實驗2熒光顯微鏡的使用

任 課 教 師 ： 齊 云 峰細 胞 生 物 學 實 驗 熒 光 顯 微 鏡 的 使 用實 驗 二 實 驗 目 的掌 握 熒 光 顯 微 鏡 的 結(jié) 構(gòu) 、 原 理及 其 使 用 方 法 。 實 驗 用 品熒 光 顯 微 鏡 及 熒 光 裝 置 附 件 。人 口 腔 上 皮 細 胞 裝 片 ， 植 物 莖 部 組織 裝 片 。 實 驗 原 理熒 光 顯 微 鏡 是 一 種 較 為 常 用 的 光 學 顯 微 鏡 。 它是 由 光 源 、 濾 色 鏡 系 統(tǒng) 和 光 學 系 統(tǒng) 等 主 要 部 件 組 成。 其 基 本 原 理 是 利 用 一 定 波 長 的 激 發(fā) 光 對 樣 品 進行 激 發(fā) ， 使 之 產(chǎn) 生 一 定 波 長 的 熒 光 ， 從 而 用 于 對 樣品 結(jié) 構(gòu) 或 其 組 分 進 行 定 性 、 定 位 、 定 量 觀 察 檢 測 。 透 射 熒 光 顯 微 鏡 的 構(gòu) 造 透 射 熒 光 顯 微 鏡 原 理 透 射 熒 光 顯 微 鏡 原 理 反 射 熒 光 顯 微 鏡 原 理 汞 燈 激 發(fā) 濾 色 鏡分 色 鏡吸 收 濾 色 鏡物 鏡 標 本 實 驗 原 理某 些 物 質(zhì) 經(jīng) 波 長 較 短 的 光 照 射 后 ， 分 子 被 激活 ,吸 收 能 量 后 呈 激 發(fā) 態(tài) 。其 能 量 部 分 轉(zhuǎn) 化 為 熱 能 或 用 于 光 化 學 反 應 外， 相 當 一 部 分 則 以 波 長 較 長 的 光 能 形 式 輻 射 出 來 ，這 種 波 長 長 于 激 發(fā) 光 的 可 見 光 稱 為 熒 光 。熒 光 顯 微 鏡 是 利 用 一 定 波 長 的 光 激 發(fā) 標 本 發(fā)射 熒 光 ， 通 過 物 鏡 和 目 鏡 系 統(tǒng) 放 大 以 觀 察 標 本 的 熒光 圖 像 。 什 么 是 熒 光 ?物 質(zhì) 中 的 電 子 吸 收 光 的 能 量 由 低 能狀 態(tài) 轉(zhuǎn) 變 為 高 能 狀 態(tài) ， 再 回 到 低 能 狀 態(tài)時 釋 放 出 的 光 。即 ： 物 質(zhì) 吸 收 短 波 光 ， 發(fā) 射 出 的 長 波 光。 保 持 固 有 的 熒 光 特 性n熒 光 波 長 激 發(fā) 波 長n熒 光 強 度 極 小 于 激 發(fā) 光 的 強 度n有 不 同 程 度 的 衰 減n熒 光 強 度 取 決 于 激 發(fā) 光 強 度 、 被 檢 物 濃 度 、熒 光 效 率熒 光 的 性 質(zhì) 優(yōu) 點 ：n 檢 出 能 力 高n 對 細 胞 的 刺 激 小n 能 進 行 多 重 染 色用 途 ：n 物 體 構(gòu) 造 的 觀 察n 熒 光 的 有 無 、 色 調(diào) 比 較 進 行 物 質(zhì) 判 別n 發(fā) 熒 光 量 的 測 定 對 物 質(zhì) 定 性 、 定 量 分 析熒 光 顯 微 鏡 的 優(yōu) 點 和 用 途 熒 光 光 源 的 作 用熒 光 光 源 不 是 作 為 照 明 的 ， 而 是作 為 熒 光 色 素 產(chǎn) 生 熒 光 的 激 發(fā) 光。 