化學發(fā)光免疫分析技術(shù)原理及優(yōu)勢

單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,化學發(fā)光免疫分析,一、,化學發(fā)光免疫技術(shù)的概念,二、,化學發(fā)光免疫分析基本原理,三、化學發(fā)光免疫分析的類型,四、臨床應(yīng)用,五、發(fā)展與展望,一、,化學發(fā)光免疫技術(shù)的,概念,化學發(fā)光免疫技術(shù),：,化學發(fā)光分析是根據(jù)化學反應(yīng)產(chǎn)生的輻射光的強度來確定物質(zhì)含量的分析方法?；瘜W發(fā)光免疫分析是將化學發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用化學發(fā)光相關(guān)的物質(zhì)標記抗體或抗原，與待測的抗原或抗體反應(yīng)后，經(jīng)過分離游離態(tài)的化學發(fā)光標記物，加入化學發(fā)光系統(tǒng)的其它相關(guān)物產(chǎn)生化學發(fā)光，進行抗原或抗體的定量或定性檢測。,化學發(fā)光免疫測定是目前世界公認先進的標記免疫測定技術(shù)，化學發(fā)光免疫分析技術(shù)具有高度的準確性和特異性，成為檢驗方法中最為重要的技術(shù)之一?；瘜W發(fā)光免疫分析技術(shù)作為疾病診斷的主要手段已被廣泛用于機體免疫功能、傳染性疾病、內(nèi)分泌功能、腫瘤標志物、性激素、甲狀腺功能等方面的體外診斷實驗中。,化學發(fā)光免疫分析的優(yōu)勢,靈敏度高,靈敏度高是化學發(fā)光免疫分析關(guān)鍵的優(yōu)越性，其靈敏度可達,10-22 mol/L,（,RIA,為,10-12 mol/L,）?；瘜W發(fā)光免疫分析能夠檢出放射免疫分析和酶聯(lián)免疫分析等方法無法檢出的物質(zhì)，對疾病的早期診斷具有十分重要的意義。,寬的線性動力學范圍,發(fā)光強度在,4,6,個量級之間與測定物質(zhì)濃度間呈線性關(guān)系。這與顯色的酶免疫分析吸光度（,OD,值）為,2.0,的范圍相比，優(yōu)勢明顯。雖然,RIA,也有較寬的線性動力學范圍，但放射性限制了其應(yīng)用。,光信號持續(xù)時間長,輝光型的,CLIA,產(chǎn)生的光信號持續(xù)時間可達數(shù)小時甚至一天。簡化了實驗操作及測量。,分析方法簡便快速,絕大多數(shù)分析測定均為僅需加入一種試劑（或復(fù)合試劑）的一步模式。,結(jié)果穩(wěn)定、誤差小,樣品系直接自己發(fā)光，不需要任何光源照射，免除了各種可能因素（光源穩(wěn)定性、光散射、光波選擇器等）給分析帶來的影響，使分析結(jié)果靈敏穩(wěn)定可靠。,安全性好及使用期長,免除了使用放射性物質(zhì)。到目前為止，還未發(fā)現(xiàn)其危害性；試劑穩(wěn)定，保存期可達一年。,二、化學發(fā)光免疫分析基本原理,化學發(fā)光免疫分析包含兩個部分,即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學發(fā)光分析系統(tǒng)。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將標記物質(zhì)標記在抗原或抗體上,經(jīng)過特異性免疫反應(yīng)后,形成抗原,2,抗體復(fù)合物。然后進行對標記物進行檢測,來測定待檢物?；瘜W發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化,形成一個激發(fā)態(tài)的中間體,當這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時,同時發(fā)射出光子,利用發(fā)光信號測量儀器光量子產(chǎn)率。,2.1,免疫分析原理,免疫分析是利用抗原與抗體特異性結(jié)合形成抗原,2,抗體復(fù)合物而建立起來的一種高選擇性的分析方法,根據(jù)其檢測方法可分為非標記免疫分析和標記免疫分析。非標記免疫分析是利用抗原與抗體結(jié)合形成抗原,2,抗體復(fù)合物后,其理化性質(zhì)發(fā)生改變,出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集等現(xiàn)象,利用這些現(xiàn)象來檢測待檢物。標記免疫分析是在不影響抗原、抗體生物活性的基礎(chǔ)上將標記物質(zhì)標記在抗原或抗體上,然后進行免疫反應(yīng)形成抗原,2,抗體復(fù)合物,再對標記質(zhì)進行檢測,從而間接檢測待檢物的方法。