高中生物 專題5 DNA和蛋白質技術 課題3 血紅蛋白的提取和分離課件 新人教版選修11

目標導航預習導引 目標導航預習導引一二一、分離蛋白質的原理與方法1.分離蛋白質的原理2.分離蛋白質的方法(1)凝膠色譜法概念:根據相對分子質量的大小分離蛋白質的有效方法,也叫分配色譜法。 目標導航預習導引一二過程及原理b.分離的過程 目標導航預習導引一二c.分離原理:依據相對分子質量的不同而將蛋白質分離。(2)電泳法電泳的概念:指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。原理:利用了待分離樣品中各種分子的帶電性質的差異、分子本身的大小以及形狀的不同,使帶電分子在電場中產生不同的遷移速度,從而分離樣品中的各種分子。分離方法:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。其中后者使用時通常加入帶負電荷多的SDS,形成“蛋白質-SDS復合物”,使蛋白質遷移速率僅取決于分子的大小。3.緩沖溶液(1)組成:通常由12種緩沖劑溶解于水中配制而成。調節(jié)緩沖劑的使用比例,可配制不同pH的緩沖液。 (2)作用:抵制外界的酸和堿對溶液pH的影響,維持pH基本不變。 目標導航預習導引一二緩沖溶液中含對酸堿起緩沖作用的緩沖對,每一緩沖對均由弱酸和相應的強堿鹽組成。細胞外液也有酸堿緩沖對,你能回憶并說出細胞外液中的酸堿緩沖對嗎?提示：細胞外液中主要的酸堿緩沖對有:H 2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4等。 目標導航預習導引一二二、凝膠色譜法的實驗操作1.蛋白質的提取和分離步驟(1)樣品處理血紅蛋白的釋放:紅細胞在蒸餾水和甲苯作用下破裂,釋放出血紅蛋白分離血紅蛋白溶液:混合液離心過濾去除脂溶性沉淀層用分 液漏斗分離 目標導航預習導引一二(3)純化:凝膠色譜法。(4)純度鑒定:SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。 目標導航預習導引一二2.凝膠色譜操作(1)凝膠色譜柱的制作。(2)凝膠色譜柱的裝填。固定:將色譜柱垂直固定在支架上裝填:將用蒸餾水充分溶脹后的凝膠配成凝膠懸浮液,一次性緩慢倒入色譜柱內,裝填時可輕輕敲動色譜柱,使凝膠裝填均勻洗脫:裝填完后,立即用緩沖液洗脫瓶,在約50 cm高的操作壓下,用300 mL的物質的量濃度為20 mmol/L 的磷酸緩沖液(pH為7.0)充分洗滌平衡凝膠12 h 目標導航預習導引一二(3)樣品的加入與洗脫。加樣前:打開下端的流出口,使柱內凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊,關閉出口。加透析樣品。調整緩沖液面:與凝膠面平齊滴加透析樣品:用吸管將1 mL透析后的樣品加到色譜柱的頂端樣品滲入凝膠床:加樣后,打開下端出口,等樣品完全進入凝膠層后,關閉下端出口 洗脫:打開下端出口,用 20 mmol/L的磷酸緩沖液洗脫 目標導航預習導引一二收集:待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時,用試管收集流出液,每5 mL收集一管,連續(xù)收集 3.操作提示(1)紅細胞的洗滌:洗滌次數、離心速度與離心時間十分重要。洗滌次數過少,無法除去血漿蛋白;離心速度過高和時間過長會使白細胞等一同沉淀,達不到分離效果。(2)色譜柱填料的處理:商品凝膠使用前需直接放在洗脫液中膨脹,可以將加入其中的濕凝膠用沸水浴加熱,加速膨脹。(3)凝膠色譜柱的裝填:在裝填凝膠柱時,不得有氣泡存在。氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序,降低分離效果。