熒光顯微鏡的基本原理及應用

高分辨率熒光顯微鏡的基本原理和操作要求 一、熒光顯微鏡(fluorescence microscope) 原理： 某些物質(zhì)經(jīng)一定波長的光（如紫外光）照射后，物質(zhì)中的分子被激活，吸收能量后躍遷至激發(fā)態(tài)；當其從激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)時，所吸收的能量除部分轉(zhuǎn)化為熱量或用于光化學反應外，其余較大部分則以光能形式輻射出來，由于能量沒能全以光的形式輻射出來，故所輻射出的光的波長比激發(fā)光的要長，這種波長長于激發(fā)光的可見光部就是熒光(fluorescence)。所謂熒光就是某些物質(zhì)在一定波長光（如紫外光）的照射下、在極短時間內(nèi)所發(fā)出的比照射光波長更長的可見光。 二、熒光顯微鏡的組成1、光源：一般采用高壓汞燈2、濾色系統(tǒng)：由激發(fā)濾板和壓制濾板組成a、激發(fā)濾板：提供一定范圍的激發(fā)光b、壓制濾板：完全阻擋激發(fā)光通過，提供相應濾長范圍熒光3、反光鏡：一般采用平面反光鏡4、聚光鏡：用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成5、物鏡和目鏡 The optical system of a fluorescence microscope.A filter set consists of two barrier filters (1 and 3) and a dichroic mirror (beam-splitting 2) 三、熒光顯微鏡的操作 (1)安裝紫外防護罩。 (2)打開高壓汞燈的電源控制箱開關(guān)。 (3)插入擋光板，中斷光路。 (4)預熱510分鐘。 (5)將載有樣品的載玻片放到載物臺上。 (6)選擇接物鏡(按照先低倍，后高倍順序)。 (7)旋轉(zhuǎn)分光鏡組件轉(zhuǎn)盤，選擇所需要的分光鏡組件：“O”為觀察透射光時用；“WU”為觀察藍色熒光時用(如DAPl)；“WB”為觀察綠色熒光時用(如FITC)；“WG為觀察紅色熒光時用(如TRITC)。 (8)使用阻斷濾片(目前多數(shù)阻斷濾片內(nèi)置于熒光顯微鏡)。 (9)通過粗、細螺旋調(diào)整焦距。 (10)打開與顯微鏡連接的計算機，點擊數(shù)碼成像系統(tǒng)軟件，采集數(shù)碼圖像。 四、熒光顯微鏡標本制作要求（一）載玻片載玻片厚度應在0.81.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發(fā)熒光。有時需用石英玻璃載玻片。（二）蓋玻片蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質(zhì)（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激 發(fā)光，這種反射的激發(fā)光女可激發(fā)標本。 （三）標本組織切片或其他標本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外，細胞重迭或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。（四）封裱劑封裱劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.59.5時較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.09.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。（五）鏡油一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標本時，必須使用鏡油，最好使用特制的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質(zhì)量略有影響。 五、熒光染料的使用1、吖啶橙：吖啶橙是最經(jīng)典的靈敏的熒光染料，它可對細胞中的DNA和RNA同時染色而顯示不同顏色的熒光，DNA呈綠色熒光，RNA呈橙紅色熒光。2、溴化乙錠（EB）:染色DNA和RNA。3、熒光素雙醋酸酯(FDA)：FAD 本身無熒光,無極性,可透過完整的原生質(zhì)膜。一旦進入原生質(zhì)體后,由于受到酯酶分解而產(chǎn)生 具有熒光的極性物質(zhì)熒光素。4、熒光染料Ho33342和羅丹明123:Ho33342能與細胞中DNA進行特異的結(jié)合，羅丹明123能與線粒體進行特異的結(jié)合。 六、熒光組化實驗中應注意的幾個問題1、每種熒光染料，均有自己的最適pH值，此時熒光最強。當pH改變時，不僅熒光強度減弱，而且波長將有所改變，因此熒光檢測時要在一定的pH值的緩沖液中進行。2、一放熒光染色在20。C以下時熒光比較穩(wěn)定，溫度升高常出現(xiàn)溫度猝滅。3、在熒光觀察中，常因激發(fā)光的增強而使樣品熒光很快衰竭，造成觀察和照相困難。為此最好用能量小的長波長光進行觀察，需照相時再適當增強激發(fā)光。4、一般熒光染液的濃度在萬分之一以下，甚至億萬分之一，也能使標本著色。在一定的限度內(nèi)，熒光強度可隨熒光素的濃度增加而增強，但超過限度，熒光強度反而下降，這是由 于熒光分子間的締合而使自身熒光猝滅所致。 七、熒光顯微鏡應用技術(shù)1. 對細胞結(jié)構(gòu)或組分的定性位、半定量研究 免疫熒光技術(shù) 用熒光標記的抗體或抗原與樣品(細胞、組織或分離的物質(zhì)等)中相應的抗原或抗體結(jié)合，以適當檢測熒光的技術(shù)對其進行分析的方法。將抗原或抗體與熒光染料連接，用于檢測相應特異性的抗體或抗原的方法稱“直接免疫熒光技術(shù)(direct immunofluorescent technique)”。用熒光染料標記的第二、第三抗體等檢測相應抗原抗體復合體的方法則稱“間接免疫熒光技術(shù)(indirect immunofluorescent technique)”。 由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對抗原進行細胞定位 O 1.分子標記 利用綠色熒光的發(fā)光機制，可將GFP作為蛋白質(zhì)標簽(protein tagging)，即利用DNA重組技術(shù)，將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染合適的細胞進行表達，然后借助熒光顯微鏡便可對標記的蛋白質(zhì)進行細胞內(nèi)活體觀察 2.藥物篩選 熒光探針分布是利用信號傳導中信號分子的遷移功能，將一熒光蛋白與信號分子相偶聯(lián)，根據(jù)熒光蛋白的分布情況即可推斷信號分子的遷移狀況，并推斷該分子在遷移中的功能。由于GFP分子量小，在活細胞內(nèi)可溶且對細胞毒性較小，因而常用作熒光探針 八、使用注意事項1 暗室內(nèi)進行，打開汞燈5-10min穩(wěn)定后再觀察。2 熒光淬滅(光漂白)：激發(fā)光長時間照射會發(fā)生熒光減弱或消失，操作時注意及時用擋板阻擋激發(fā)光照射標本。3 汞燈關(guān)閉后需冷卻30min后再重新啟動（最好不要短時間內(nèi)反復開關(guān)，標本應集中觀察。）4 載物臺前方黃色遮光板：最好不直接用肉眼看激發(fā)光，以防短波光中的紫外傷害。5標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。 The end,thank you!