熒光顯微鏡的原理和使用方法

特殊顯微鏡的使用（3）熒光顯微鏡的原理及其應用 一 、 實 驗 目 的 ： 掌 握 熒 光 顯 微 鏡 的 原 理 和 使 用 方 法 二 、 實 驗 原 理 熒 光 顯 微 鏡 (fluorescence microscope) 是 熒 光 顯 微術 的 基 本 裝 置 。 熒 光 顯 微 術 是 利 用 一 定 波 長 的 光（ 通 常 是 波 長 短 的 紫 外 光 和 藍 紫 光 ） 照 射 被 檢 樣品 ， 激 發(fā) 熒 光 物 質 發(fā) 出 可 見 的 熒 光 。 通 過 物 鏡 和目 鏡 的 成 像 、 放 大 ， 以 供 檢 視 和 拍 攝 。 熒 光 顯 微鏡 具 特 殊 光 源 ， 提 供 足 夠 強 度 和 波 長 的 激 發(fā) 光 ，誘 發(fā) 熒 光 物 質 發(fā) 出 熒 光 。 視 場 中 所 見 的 像 ， 主 要是 樣 品 的 熒 光 映 像 。 某 些 物 質 經(jīng) 波 長 較 短 的 光 線 照 射 后 ， 分 子 被 激 活 ，吸 收 能 量 后 呈 激 發(fā) 態(tài) 。 其 能 量 部 分 轉 化 為 熱 量 或用 于 光 化 學 反 應 外 ， 相 當 一 部 分 則 以 波 長 較 長 的光 能 形 式 輻 射 出 來 ， 這 種 波 長 長 于 激 發(fā) 光 的 可 見光 稱 作 熒 光 。 生 物 體 內 有 些 物 質 受 激 發(fā) 光 照 射 后可 直 接 發(fā) 出 的 熒 光 ， 稱 為 自 發(fā) 熒 光 （ 如 葉 綠 體 中的 葉 綠 素 分 子 受 激 發(fā) 所 發(fā) 出 的 火 紅 色 的 熒 光 ） ；本 身 不 發(fā) 熒 光 ， 在 吸 收 熒 光 染 料 之 后 所 發(fā) 出 的 熒光 稱 為 次 生 熒 光 。 常 用 的 熒 光 染 料 包 括 丫 啶 橙 、熒 光 素 、 羅 丹 明 、 GFP、 PI、 PE、 DAPI等 。 細 胞 內 大 部 分 物 質 經(jīng) 短 光 波 照 射 后 ， 可 發(fā) 出 較 弱的 自 發(fā) 性 熒 光 。 有 些 細 胞 成 分 與 能 發(fā) 出 熒 光 的 有機 化 合 物 熒 光 染 料 結 合 。 激 發(fā) 后 呈 現(xiàn) 一 定 顏色 的 熒 光 ， 借 以 對 組 織 進 行 細 胞 化 學 的 觀 察 和 研究 。 2.1 熒 光 顯 微 鏡 的 基 本 裝 置 及 其 光 路 熒 光 顯 微 鏡 因 制 造 廠 家 、 型 號 的 不 同 ， 結 構各 異 ， 但 主 要 構 件 ， 基 本 相 同 。 2.1.1光 源 :采 用 高 壓 汞 燈 。 汞 燈 能 以 最 小 的 表 面發(fā) 出 最 大 數(shù) 量 的 紫 外 光 和 藍 光 ， 且 光 亮 度 大 ， 光度 穩(wěn) 定 。 汞 燈 的 構 件 ， 中 間 為 一 球 形 石 英 玻 璃 管 ，有 兩 個 鎢 電 極 ， 內 充 汞 滴 和 少 量 氬 氖 混 合 氣 體 。汞 燈 裝 在 牢 固 的 燈 室 中 ， 有 調 中 、 聚 焦 和 集 光 裝置 。 使 用 中 嚴 禁 頻 繁 啟 閉 ， 點 亮 后 欲 暫 停 使 用 時 ，不 可 切 斷 電 源 ， 可 用 光 閥 阻 斷 光 路 。 當 汞 燈 熄 滅后 ， 不 能 立 刻 點 亮 ， 經(jīng) 5 10min， 汞 燈 冷 卻 后 再通 電 點 亮 。 HBO200 汞 燈 的 發(fā) 射 光 譜 為 200 600nm，其 中 在 365nm和 435nm處 有 兩 個 高 峰 。 