目前常用的標記物有放射性的,125 I,非放射性的堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶,鑭系稀土元素等。,2.2,化學發(fā)光原理,化學發(fā)光,(Chemiluminescence,CL),是化學物質(zhì)在特定化學反應(yīng)中產(chǎn)生的光輻射。通過高能中間體的分解在化學反應(yīng)中激發(fā)單態(tài)分子形成,分子被激發(fā)后是不穩(wěn)定的,它要釋放出多余的能量而回到基態(tài),其中部分的能量以發(fā)光形式釋放出來。因此,任何一個化學發(fā)光反應(yīng)包括兩個過程,:,激發(fā)和發(fā)光過程。一些激發(fā)態(tài)分子能量也會通過系間串躍和系內(nèi)串躍而消失。因此,化學發(fā)光反應(yīng)的效率是,:,CL=CEEM (1),式中,CL,為化學發(fā)光效率,CE,為生成激發(fā)態(tài)的效率,EM,為激發(fā)態(tài)的發(fā)光效率。,CE,和,EM,分別定義為：,CE=,生成激發(fā)態(tài)的分子數(shù),/,參加反應(yīng)的分子數(shù),(2),EM=,發(fā)光的分子數(shù),/,生成激發(fā)態(tài)的分子數(shù),(3),從,(1),、,(2),、,(3),式得化學發(fā)光的效率,CL,等價于生成熒光和磷光的量子效率。即,:,CL=,發(fā)光的分子數(shù),/,參加反應(yīng)的分子數(shù),(4),2.3,化學發(fā)光免疫分析的原理,化學發(fā)光免疫分析法是化學發(fā)光和免疫分析結(jié)合的產(chǎn)物。它同時具有化學發(fā)光法的高靈敏度和免疫分析法的高選擇性。化學發(fā)光免疫分析是用化學發(fā)光反應(yīng)的試劑標記抗原或抗體,標記后的抗原和抗體與待測物經(jīng)過一系列的免疫反應(yīng)和理化步驟,最后以測定發(fā)光強度形式測定待測物的含量。,三、化學發(fā)光免疫分析的類型,化學發(fā)光免疫分析法根據(jù)其標記物的不同可分為三大類,即化直接化學發(fā)光免疫分析、化學發(fā)光酶免疫分析和電化學發(fā)光免疫分析法。,用吖啶酯直接標記抗體,(,抗原,),，與待測標本中相應(yīng)的抗原,(,抗體,),發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體,-,待測抗原,-,吖啶酯標記抗體復(fù)合物，這時只需加入氧化劑（,H,2,O,2,）和,NaOH,使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。,由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標準曲線上計算出待測抗原的含量。,3.1 直接化學發(fā)光免疫分析,發(fā)光,Y,Y,Y,磁微粒,被測抗原,+,抗體,+,帶吖啶酯標記物抗體,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,沖洗后,-,夾心法,（,1,）,加入,H,2,O,2,（,pH10）,直接化學發(fā)光的機理,磁,微粒,模式圖,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,特點,抗原和抗體結(jié),合與未,結(jié)合部分,的,易,分離,磁微粒,技術(shù),化學發(fā)光酶免疫分析,（,chemiluminescence enzyme,immunoassay,，,CLEIA,）是用參與催化某一化學發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（,HRP,）,或堿性磷酸酶,(ALP),來標記抗原或抗體，在與待測標本中相應(yīng)的抗原,(,抗體,),發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體,-,待測抗原,-,酶標記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物,(,發(fā)光劑,),，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它們傳送至計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。,3.2、化學發(fā)光酶免疫分析,該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（,HRP,）標記抗體,(,或抗原,),，在與反應(yīng)體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體,-,待測抗原,-,酶（,HRP,）標記抗體復(fù)合物，這時加入魯米諾發(fā)光劑、,H,2,O,2,和化學發(fā)光增強劑使產(chǎn)生化學發(fā)光。