實 驗 原 理熒 光 有 兩 種 類 型 ， 一 種 是 標 本 自 身 的 原 有 熒 光 （ 自 發(fā)熒 光 ） ， 另 一 種 是 利 用 熒 光 色 素 和 細 胞 的 特 定 部 分 反 應 所 產(chǎn)生 的 熒 光 （ 次 生 熒 光 ） 。自 發(fā) 熒 光 ： 在 生 物 的 某 些 組 織 中 ， 經(jīng) 紫 外 線 照 射 后 能直 接 發(fā) 射 出 熒 光 的 稱 為 自 發(fā) 熒 光 （ 或 直 接 熒 光 ） 。 如 植 物 組織 中 的 葉 綠 素 ， 經(jīng) 紫 外 線 照 射 后 ， 即 可 發(fā) 出 紅 色 熒 光 。次 生 熒 光 ： 有 些 生 物 組 織 經(jīng) 紫 外 線 照 射 后 ， 并 不 能 發(fā)出 熒 光 ， 但 是 當 它 吸 收 熒 光 染 料 后 也 可 以 產(chǎn) 生 熒 光 ， 稱 為 次生 熒 光 （ 或 間 接 熒 光 ） 。 如 吖 啶 橙 ， DAPI均 可 檢 測 細 胞 內(nèi) 的核 酸 。 熒 光 顯 微 鏡 的 基 本 結(jié) 構(gòu) 組 成 一 、 光 源 由 于 標 本 發(fā) 出 的 熒 光 和 激 發(fā) 光 相 比 ， 是 非 常 微 弱 的 ，因 此 熒 光 顯 微 鏡 的 光 源 強 度 必 須 很 高 ， 所 以 對 于 熒 光 顯 微鏡 的 光 源 我 們 通 常 采 用 高 壓 汞 燈 。汞 燈 能 以 最 小 的 表 面 發(fā) 出 最 大 數(shù) 量 的 紫 外 光 和 藍 光， 且 光 亮 度 大 ， 光 度 穩(wěn) 定 。 它 是 用 石 英 玻 璃 制 作 ， 中 間 呈球 形 ， 有 兩 個 鎢 電 極 ， 內(nèi) 充 一 定 數(shù) 量 的 汞 和 少 量 氬 氖 混 合氣 體 。 一 、 光 源工 作 時 由 兩 個 電 極 間 放 電 ， 引 起 水 銀 蒸 發(fā) ， 球 內(nèi) 氣壓 迅 速 升 高 ， 當 水 銀 完 全 蒸 發(fā) 時 ， 可 達 50 70個 標 準 大 氣壓 力 ， 這 一 過 程 一 般 約 需 5 15min。超 高 壓 汞 燈 的 發(fā) 光 是 電 極 間 放 電 使 水 銀 分 子 不 斷 解離 和 還 原 過 程 中 發(fā) 射 光 量 子 的 結(jié) 果 。 它 發(fā) 射 很 強 的 紫 外 和藍 紫 光 ， 足 以 激 發(fā) 各 類 熒 光 物 質(zhì) 。超 高 壓 汞 燈 也 散 發(fā) 大 量 熱 能 。 因 此 ， 燈 室 必 須 有 良好 的 散 熱 條 件 ， 工 作 環(huán) 境 溫 度 不 宜 太 高 。 200W超 高 壓 汞 燈 的 平 均 壽 命 ， 在 每 次 使 用 2h的情 況 下 約 為 200h， 開 動 一 次 工 作 時 間 愈 短 ， 則 壽 命愈 短 ， 如 開 一 次 只 工 作 20min， 則 壽 命 降 低 50%。