《倒置熒光顯微鏡》PPT課件

倒置熒光顯微鏡操作及注意事項李 玉 紅 顯 微 鏡 部 件 及 名 稱 顯 微 鏡 機 體 明 視 場 (BF)鏡 檢 關 鍵 點 ： 從 光 路 中 卸 下 其 它 形 式 觀 察 需 要 的 所 有 光 學 組 件 ， 聚 光 器 調 節(jié) 好 （ 調 節(jié) 聚 焦和 對 中 ） ， 轉 動 孔 徑 光 闌 調 節(jié) 好 像 的 清 晰 度 。 1， 復 位 1） 逆 時 針 轉 動 ， 松 開 透 射 照 明 器 中 的 “ 聚 光 器再 聚 焦 指 緊 螺 釘 ” 。 2） 把 “ 目 鏡 筒 轉 盤 ” 設 置 到 O 位 。 3） 把 顯 微 鏡 右 側 的 “ 中 間 放 大 倍 數(shù) 刻 度 盤 ” 打到 1X 。 4） 逆 時 針 轉 動 ， 松 開 顯 微 鏡 右 側 粗 微 調 旋 鈕 后 面 的 “ 物 鏡 再 聚 焦 定 位 環(huán) ” 。 2. 打 開 透 射 照 明 器 1） 把 電 源 后 部 的 “ 外 部 開 關 ” 打 到 開 的 位 置 。 2） 把 電 源 “ 電 源 開 關 ” 打 開 。 （ 把 開 關 撥 至 ） 3） 按 下 顯 微 鏡 左 側 的 “ 照 明 器 開 關 ” 接 通 燈 泡 。3. 調 節(jié) 燈 泡 亮 度 保 證 色 彩 真 實 。 1） 把 顯 微 鏡 左 側 的 “ 亮 度 調 節(jié) 盤 ” 設 置 成 12V100W 。 2） 把 透 射 照 明 器 中 的 “ NCB11濾 色 片 ” 插 入 光 路 中 。3） 把 透 射 照 明 器 中 的 “ ND4濾 色 片 ” 插 入 光 路 中 。4. 調 節(jié) 光 路 1） 把 10X物 鏡 轉 到 光 路 中 。 2） 把 顯 微 鏡 右 側 的 “ 光 路 轉 換 盤 ” 轉 到 1 的 位 置 。（ 100%光 到 觀 察 口 ） 3） 向 上 推 透 射 照 明 器 上 的 “ 視 場 光 闌 桿 ” 完 全 打 開 視 場 光 闌 。 4） 將 系 統(tǒng) 聚 光 器 上 的 “ 孔 徑 光 闌 桿 ” 轉 至 右 側 極 限 處 把 “ 孔 徑光 闌 ” 完 全 打 開 。 5） 轉 動 聚 光 器 調 焦 旋 鈕 把 聚 光 器 調 至 最 低 位 置 。 5. 明 視 場 觀 察 時 對 顯 微 鏡 的 調 整 1） 把 “ 聚 光 器 轉 盤 ” 轉 到 A 位 置 。 6 調 節(jié) 視 度 及 瞳 距 1） 將 顯 微 鏡 前 部 的 “ 攝 影 取 景 框 轉 盤 ” 逆 時 針 旋 轉 ， 使攝 影 取 景 框 進 入 光 路 。 2） 用 左 眼 對 著 左 側 目 鏡 ， 轉 動 目 鏡 “ 屈 光 度 調 節(jié) 環(huán) ” ，使 取 景 框 中 的 雙 十 字 線 清 晰 成 像 。 3） 用 右 眼 對 著 右 側 目 鏡 ， 轉 動 目 鏡 “ 屈 光 度 調 節(jié) 環(huán) ” ，使 取 景 框 中 的 雙 十 字 線 清 晰 成 像 。 4） 將 顯 微 鏡 前 部 的 “ 攝 影 取 景 框 轉 盤 ” 順 時 針 旋 轉 ， 使其 退 出 光 路 。 