2.2.2濾 色 鏡 系 統(tǒng) :熒 光 顯 微 術 的 濾 色 鏡 ， 按 用 途或 功 能 ， 主 要 分 為 下 列 兩 類 ： 激 發(fā) 濾 色 鏡 （ exciter filter） :激 發(fā) 濾 色 鏡 的 作用 ， 在 于 為 被 檢 樣 品 的 熒 光 染 料 提 供 最 佳 波 段 的激 發(fā) 光 。 熒 光 染 料 均 有 一 定 的 吸 收 光 譜 （ 激 發(fā) 峰值 ） ， 利 用 濾 色 鏡 對 光 線 選 擇 吸 收 的 能 力 ， 選 用其 透 射 光 譜 ， 恰 為 熒 光 染 料 的 最 大 吸 收 光 譜 （ 激發(fā) 高 峰 ） 的 激 發(fā) 濾 色 鏡 ， 以 便 從 汞 燈 發(fā) 出 的 廣 譜光 波 中 ， 選 擇 透 過 最 宜 波 段 的 光 線 供 用 。 激 發(fā) 濾 色 鏡 加 放 于 汞 燈 和 二 向 色 鏡 （ dichotic mirror） 之 間 ， 物 鏡 之 前 。 濾 鏡 的 型 號 不 同 ， 數(shù) 量較 多 ， 可 按 不 同 需 要 選 用 。 阻 斷 濾 色 鏡 （ barrier filter） :阻 斷 濾 色 鏡位 于 物 鏡 之 上 ， 二 向 色 鏡 和 目 鏡 之 間 ， 用以 阻 斷 或 吸 收 光 路 中 的 激 發(fā) 光 或 某 些 波 長較 短 的 光 線 ， 以 防 傷 害 眼 睛 ， 使 熒 光 透 過 。選 用 的 原 則 ， 以 能 完 全 阻 斷 或 吸 收 波 長 短于 所 需 熒 光 的 光 線 ， 并 透 過 樣 品 發(fā) 出 的 熒光 。 所 以 ， 阻 斷 濾 色 鏡 的 選 用 ， 應 視 熒 光染 料 的 熒 光 光 譜 而 定 ， 以 能 最 大 限 度 地 透過 熒 光 和 阻 斷 短 波 光 。 二向色鏡（chromatic beam splitter）:熒 光顯 微 鏡 中 ， 除 上 述 兩 類 濾 色 鏡 外 ， 尚 有 一重 要 的 分 色 鏡 系 統(tǒng) 二 向 色 鏡 位 于 汞 燈汞 激 發(fā) 濾 色 鏡 構 成 的 水 平 光 軸 與 目 鏡 和 物鏡 構 成 的 豎 直 光 軸 的 兩 軸 垂 直 相 交 處 ， 斜向 安 裝 于 光 路 之 中 。 由 鍍 膜 的 光 學 玻 璃 制成 ， 其 鏡 面 方 位 與 上 述 兩 光 軸 交 角 均 呈45 ， 兼 有 透 射 長 波 光 線 和 反 射 短 波 光 線的 功 能 。 在 熒 光 顯 微 術 中 承 當 色 光 的 “ 分流 ” 作 用 。 2.2.3熒 光 顯 微 鏡 的 光 路 熒 光 顯 微 鏡 的 光 學 原 理 圖 根 據(jù) 照 明 方 式 的不 同 ， 熒 光 顯 微 鏡 分 為 落 射 式 熒 光 顯 微 鏡 和 透射 式 熒 光 顯 微 鏡 兩 種 。 目 前 常 用 的 是 落 射 式 熒光 顯 微 鏡 ， 特 點 是 光 源 通 過 物 鏡 落 射 于 樣 品 ，激 發(fā) 產(chǎn) 生 的 熒 光 再 通 過 物 鏡 進 入 目 鏡 。 透 射 熒 光 顯 微 術 光 路 :透 射 熒 光 顯 微 術 是 激發(fā) 光 束 通 過 聚 光 器 自 下 而 上 的 透 射 樣 品 ， 誘 發(fā)的 熒 光 從 物 鏡 前 方 進 入 物 鏡 。 