因 此 ， 使 用 時 盡 量 減 少 啟 動 次 數(shù) 。 燈 泡 在 使 用過 程 中 其 光 效 是 逐 漸 降 低 的 。 燈 熄 滅 后 要 等 待 冷 卻才 能 重 新 啟 動 。點 燃 燈 泡 后 不 可 立 即 關(guān) 閉 ， 以 免 水 銀 蒸 發(fā) 不 完全 而 損 壞 電 極 ， 一 般 需 要 等 15min。一 、 光 源 超 高 壓 汞 燈 （ 100W或 200W） 光 源 的 電 路 和 包括 變 壓 、 鎮(zhèn) 流 、 啟 動 幾 個 部 分 。在 燈 室 上 有 調(diào) 節(jié) 燈 泡 發(fā) 光 中 心 的 系 統(tǒng) ， 燈泡 球 部 后 面 安 裝 有 鍍 鋁 的 凹 面 反 射 鏡 ， 前 面 安 裝 有集 光 透 鏡 。由 于 超 高 壓 汞 燈 壓 力 很 高 ， 紫 外 線 強 烈 ， 因此 燈 泡 必 須 置 燈 室 中 方 可 點 燃 ， 以 免 傷 害 眼 睛 和 發(fā)生 爆 炸 時 造 成 操 作 。一 、 光 源 濾 色 鏡 按 用 途 或 功 能 ， 主 要 分 為 兩 類 ：1、 激 發(fā) 濾 色 鏡 （ exciter filter）對 于 光 源 發(fā) 出 的 混 合 光 ， 選 擇 透 過 能 使 標 本 產(chǎn)生 熒 光 的 特 定 波 長 的 光 ， 同 時 阻 擋 對 激 發(fā) 熒 光 無 關(guān) 的光 。 熒 光 染 料 均 有 一 定 的 吸 收 光 譜 （ 激 發(fā) 峰 值 ） ，利 用 濾 色 鏡 對 光 線 選 擇 吸 收 的 能 力 ， 選 用 其 透 射 光 譜， 恰 為 熒 光 染 料 的 最 大 吸 收 光 譜 （ 激 發(fā) 峰 值 ） 的 激 發(fā)濾 色 鏡 ， 以 便 從 汞 燈 發(fā) 出 的 廣 譜 光 波 中 ， 選 擇 透 過 最宜 波 段 的 光 線 供 用 。二 、 濾 色 鏡 系 統(tǒng) 2、 阻 擋 濾 色 鏡 （ barrier filter）阻 擋 濾 色 鏡 是 用 來 阻 擋 掉 沒 有 被 標 本 吸 收 的 激發(fā) 光 和 某 些 波 長 較 短 的 光 線 以 及 沒 有 被 選 擇 透 過 的 熒光 ， 以 防 傷 害 眼 睛 。阻 擋 濾 色 鏡 的 選 用 ， 應 視 熒 光 染 料 的 熒 光 光 譜而 定 ， 要 能 夠 最 大 限 度 的 透 過 所 需 熒 光 并 阻 斷 短 波 光以 及 不 需 要 波 長 的 熒 光 。二 、 濾 色 鏡 系 統(tǒng) 濾 鏡 一 般 都 以 基 本 色 調(diào) 命 名 ， 前 面 字 母 代 表 色 調(diào) ， 后面 字 母 代 表 玻 璃 ， 數(shù) 字 代 表 型 號 特 點 。如 德 國 產(chǎn) 品 （ Schott） BG12， 就 是 種 藍 色 玻 璃 ， B是藍 色 的 第 一 個 字 母 ， G是 玻 璃 的 第 一 個 字 母 ；我 國 產(chǎn) 品 的 名 稱 已 統(tǒng) 一 用 拼 音 字 母 表 示 ， 如 相 當 于BG12的 藍 色 濾 鏡 名 為 QB24， Q是 青 色 （ 藍 色 ） 拼 音 的 第 一 個字 母 ， B是 玻 璃 拼 音 的 第 一 個 字 母 。