(4)蛋白質的分離:如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動,說明色譜柱制 作成功。 目標導航預習導引一二(1)凝膠色譜柱和固定化酶的反應柱都裝填有不能通過“柱”下端多孔板(或多孔篩板)的顆粒,它們的顆粒功能有何不同?提示：凝膠色譜柱裝填的是凝膠顆粒,允許小分子進入,不允許大分子進入,通過延長小分子的路程使大分子與小分子分離。固定化酶的反應柱裝填的是固定有酶的載體顆粒,既能催化反應物的反應,又保證了酶與反應物分子的分離,實現了酶的重復利用,節(jié)約了生產成本。(2)凝膠色譜柱和固定化酶的反應柱都能進行化學反應嗎?提示：不是。固定化酶的反應柱能進行化學反應,凝膠色譜柱不能進行化學反應。 知識精要典題例解遷移應用知識架構一二一、血紅蛋白提取和分離的原理1.分離不同種類蛋白質的原理蛋白質的理化性質(如形狀、大小、電荷性質和多少、溶解度、吸附性質、親和力等)千差萬別,由此可提取和分離各種蛋白質。2.凝膠色譜法(分配色譜法)(1)凝膠:實際上是一些微小的多孔球體,大多數是由多糖類化合物構成的,如葡聚糖、瓊脂糖。(2)原理:凝膠小球體內部有許多貫穿的通道,相對分子質量較大的蛋白質分子不能進入凝膠顆粒內部,只能分布在顆粒之間,通過的路程較短,移動速度較快;相對分子質量較小的蛋白質分子比較容易進入凝膠內的通道,通過的路程較長,移動速度較慢,因此可將各種相對分子質量不同的蛋白質分子分離。 知識精要典題例解遷移應用知識架構一二(3)分離過程:混合物上柱洗脫大分子蛋白質流動快、小分子蛋白質流動慢收集大分子收集小分子。3.緩沖溶液(1)原理:由弱酸和相應的強堿弱酸鹽組成(如H2CO3/NaHCO3,NaH2PO4/Na2HPO4等),調節(jié)酸和鹽的用量,可配制不同pH的緩沖液。(2)緩沖液作用:抵制外界酸、堿對溶液pH的干擾,從而保持pH穩(wěn)定。 知識精要典題例解遷移應用知識架構一二4.凝膠電泳法(1)原理:許多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解離的基團,在一定的pH下,這些基團會帶上正電或負電。在電場的作用下,這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質的差異以及分子本身的大小、形狀的不同,使帶電分子產生不同的遷移速度,從而實現樣品中各種分子的分離。(2)常見分離方法:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。 一二知識精要典題例解遷移應用知識架構【例1】 用凝膠色譜法分離蛋白質的實驗中,相對分子質量不同的兩種蛋白質在凝膠中的行進過程,可表示為圖中哪一個()解析：凝膠色譜法是依據蛋白質相對分子質量的大小不同而將其分離的。相對分子質量較大的蛋白質不能進入凝膠內部通道,路程短,移動快,洗脫出來所用的時間短;相對分子質量較小的蛋白質能進入凝膠內部通道,路程長,移動慢,洗脫出來所用的時間長。答案：B 一二知識精要典題例解遷移應用知識架構 一二知識精要典題例解遷移應用知識架構分離蛋白質不必考慮的因素是()A.分子的形狀和大小 B.蛋白質所帶電荷的性質和多少C.蛋白質的溶解度D.蛋白質肽鍵的結構解析：所有蛋白質的肽鍵結構相同,均為“NHCO”,不作為分離蛋白質考慮的因素。答案：D 一二知識精要典題例解遷移應用知識架構電泳方法 一二知識精要典題例解遷移應用知識架構二、凝膠色譜法的操作流程 一二知識精要典題例解遷移應用知識架構 一二知識精要典題例解遷移應用知識架構【例2】 下列關于紅細胞的洗滌過程的敘述,正確的是()A.低速長時間離心,如500 r/min,12 min,以保證達到很好的分離效果B.離心后用膠頭吸管吸出下層透明的紅色血漿C.將下層暗紅色的紅細胞液體倒入燒杯,再加入五倍體積的蒸餾水D.