實(shí) 驗(yàn) 中 觀 察 葉 綠 體 用 的 綠 色 激 發(fā) 光 還是 藍(lán) 色 激 發(fā) 光 效 果 比 較 好 ？ 說 明 其 中 的 原因 。