不 過 有 的 濾 鏡 也 可 以 透 光 分 界 波 長 命 名 ， 如 K530， 就是 表 示 阻 擋 波 長 530nm以 下 的 光 而 透 過 530nm以 上 的 光 。 還 有的 廠 家 的 濾 鏡 完 全 以 數(shù) 字 命 名 ， 如 美 國 Corning廠 的 NO.5-58， 即 相 當 于 BG12。 二 、 濾 色 鏡 系 統(tǒng) 3、 二 向 色 鏡 （ DM） 二 向 色 鏡 位 于 汞 燈 激 發(fā) 濾 色 鏡 構(gòu) 成 的 平 行 光 軸 與 目 鏡和 物 鏡 構(gòu) 成 的 豎 直 光 軸 的 兩 軸 垂 直 相 交 處 ,斜 向 安 裝 于 光 路 之 中。 與 照 明 光 路 成 45 角 ， 承 擔 色 光 的 分 流 作 用 。二 向 色 鏡 對 激 發(fā) 光 波 長 的 光 （ 即 透 過 激 發(fā) 濾 光 片 的 光 ）， 有 很 高 的 反 射 率 。而 對 由 標 本 發(fā) 出 的 熒 光 波 長 區(qū) 的 光 ， 則 有 很 高 的 透 射 率， 即 二 色 向 鏡 起 著 反 射 激 發(fā) 光 和 透 過 熒 光 的 重 要 作 用 。 二 、 濾 色 鏡 系 統(tǒng) 一 個 濾 光 鏡 系 統(tǒng) （ 即 一 個 濾 光 塊 ） 由 激 發(fā) 濾 色鏡 、 二 向 色 鏡 、 阻 擋 濾 色 鏡 （ 三 部 分 組 成 。 通 過 以 上 激 發(fā) 濾 光 片 、 二 向 色 鏡 、 阻 擋 濾 光 片的 相 應 組 合 ， 可 以 形 成 多 種 不 同 的 激 發(fā) 方 法 ， 如 紫外 （ UV） 、 紫 （ V） 、 蘭 （ B） 和 綠 （ G） 等 （ 這 些名 稱 是 以 激 發(fā) 光 主 波 長 的 顏 色 而 定 的 ） 。 尼 康 所 提 供 的 濾 光 塊 種 類 很 多 ， 按 客 戶 要 求 選擇 配 套 。 二 、 濾 色 鏡 系 統(tǒng) 熒 光 顯 微 鏡 按 激 發(fā) 光 對 樣 品 的 激 發(fā) 方 向或 方 式 ， 分 有 兩 種 ：1 透 射 式 熒 光 顯 微 鏡2 反 射 式 （ 落 射 式 ） 熒 光 顯 微 鏡三 、 熒 光 顯 微 鏡 的 光 路 激 發(fā) 光 束 通 過 聚 光 器 穿 過 標 本 材 料 來 激 發(fā) 熒光 的 ， 誘 發(fā) 的 熒 光 從 物 鏡 前 方 進 入 物 鏡 。 這 是 比 較舊 式 的 熒 光 顯 微 鏡 。其 優(yōu) 點 是 低 倍 鏡 時 熒 光 強 ， 而 缺 點 是 隨 放 大倍 數(shù) 增 加 其 熒 光 減 弱 ， 所 以 對 觀 察 較 大 的 標 本 材 料較 好 。1 透 射 式 熒 光 顯 微 鏡 透 射 熒 光 顯 微 鏡 原 理 透 射 熒 光 顯 微 鏡 原 理 透 射 熒 光 顯 微 鏡 的 構(gòu) 造 這 是 近 代 發(fā) 展 起 來 的 新 式 熒 光 顯 微 鏡 ， 是 激 發(fā)光 從 物 鏡 后 部 進 入 物 鏡 ， 向 下 落 射 樣 品 ， 激 發(fā) 出 熒光 ， 熒 光 反 射 向 上 再 進 入 物 鏡 。