,辣根過氧化物酶標記的化學發(fā)光免疫分析,辣根過氧化物酶標記化學發(fā)光免疫分析示意圖,該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶 標記抗體,(,或抗原,),，在與反應(yīng)體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體,-,待測抗原,-,酶標記抗體復(fù)合物，這時加入,AMPPD,發(fā)光劑，堿性磷酸酶使,AMPPD,脫去磷酸根基團而發(fā)光。,堿性磷酸酶標記的化學發(fā)光免疫分析,堿性磷酸酶標記化學發(fā)光免疫分析示意圖,分析步驟,分配樣品,磁顆粒,和試劑,孵育,使反應(yīng)物,結(jié)合,在磁場中,清洗去除,未結(jié)合物質(zhì),加入,底物,產(chǎn)生,信號,孵育,促使信號,的產(chǎn)生,信號,檢測,電化學發(fā)光免疫分析,（,electrochemiluminescence immunoassay,，,ECLIA,）,是以電化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標記,抗體,(,抗原,),，以三丙胺,(TPA),為電子供體，,在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學發(fā)光,反應(yīng)，它包括電化學和化學發(fā)光兩個過程。,3.3 電化學發(fā)光免疫分析,在電化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體包被抗體,(,抗原,),，用三聯(lián)吡啶釕標記抗體,(,抗原,),，在反應(yīng)體系內(nèi)待測標本與相應(yīng)的抗原,(,抗體,),發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成磁性微粒包被抗體,-,待測抗原,-,三聯(lián)吡啶釕標記抗體復(fù)合物，這時將上述復(fù)合物吸入流動室，同時引人,TPA,緩沖液。當磁性微粒流經(jīng)電極表面時，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標記抗體和標本被緩沖液沖走。與此同時電極加壓，啟動電化學發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和,TPA,在電極表面進行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學發(fā)光，光的強度與待測抗原的濃度成正比。,電化學發(fā)光免疫分析示意圖,電化學發(fā)光免疫測定示意圖,標記磁顆粒在電場中發(fā)光工作示意圖,四、臨床應(yīng)用,1.,甲狀腺激素,2.,生殖激素,3.,腎上腺,/,垂體激素,4.,貧血因子,5.,腫瘤標記物,6.,感染性疾病,7.,糖尿病,8.,心血管系統(tǒng),9.,病毒標記物,10.,骨代謝,11.,過敏性疾病,12.,治療藥物監(jiān)測,五、發(fā)展與展望,化學發(fā)光免疫分析法具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、設(shè)備簡單等優(yōu)點，近年來在環(huán)境、臨床、食品、藥物檢測中得到了廣泛運用。實際檢測常常需要對大量、復(fù)雜、低豐度的樣品進行測定，因而化學發(fā)光免疫分析法逐漸向快速、高通量、高靈敏檢測的方向發(fā)展。近幾年化學發(fā)光免疫分析法的研究方向主要涉及到降低溫育時間，多組分檢測，以及信號放大技術(shù)等。這些例子都證明了化學發(fā)光免疫分析法具有廣泛的應(yīng)用前景和可操作性。,此外，化學發(fā)光成像技術(shù)、化學發(fā)光免疫分析與分離技術(shù)的聯(lián)用，可以使免疫分析的選擇性、靈敏度和檢測速度、檢測通量得到進一步提高。為了更好地適應(yīng)臨床、環(huán)境等領(lǐng)域的實際應(yīng)用，需要大力發(fā)展微型化、集成化和自動化的化學發(fā)光免疫分析儀器。隨著分子生物學及納米與傳感技術(shù)的進步，新的化學發(fā)光免疫分析原理與高靈敏的免疫分析方法將得到不斷發(fā)展，開發(fā)催化活性更高、穩(wěn)定性更好、發(fā)光動力學曲線更符合免疫分析的酶和底物并推廣到臨床檢測，發(fā)展新型標記技術(shù)用于信號放大，建立化學發(fā)光免疫分析新方法，都將是未來的發(fā)展方向及研究重點。,