直至上清液中沒有黃色,表明紅細胞已洗滌干凈解析：紅細胞洗滌過程中,應做低速短時間離心,以避免白細胞、淋巴細胞等一同沉淀,影響血紅蛋白的提純;離心后血漿在上層,并呈現為黃色,需用膠頭吸管吸出;洗滌紅細胞時應用生理鹽水而不用蒸餾水,否則,將導致紅細胞破裂影響實驗結果。因此A、B、C均錯誤。 答案：D 一二知識精要典題例解遷移應用知識架構 一二知識精要典題例解遷移應用知識架構 一二知識精要典題例解遷移應用知識架構利用凝膠色譜法分離蛋白質時,蛋白質洗脫出來的順序是()相對分子質量最大的相對分子質量最小的相對分子質量適中的A.B.C.D.解析：相對分子質量較大的蛋白質容易通過凝膠間隙,先被洗脫出來;相對分子質量較小的蛋白質容易進入凝膠內部,后被洗脫出來;相對分子質量適中的,能進入凝膠的內孔隙中孔徑大小相應的部分,洗脫出來的時間也居中。答案：C 一二知識精要典題例解遷移應用知識架構1.樣品處理、分離與純化的目的不同 一二知識精要典題例解遷移應用知識架構2.分離血紅蛋白溶液的結果 知識架構一二 在裝填凝膠色譜柱時,要注意凝膠裝填的要緊密、均勻。因為如果裝填的不夠緊密、均勻,就會在凝膠色譜柱內形成無效的空隙,使本該進入凝膠內部的樣品分子從這些空隙中通過,攪亂洗脫液的流動次序,影響分離效果。同時在凝膠色譜操作中,不能發(fā)生洗脫液流干,漏出凝膠顆粒的現象。一旦發(fā)生以上現象,凝膠色譜柱必須重新裝填?！纠}】 隨著人類基因組計劃的進展和多種生物基因組測序工作的完成,人類跨入了后基因組和蛋白質組時代。對蛋白質的研究與應用,首先要獲得純度較高的蛋白質。 (導學號52260017) .血紅蛋白提取的具體過程可分為:(1)紅細胞的洗滌。具體操作過程是;(2);(3)分離血紅蛋白溶液。血紅蛋白混合液在離心管中離心后,從上往下數第層是紅色透明液體即為血紅蛋白的水溶液;(4)透析。.透析后的樣品還需經過凝膠色譜法進一步純化,其目的是,裝填凝膠色譜柱時,要注意色譜柱內不能有氣泡,這是因為。 .判斷純化的蛋白質是否達到要求,可用電泳法對樣品進行,電泳是指。 解析：.(1)紅細胞的洗滌目的是去除雜蛋白,過程是將采集的血樣低速短時間離心,吸出上層透明黃色血漿,再用五倍體積的生理鹽水低速短時間離心,重復洗滌三次。(2)血紅蛋白的釋放:在蒸餾水和甲苯作用下,紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液:試管中的溶液分為4層。第1層為無色透明的甲苯層,第2層為白色薄層固體,是脂溶性物質的沉淀層,第3層是紅色透明液體,這是血紅蛋白的水溶液,第4層是其他雜質的暗紅色沉淀物。血紅蛋白混合液在離心管中離心后,從上往下數第3層是紅色透明液體即為血紅蛋白的水溶液。(4)透析:可以去除樣品中相對分子質量較小的雜質,或用于更換樣品的緩沖液。.透析后的樣品還需經過凝膠色譜法進一步純化,其目的是去除相對分子質量較大的雜質蛋白。裝填凝膠色譜柱時,要注意色譜柱內不能有氣泡,這是因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序,降低分離效果。.判斷純化的蛋白質是否達到要求,可用電泳法對樣品進行純度鑒定,電泳是指 帶電離子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。 答案：.(1)將采集的血樣低速短時間離心,吸出上層透明黃色血漿,再用五倍體積的生理鹽水低速短時間離心,重復洗滌三次(2)血紅蛋白的釋放(3)3.去除相對分子質量較大的雜蛋白氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序,降低分離效果.純度鑒定帶電離子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程