2 反 射 式 熒 光 顯 微 鏡 反 射 熒 光 顯 微 鏡 原 理 汞 燈 激 發(fā) 濾 色 鏡分 色 鏡吸 收 濾 色 鏡物 鏡 標 本 反 射 熒 光 顯 微 鏡 的 構(gòu) 造吸 收 濾 色 鏡激 發(fā) 濾 色 鏡分 色 鏡紫 外 線保 護 罩 孔 徑 光 欄 （ FS）視 場 光 欄 （ AS） 反 射 式 熒 光 顯 微 鏡 原 理落 射 光 激 發(fā) 的 熒 光 法 是 近 代 顯 微 鏡 檢 術(shù) 中新 發(fā) 展 出 來 的 一 種 強 有 力 的 反 差 增 強 法 。它 將 激 發(fā) 熒 光 用 的 光 源 改 在 物 鏡 的 上 方 ，光 由 物 鏡 上 方 經(jīng) 反 光 鏡 射 入 物 鏡 去 激 發(fā) 樣 品 ，從 樣 品 上 被 激 發(fā) 的 熒 光 經(jīng) 物 鏡 成 像 并 穿 透 反 光鏡 而 由 目 鏡 觀 察 。 如 換 用 不 同 的 激 發(fā) 濾 片 雙 色 束 分離 器 阻 斷 濾 片 的 組 合 插 塊 ， 可 滿 足 不同 熒 光 反 應 產(chǎn) 物 的 需 要 。此 種 熒 光 顯 微 鏡 的 優(yōu) 點 是 視 野 照 明均 勻 ,成 像 清 晰 ,放 大 倍 數(shù) 愈 大 熒 光 愈 強。 2 反 射 式 熒 光 顯 微 鏡 透 射 式 落 射 式 四 、 熒 光 顯 微 鏡 使 用 方 法1 打 開 燈 源 ， 超 高 壓 汞 燈 要 預 熱 幾 分 鐘 才 能 達 到 最亮 點 。2 透 射 式 熒 光 顯 微 鏡 需 在 燈 源 與 聚 光 器 之 間 裝 上 所要 求 的 激 發(fā) 濾 片 ， 在 物 鏡 的 后 面 裝 上 相 應 的 阻斷 濾 片 。落 射 式 熒 光 顯 微 鏡 需 在 光 路 的 插 槽 中 插 入 所 要求 的 激 發(fā) 濾 片 二 向 色 鏡 阻 斷 濾 片 的 插 塊 。 3.用 低 倍 鏡 觀 察 ， 根 據(jù) 不 同 型 號 熒 光 顯 微 鏡 的 調(diào) 節(jié) 裝 置 ， 調(diào)整 光 源 中 心 ,使 其 位 于 整 個 照 明 光 斑 中 央 。4.放 置 標 本 片 ， 調(diào) 焦 后 即 可 觀 察 。 使 用 中 應 注 意 ：未 裝 濾 光 片 不 要 用 眼 直 接 觀 察 ， 以 免 引 起 眼 損 傷 ；用 油 鏡 觀 察 標 本 時 ， 必 須 用 無 熒 光 的 特 殊 油 鏡 ；高 壓 汞 燈 關(guān) 閉 后 不 能 立 即 重 新 打 開 ， 需 經(jīng) 5分 鐘 后 才 能 再 啟動 ， 否 則 會 不 穩(wěn) 定 ， 影 響 汞 燈 壽 命 。四 、 熒 光 顯 微 鏡 使 用 方 法 熒 光 觀 察 的 基 本 調(diào) 整 步 驟 調(diào) 整 汞 燈 象 ， 讓 其 聚 焦 對 中 心 。 