5） 調 節(jié) 目 鏡 瞳 距 ， 將 兩 目 鏡 視 場 所 見 的 影 像 重 合 在 一 起 。7. 調 焦 1） 將 樣 品 放 置 載 物 臺 中 。 2） 轉 動 同 軸 粗 微 調 旋 鈕 ， 將 標 本 對 好 焦 。 8. 聚 光 器 中 心 調 節(jié) 1） 確 信 10X物 鏡 在 光 路 中 。 2） 將 “ 視 場 光 闌 調 節(jié) 桿 ” 降 低 直 到 能 從 目 鏡 看 到 視 場 光闌 像 。 3） 轉 動 “ 聚 光 器 調 焦 鈕 ” 升 降 聚 光 器 ， 使 視 場 光 闌 像 清晰 地 成 象 在 標 本 面 上 。 4） 轉 動 兩 個 “ 聚 光 器 中 心 調 節(jié) 螺 釘 ” ， 使 視 場 光 闌 像 在視 場 中 心 。 5） 更 換 40X物 鏡 。 6） 調 節(jié) “ 視 場 光 闌 調 節(jié) 桿 ” ， 使 視 場 光 闌 的 象 與 視 場 大致 相 同 。 7） 轉 動 兩 個 “ 聚 光 器 中 心 調 節(jié) 螺 釘 ” ， 使 視 場 光 闌 像 在視 場 正 中 。 9. 進 行 觀 察 1） 選 擇 要 使 用 的 物 鏡 2） 移 動 系 統(tǒng) 聚 光 器 上 的 “ 孔 徑 光 闌 調 節(jié) 桿 ” ， 使 孔 徑 為物 鏡 數(shù) 值 孔 徑 的 70 80%。 （ “ 把 目 鏡 筒 轉 盤 ” 設 到 B 位 置 ， 轉 動 勃 氏 鏡 調 焦 螺 釘 使 其 聚 焦 ， 當 觀 察到 物 鏡 的 出 瞳 和 孔 徑 光 欄 的 象 時 ， 調 節(jié) 其 大 小 。 ）3） 調 節(jié) “ 視 場 光 闌 調 節(jié) 桿 ” 使 視 場 光 闌 像 與 視 場 相 大 致相 同 。 4） 把 透 射 照 明 器 里 的 “ ND減 光 片 ” 進 入 或 退 出 光 路 以 調節(jié) 視 場 亮 度 。 補 充 說 明 如 果 不 需 要 色 溫 很 準 確 的 顏 色 ， 可 以 通 過 顯 微 鏡左 側 的 “ 亮 度 調 節(jié) 盤 ” ， 改 變 燈 泡 電 壓 來 調 節(jié) 亮度 。 10. 更 換 樣 品 利 用 顯 微 鏡 主 體 上 的 “ 物 鏡 再 聚 焦 定 位 環(huán) ” ， 照 明 器 上的 “ 傾 斜 裝 置 ” ， “ 聚 光 器 再 聚 焦 指 緊 螺 釘 ， 可 容 易 更換 樣 品 。 11. 顯 微 鏡 操 作 結 束 后 1) 關 閉 電 源 開 關 (開 關 撥 至 O) 2) 燈 室 冷 卻 后 ， 把 顯 微 鏡 上 的 聚 乙 烯 防 塵 罩 蓋 好 。 相 差 （ PH） 顯 微 術 關 鍵 點 ： 將 有 ph標 記 的 物 鏡 與 物 鏡 相 同 ph標 記 的 聚 光 器 模 塊 一 起 送 入 光 路 ，在 進 行 顯 微 術 前 ， 校 正 (對 中 )物 鏡 里 的 相 差 板 及 聚 光 器 模 塊 里 的 環(huán) 形 光 闌 。1. 用 明 視 場 （ BF） 顯 微 術 對 樣 品 聚 焦 。 2. 相 差 觀 察 時 對 顯 微 鏡 的 調 整 。 1) 將 ph物 鏡 轉 入 光 路 。 