汞 燈 發(fā) 出 的 強 光經(jīng) 集 光 透 鏡 、 吸 熱 濾 色 鏡 、 鏡 臂 反 光 鏡 、 激 發(fā)濾 色 鏡 、 光 路 轉 換 反 光 鏡 后 光 線 轉 射 向 上 ， 進入 視 場 光 闌 ， 暗 視 場 聚 光 器 ， 進 入 樣 品 ， 激 發(fā)出 的 熒 光 射 入 物 鏡 經(jīng) 阻 斷 濾 色 鏡 進 入 目 鏡 。 反 射 熒 光 顯 微 術 的 光 路 :反 射 熒 光 又 稱 落 射熒 光 ， 因 激 發(fā) 光 由 物 鏡 后 部 進 入 物 鏡 ， 向下 落 射 樣 品 ， 激 發(fā) 出 熒 光 ， 熒 光 反 射 向 上再 進 入 物 鏡 。 其 光 路 如 圖 3-1和 3-2所 示 。 汞 燈 發(fā) 出 高 強 的 激 發(fā) 光 ， 經(jīng) 集 光 透 鏡 ，吸 熱 玻 璃 ， 孔 徑 光 闌 ， 激 發(fā) 濾 色 鏡 ， 視 場光 闌 ， 通 過 二 向 色 鏡 ， 在 此 處 一 定 波 長 以上 的 長 波 光 線 透 過 二 向 色 鏡 ， 脫 離 光 路 ，一 定 波 長 以 下 的 短 波 光 線 反 射 向 下 進 入 物鏡 ， 透 過 物 鏡 射 向 樣 品 ， 激 發(fā) 熒 光 物 質 發(fā)出 可 見 的 熒 光 ， 熒 光 反 射 向 上 再 次 進 入 物鏡 ， 復 經(jīng) 二 向 色 鏡 其 中 波 長 較 短 的 光 線 反射 至 光 源 方 向 ， 熒 光 和 長 波 光 線 透 射 向 上經(jīng) 阻 斷 濾 色 鏡 進 入 目 鏡 。 熒 光 顯 微 鏡 的 光 學 原 理 見 圖 3-3： 圖3-1落射熒光顯微鏡光路圖 圖3-2落射熒光顯微鏡光路圖 圖3-3熒光顯微鏡的光學原理 熒光的種類 自 發(fā) 熒 光 （ 固 有 熒 光 ） 二 次 熒 光 熒光顯微鏡的類型1、 透 射 式 熒 光 顯 微 鏡 ： 激 發(fā) 光 源 是 通 過 聚 光鏡 穿 過 標 本 材 料 來 激 發(fā) 熒 光 的 。 常 用 暗 視野 集 光 器 ， 也 可 用 普 通 集 光 器 ， 調 節(jié) 反 光鏡 使 激 發(fā) 光 轉 射 和 旁 射 到 標 本 上 這 是 比較 舊 式 的 熒 光 顯 微 鏡 。 其 優(yōu) 點 是 低 倍 鏡 時熒 光 強 ， 而 缺 點 是 隨 放 大 倍 數(shù) 增 加 其 熒 光減 弱 所 以 對 觀 察 較 大 的 標 本 材 料 較 好 。 透射式熒光顯微鏡效果圖 透射式熒光顯微鏡光路圖 2 落 射 式 熒 光 顯 微 鏡 ： 這 是 近 代 發(fā) 展 起 來 的 新式 熒 光 顯 微 鏡 ， 與 上 不 同 處 是 激 發(fā) 光 從 物 鏡 向 下落 射 到 標 本 表 面 ， 即 用 同 一 物 鏡 作 為 照 明 聚 光 器和 收 集 熒 光 的 物 鏡 (圖 26)。 光 路 中 需 加 上 一 個雙 色 束 分 離 器 ， 它 與 光 鈾 呈 45 角 ， 激 發(fā) 光 被 反射 到 物 鏡 中 ， 并 聚 集 在 樣 品 上 ， 樣 品 所 產(chǎn) 生 的 熒光 以 及 由 物 鏡 透 鏡 表 面 、 蓋 玻 片 表 面 反 射 的 激 發(fā)光 同 時 進 入 物 鏡 ， 反 回 到 雙 色 束 分 離 器 ， 使 激 發(fā)光 和 熒 光 分 開 ， 殘 余 激 發(fā) 光 再 被 阻 斷 濾 片 吸 收 。如 換 用 不 同 的 激 發(fā) 濾 片 雙 色 束 分 離 器 阻 斷 濾片 的 組 合 插 塊 ， 可 滿 足 不 同 熒 光 反 應 產(chǎn) 物 的 需 要 。