調(diào) 整 步 驟 ： （ 1） 將 調(diào) 心 工 具 旋 在 空 出 的 物 鏡 轉(zhuǎn) 換 器 孔 上 ， 并 讓 其 進 入 光 路 。 （ 2） 打 開 前 光 閘 ， 讓 落 射 光 進 入 光 路 。 （ 注 ： 調(diào) 汞 燈 象 中 心 時 ，一 般 采 用 B波 段 的 濾 光 塊 ） （ 3） 通 過 調(diào) 心 工 具 的 觀 察 窗 口 ， 將 汞 燈 象 聚 焦 對 中 心 a. 當 泵 燈 象 在 投 影 平 面 的 外 部 時 ， 旋 動 位 于 燈 室 外 部 的 橫 向 和縱 向 的 調(diào) 中 心 旋 鈕 將 汞 燈 象 （ 尚 未 聚 焦 ） 接 近 投 影 平 面 中 心 。 b. 再 旋 動 位 于 燈 室 外 部 的 聚 焦 旋 鈕 ， 使 汞 燈 象 聚 焦 在 投 影 平 面上 。 c. 再 次 旋 動 橫 向 和 縱 向 調(diào) 中 心 旋 鈕 ， 將 汞 燈 象 最 終 清 晰 地 固 定在 中 心 。 （ 4） 旋 下 調(diào) 心 工 具 ， 重 新 旋 上 物 鏡 。 讓 標 本 進 入 光 路 ， 選 擇 適 當 波 段 濾 光 塊 進 入 光 路 ， 并 用 10X物 鏡聚 焦 。 對 目 鏡 進 行 適 度 和 瞳 距 調(diào) 節(jié) 。 視 場 光 闌 對 中 心 。 轉(zhuǎn) 換 所 需 倍 率 的 物 鏡 觀 察 標 本 。 熒 光 顯 微 鏡 和 普 通 顯 微 鏡 有 以 下 的 區(qū) 別 ：1. 照 明 方 式 通 常 為 落 射 式 ， 即 光 源 通 過 物 鏡投 射 于 樣 品 上 ；2. 光 源 為 紫 外 光 ， 波 長 較 短 ， 分 辨 力 高 于 普 通顯 微 鏡 ；3. 有 兩 個 特 殊 的 濾 光 片 ， 光 源 前 的 用 以 濾 除 可見 光 ， 目 鏡 和 物 鏡 之 間 的 用 于 濾 除 紫 外 線 ， 用 以 保 護人 眼 。 熒 光 素 的 特 性 口 腔 上 皮 細 胞 口 腔 上 皮 細 胞 熒 光 松 樹 莖 部 橫 切 面 松 樹 莖 部 橫 切 面 熒 光 松 樹 莖 部 橫 切 面 松 樹 莖 部 橫 切 面 熒 光 向 日 葵 莖 部 橫 切 向 日 葵 莖 部 橫 切 熒 光 頭 發(fā) 頭 發(fā) 熒 光 n 熒 光 顯 微 鏡 要 在 光 線 盡 量 暗 的 環(huán) 境 下 觀 察 。n 使 用 熒 光 顯 微 鏡 時 要 注 意 不 要 直 接 觀 察 激發(fā) 光 源 ， 保 護 眼 睛 。 五 、 注 意 事 項 實 驗 報 告n實 驗 目 的n實 驗 用 品n實 驗 原 理 （ 熒 光 顯 微 鏡 的 原 理 ）n實 驗 方 法 （ 熒 光 顯 微 鏡 的 操 作 方 法 ）n思 考 題 1、 什 么 是 熒 光 ？ 它 是 怎 樣 發(fā) 生 的 ？2、 熒 光 顯 微 鏡 為 什 么 要 以 汞 燈 為 光 源 ？3、 激 發(fā) 濾 色 鏡 和 阻 斷 濾 色 鏡 的 功 能 及 區(qū) 別 ？4、 描 述 樣 品 在 熒 光 顯 微 鏡 下 與 光 學 顯 微 鏡 下觀 察 效 果 的 差 異 。六 、 思 考 題