2) 轉 動 “ 聚 光 器 轉 盤 ” ， 使 其 與 在 光 路 中 的 物 鏡 (步 驟 1中 所 安 置的 )具 有 相 同 的 ph標 記 。 3) 向 右 轉 動 聚 光 器 上 的 “ 孔 徑 光 闌 調 節(jié) 桿 ” ， 完 全 打 開 孔 徑 光 闌 。 補 充 說 明 如 果 孔 徑 光 闌 沒 有 完 全 打 開 ， 光 路 中 的 環(huán) 形 光 闌 將 受 到 限 制 ，影 響 相 差 效 果 。 4) 提 高 透 射 照 明 器 中 的 “ 視 場 光 闌 調 節(jié) 桿 ” 位 置 ， 使 視 場 光 闌 完全 打 開 。 3. 對 中 環(huán) 形 光 闌 1) 把 “ 目 鏡 筒 轉 盤 ” 設 到 位 置 ， 轉 動 勃 氏 鏡 聚 焦 螺釘 ， 使 環(huán) 形 光 闌 像 清 晰 。 2) 用 六 角 起 子 轉 動 聚 光 器 模 塊 中 的 兩 個 “ 環(huán) 形 光 闌 對 中螺 釘 ” ， 使 環(huán) 形 光 闌 像 與 物 鏡 中 的 相 差 板 環(huán) 形 像 同 心 。3) 把 目 鏡 筒 轉 盤 位 置 再 轉 到 上 。 4. 進 行 觀 察 1) 把 聚 光 器 “ 孔 徑 光 闌 ” 完 全 打 開 。 2) 移 動 透 射 照 明 器 上 的 “ 視 場 光 闌 調 節(jié) 桿 ” ， 使 視 場 光闌 像 大 小 與 視 場 大 小 接 近 。 3) 把 透 射 照 明 器 上 的 “ NCB11 濾 色 片 ” 從 光 路 中 移 開 ，把 “ GIF濾 色 片 ” 移 進 光 路 。 (提 高 反 差 ) 4) 可 通 過 把 “ ND濾 色 片 ” 移 進 或 移 出 光 路 來 調 節(jié) 視 場 亮 度 。 補 充 說 明 如 果 不 需 要 色 溫 準 確 的 顏 色 ， 可 以 通 過 顯 微 鏡 左 側 的“ 亮 度 調 節(jié) 盤 ” ， 改 變 燈 泡 電 壓 來 調 節(jié) 亮 度 。 5. 使 用 不 同 放 大 倍 數(shù) 的 物 鏡 進 行 觀 察 1) 把 所 需 放 大 倍 數(shù) 的 相 差 物 鏡 移 入 光 路 。 2) 轉 動 “ 聚 光 器 轉 盤 ” ， 使 其 與 在 光 路 上 物 鏡 （ 步 驟 1中 所 安 置 的 ） 具 有 相 同 的 ph標 記 。 3) 調 節(jié) 放 入 光 路 中 的 環(huán) 形 光 闌 中 心 。 (見 程 序 3) 6. 更 換 樣 品 利 用 使 用 顯 微 鏡 主 機 上 的 “ 物 鏡 再 聚 焦 定 位 環(huán) ” ， 透 射照 明 器 上 的 “ 傾 斜 ” 裝 置 及 “ 聚 光 器 再 聚 焦 指 緊 螺 釘 ” ，可 容 易 更 換 樣 品 。 調 焦 裝 置 當 使 用 TE2000-U/時 ： 不 要 同 時 反 方 向 轉 動 顯 微 鏡 左 右 兩 側 的 調 焦 鈕 ， 否 則 會 導致 顯 微 鏡 損 壞 。 粗 動 調 焦 鈕 達 到 限 定 位 置 后 ， 如 果 繼 續(xù) 向 同 一 方 向 旋 轉 會引 起 顯 微 鏡 故 障 。 請 不 要 旋 轉 過 度 。 旋 鈕 的 轉 動 量 與 物 鏡 的 移 動 量 關 系 如 下 所 示 。 