此 種 熒 光 顯 微 鏡 的 優(yōu) 點 是 視 野 照 明 均 勻 ， 成 像 清晰 ， 放 大 倍 數(shù) 愈 大 熒 光 愈 強 熒光顯微鏡內部構 落射熒光顯微鏡光路圖 使用方法 (1)高 壓 汞 燈 的 調 中 ： 汞 燈 調 中 檢 驗 器 似 物鏡 狀 ， 使 用 時 將 其 全 部 旋 入 物 鏡 轉 換 器 ，中 部 有 一 圓 形 屏 ， 能 映 現(xiàn) 汞 燈 的 電 弧 像 ，用 以 觀 察 調 中 。 按 通 電 源 ， 按 壓 啟 動 鈕 ，點 亮 汞 燈 。 完 全 開 放 視 場 光 闌 和 孔 徑 光 闌 。轉 動 汞 燈 室 右 側 的 水 平 和 垂 直 調 中 螺 旋 ，通 過 調 中 器 圓 形 屏 觀 察 ， 至 調 中 器 內 部 被充 分 照 明 止 。 旋 轉 集 光 透 鏡 調 焦 鈕 ， 使 汞燈 電 弧 像 聚 焦 ， 再 用 調 中 螺 旋 將 電 弧 像 驅于 水 平 對 稱 位 置 （ 調 中 ） 。 (2)光 吸 收 器 的 組 裝 ： 反 射 式 熒 光 裝 置 無 需 聚 光 器 ， 由 一 底 部封 閉 的 圓 筒 狀 的 光 吸 收 器 取 代 ， 用 以 吸 收射 入 的 光 線 ， 防 止 四 射 。 組 裝 方 法 ： 降 下 聚 光 器 架 ， 將 光 吸 收 器插 入 楔 形 神 內 ， 固 緊 、 回 升 最 高 位 。 (3)操 作 程 序 轉 動 鏡 臂 旋 轉 臺 ， 至 相 應 的 標 志 位 。 旋 轉 臺 為一 圓 盤 狀 結 構 ， 上 有 5個 定 位 標 志 ： U、 V、 B、 G、O， 分 別 代 表 不 同 的 熒 光 激 發(fā) 方 法 及 其 不 同 的 濾色 鏡 系 統(tǒng) 組 合 。 點 亮 汞 燈 ， 接 通 電 源 ， 按 壓 啟 動 器 按 鈕 ， 使 汞燈 點 亮 。 將 鏡 臂 左 側 的 DIA轉 換 鈕 調 至 EPI位 。 確 認 汞 燈 點 亮 ， 照 明 系 統(tǒng) 正 確 ， 燈 位 調 中 ， 電弧 像 聚 焦 準 確 。 用 熒 光 染 料 染 色 的 樣 品 ， 放 在 載 物 臺 上 ， 用10 物 鏡 聚 焦 。 孔 徑 光 闌 的 調 整 使 用 ： 光 闌 位 于 鏡 臂 中 ， 用 外露 手 桿 操 縱 。 在 汞 燈 調 中 、 聚 焦 時 ， 光 闌 應 全 開 。熒 光 顯 微 時 ， 孔 徑 應 縮 小 ， 使 之 小 于 視 場 。 視 場 光 闌 的 調 整 使 用 ： 視 場 光 闌 位 于 孔 徑 光 闌之 后 ， 亦 由 外 露 手 桿 操 縱 。 視 場 光 闌 用 于 限 定 樣品 表 面 的 照 明 區(qū) 域 ， 其 開 度 一 般 應 與 孔 徑 光 闌 的開 孔 相 當 。 輔 助 激 發(fā) 濾 色 鏡 滑 動 閥 的 使 用 :滑 動 閥 位 于 鏡 臂專 用 槽 中 ， 可 拉 出 或 推 入 。 有 三 個 擋 位 供 不 同 使用 。 全 拉 出 位 ： 供 常 規(guī) 使 用 ； 中 間 位 ： 用 于 激發(fā) 法 ， 輔 助 濾 色 鏡 進 入 光 路 ； 全 推 入 位 ： 用 作 光閥 ， 阻 斷 全 光 線 激 發(fā) 方 法 ： 共 有 四 種 激 發(fā) 方 法 ： 紫 外 、 紫 、 藍和 綠 激 發(fā) 法 ， 各 適 用 于 各 種 不 同 的 熒 光 染 色 方 法 。 觀察 在演示臺上的熒光顯微鏡下（用藍紫光濾光片），可見經(jīng)0.01的丫啶橙熒光染料染色的細胞，細胞核和細胞質被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光(暗綠色和橙紅色)。 雙重染色標本的單色和雙色觀察