粗 微 調 焦 鈕所 提 供 的 物 鏡 往 復 范 圍 為 ： 基 準 位 置 上 方 7 毫米 ， 下 方 3毫 米 。 粗 微 調 旋 轉 量 物 鏡 的 垂 直 移 動 量 微 動 調 焦 鈕 旋 轉 一 個 刻 度 1微 米 微 動 調 焦 鈕 旋 轉 一 周 0.1微 米 粗 動 調 焦 鈕 旋 轉 一 周 4.9毫 米 聚 光 器 座 的 轉 動 擰 松 聚 光 器 座 旋 轉 指 緊 螺 釘 ， 聚 光 器 座 就 可以 轉 動 。 此 功 能 主 要 用 于 微 分 干 涉 顯 微 術 時 調 節(jié) 偏 振方 向 。 當 用 系 統(tǒng) 聚 光 器 及 無 起 偏 器 時 (例 如 進 行 明 場顯 微 術 或 相 差 顯 微 術 時 )， 此 功 能 可 用 來 左 右移 動 聚 光 器 轉 盤 位 置 ， 為 顯 微 操 作 器 或 其 它系 統(tǒng) 留 下 空 間 。 故 障 及 對 策 維 護 1. 鏡 頭 的 清 潔 不 要 將 灰 塵 、 指 紋 等 留 在 鏡 頭 上 。 鏡 頭 、 濾 色 片 上 的 灰 塵 將 影 響 視 場 中 的 圖 像 。如 果 鏡 頭 變 臟 ， 按 以 下 方 法 進 行 清 潔 。 將 灰 塵 用 軟 刷 刷 去 ， 或 用 紗 布 輕 輕 擦 掉 。 如 果 鏡 頭 上 有 指 紋 或 油 脂 ， 可 用 一 塊 沾 有 純 酒 精 （ 乙 醇 或 甲 醇 ） 的 柔 軟 清 潔 的棉 布 、 鏡 頭 紙 或 紗 布 擦 去 。 當 擦 物 鏡 上 的 浸 油 時 ， 使 用 石 油 醚 。 如 果 沒 有 石 油 醚 ， 請 用 乙 醇 。 但 是 ， 因 為乙 醇 的 清 潔 效 果 沒 有 石 油 醚 效 果 好 ， 需 要 重 復 擦 表 面 。 （ 通 常 清 潔 鏡 頭 要 三 到 四次 。 ） 勿 用 石 油 醚 清 潔 目 鏡 筒 底 部 的 鏡 頭 或 目 鏡 筒 表 面 。 純 酒 精 和 石 油 醚 均 為 高 度 易 燃 品 。 因 此 在 使 用 、 保 管 、 搬 運 過 程 中 應 格 外 小 心 。操 作 電 源 開 關 或 臺 燈 尚 熱 時 ， 勿 將 它 們 放 在 燈 泡 附 近 。 使 用 純 酒 精 時 ， 請 遵 守 廠 家 提 供 的 使 用 說 明 書 。 簡 易 操 作 程 序 ：倒 置 顯 微 鏡 中 最 常 用 的 觀 察 方 法 就 是 相 差 。 由 于 這 種 方 法 不 要 求 染 色 ， 是 觀 察 活 細 胞和 微 生 物 的 理 想 方 法 。 在 此 提 供 各 種 聚 光 器 來 滿 足 需 要 ， 這 種 方 法 提 供 帶 有 自 然 背 景色 的 、 高 對 比 度 的 、 高 清 晰 度 的 圖 像 。1.開 機 。 接 連 電 源 。 打 開 鏡 體 下 端 的 電 控 開 關 。2.使 用(1)準 備 ： 將 待 觀 察 對 象 置 于 載 物 臺 上 。 旋 轉 三 孔 轉 換 器 ， 選 擇 較 小 的 物 鏡 。 觀 察 ， 并調 節(jié) 鉸 鏈 式 雙 目 目 鏡 ， 舒 適 為 宜 。(2)調 節(jié) 光 源 ： 推 拉 調 節(jié) 鏡 體 下 端 的 亮 度 調 節(jié) 器 至 適 宜 。 通 過 調 節(jié) 聚 光 鏡 下 面 的 光 柵 來調 節(jié) 光 源 的 大 小 。(3)調 節(jié) 像 距 ： 轉 三 孔 轉 換 器 ， 選 擇 合 適 倍 數(shù) 的 物 鏡 ； 更 換 并 選 擇 合 適 的 目 鏡 ； 同 時 調節(jié) 升 降 ， 以 消 除 或 減 小 圖 像 周 圍 的 光 暈 ， 提 高 了 圖 像 的 襯 度 。(4)觀 察 ： 通 過 目 鏡 進 行 觀 察 結 果 ； 調 整 載 物 臺 ， 選 擇 觀 察 視 野 。 3.關 機取 下 觀 察 對 象 ， 推 拉 光 源 亮 度 調 節(jié) 器 至 最 暗 。 關 閉 鏡 體 下 端 的 開 關 ， 并 斷 開 電 源 。 旋轉 三 孔 轉 換 器 ， 使 物 鏡 鏡 片 置 于 載 物 臺 下 側 ， 防 止 灰 塵 的 沉 降 。 相 差 是 倒 置 顯 微 鏡 最 常 用 的 觀 察 方 法 。 該 方法 不 要 求 標 本 染 色 ， 用 于 觀 察 活 體 細 胞 和 微 生 物最 為 理 想 。 相 差 成 像 技 術 提 供 了 帶 中 性 背 景 的 明 亮 、 高對 比 度 、 高 分 辨 率 的 圖 像 。 尼 康 采 用 了 “ 切 趾 相 襯 的 新 技 術 ， 減 少 了成 像 光 暈 ， 從 而 產 生 對 比 度 優(yōu) 越 、 色 調 范 圍 更 廣的 圖 像 。 熒 光 ： 在 涉 及 熒 光 蛋 白 質 這 樣 的 活 體 細 胞 顯 微 術中 ， 這 種 方 法 不 可 或 缺 。 尼 康 獨 創(chuàng) 的 消 雜 光 機 構 最 大 限 度 地 消 除 了 背 景 雜光 ， 從 而 在 動 態(tài) 活 細 胞 成 像 試 驗 中 觀 察 發(fā) 微 弱 熒光 的 標 本 時 能 產 生 更 高 信 噪 比 的 圖 像 。 霍 夫 曼 調 制 相 襯 (HMC)方 法 使 用 尼 康 的 專 用 物 鏡和 標 鏡 ， 它 將 相 們 梯 度 轉 換 為 光 強 度 變 化 ， 使 透明 的 活 體 標 本 產 生 生 動 、 具 有 三 維 立 體 感 的 圖 像 。HMC成 像 技 術 中 ， 標 本 可 以 置 于 塑 料 培 養(yǎng) 皿 中 觀察 ， 彌 補 了 諾 馬 斯 基 微 分 干 涉 相 襯 技 術 的 不 足 。 微 分 干 涉 相 襯 (DIC)方 法 讓 未 經(jīng) 染 色 的 活 體 細 胞和 微 生 物 所 觀 察 到 的 圖 像 具 有 三 維 浮 雕 狀 的 立 體感 ， 且 對 比 度 和 靈 敏 度 出 眾 。 尼 康 DIC系 統(tǒng) 采 用 塞 拿 蒙 方 法 ， 使 用 該 系 統(tǒng) 時 ，您 只 需 轉 動 聚 光 器 頂 部 的 偏 振 器 即 可 輕 松 微 調 圖像 的 對 比 度 。 聚 光 器 上 的 DIC棱 鏡 與 物 鏡 上 的 DIC棱 鏡 一 一 對 應 ， 因 此 性 能 得 以 優(yōu) 化 。 若 將 DIC與 落 射 熒 光 照明 組 合 使 用 ， 可 以 對 熒 光 標 記 結 構 或 蛋 質 精 確 定位 ， 在 同 一 標 本 里 顯 示 細 胞 形 態(tài) 。