實驗熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡使用

實驗七-1細胞熒光染色觀察與熒光顯微鏡的使用（示范：細胞形態(tài)觀察與暗視野顯微鏡的使用） 實驗目的與教學要求1.掌握熒光顯微鏡的成像基本原理及其使用；2.掌握暗視野顯微鏡的成像基本原理及其使用。 熒光顯微鏡是一種較為常用的的光學顯微鏡，其基本原理是利用一定波長的激發(fā)光對樣品進行激發(fā)，使之產(chǎn)生一定波長的熒光，從而用于對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進行定性、定位、定量觀察檢測。一、熒光顯微鏡的成像原理 什 么 是 熒 光 ?n物 質(zhì) 中 的 電 子 吸 收 光 的 能 量 由 低 能 狀 態(tài)轉(zhuǎn) 變 為 高 能 狀 態(tài) ， 再 回 到 低 能 狀 態(tài) 時 釋放 出 的 光 。n即 ： 物 質(zhì) 吸 收 短 波 光 ， 發(fā) 射 出 的 長 波 光 。 n保 持 固 有 的 熒 光 特 性n熒 光 波 長 激 發(fā) 波 長n熒 光 強 度 極 小 于 激 發(fā) 光 的 強 度n有 不 同 程 度 的 衰 減n熒 光 強 度 取 決 于 激 發(fā) 光 強 度 、 被 檢 物 濃 度 、 熒 光 效 率熒 光 的 性 質(zhì) 優(yōu) 點 ：n 檢 出 能 力 高n 對 細 胞 的 刺 激 小n 能 進 行 多 重 染 色用 途 ：n 物 體 構(gòu) 造 的 觀 察n 熒 光 的 有 無 、 色 調(diào) 比 較 進 行 物 質(zhì) 判 別n 發(fā) 熒 光 量 的 測 定 對 物 質(zhì) 定 性 、 定 量 分 析熒 光 顯 微 鏡 的 優(yōu) 點 和 用 途 熒 光 素 激 發(fā) 波 長發(fā)射波長 DAPI 372 456 AMCA 350 450 Hoechst 33258 365 465 FITC 490 520 Acridine Orange 490 590 Acridine Yellow 470 550 CY3 552 565 TRITC 541 572 Propidium Iodide 530 615 1.對細胞結(jié)構(gòu)或組分的定性、定位、半定量研究。2.作為生物大分子篩選與鑒定的標記物。熒光顯微鏡技術(shù)在生命科學研究中的應(yīng)用 二、暗視野顯微鏡的成像原理通過特殊的暗視野聚光器，使照明光線改變途徑，不直接進入物鏡，而是傾斜地照射到樣品上，由樣品表面的繞射光線入射到物鏡內(nèi)，產(chǎn)生樣品的衍射圖象。 三、試劑與器材青蛙、洋蔥、人正常肝組織切片和脂肪肝組織切片（HE染色）甲醇、1 丫啶橙、濾紙、吸管、載玻片熒光顯微鏡、暗視野顯微鏡、普通光學顯微鏡 四、實驗內(nèi)容和實驗步驟1.蛙血細胞染色觀察：取少許蛙血 常規(guī)血涂片 涼干 甲醇固定10 min 1 丫啶橙染色5 min 水洗 室溫干燥（濾紙擦干玻片底面） 熒光顯微鏡觀察（先低倍后高倍觀察） （可在同一玻片上觀察未熒光染色的血細胞）2.取洋蔥撕取一小片內(nèi)表皮平面單層鋪展于玻片上室溫涼干1丫啶橙染色5min 水洗（用吸管，小心掉片） 室溫干燥（或用濾紙擦干） 熒光顯微鏡觀察3.暗視野顯微鏡觀察蛙血細胞（示范）4.觀察人正常肝組織切片和脂肪肝組織切片（HE染色） 1.熒光顯微鏡要在光線盡量暗的環(huán)境下觀察。2.使用熒光顯微鏡時要注意不要直接觀察激發(fā)光源，保護眼睛。3.暗視野顯微鏡要在光線盡量暗的環(huán)境下觀察。 五、注意事項 六、作業(yè)與思考題：1.描述在熒光顯微鏡下所觀察到的實驗現(xiàn)象。2.繪圖比較人正常肝組織細胞和脂肪肝組織細胞。 實驗七-2 激光掃描共聚焦顯微鏡在生命科學中的應(yīng)用 實驗目的與要求1. 掌握激光掃描共聚焦顯微鏡的成像基本原理及其在生命科學中的應(yīng)用。 Laser Scanning Confocal Microscope 1.普通熒光顯微鏡的不足 使用熒光物質(zhì)標記細胞中的特定成分或結(jié)構(gòu)，不僅圖像與對比度增強，而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長的紫外光，大大提高了分辯率（=0.61 / NA ）。但當所觀察的熒光標本稍厚時，普通熒光顯微鏡不僅接收焦平面上的光量，而且來自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡接收，這些來自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的熒光結(jié)構(gòu)模糊、發(fā)虛，原因是大多數(shù)生物學標本是層次區(qū)別的重疊結(jié)構(gòu)）。一、激光掃描共聚焦顯微鏡的成像基本原理 2. 共聚焦掃描顯微鏡的成像原理采用點光源照射標本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對于焦平面上的光點，兩者是共軛的，即光點通過一系列的透鏡，最終可同時聚焦于照明針孔和探測針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測孔范圍之內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點掃描樣品，探測針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應(yīng)光點的共聚焦圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號傳輸至計算機，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。 Confocal Principle 每一幅焦平面圖像實際上是標本的光學橫切面，這個光學橫短面總是有一定厚度的，又稱為光學薄片。由于焦點處的光強遠大于非焦點處的光強，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統(tǒng)的景深近似為零，沿Z軸方向的掃描可以實現(xiàn)光學斷層掃描，形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學切片。把X-Y平面（焦平面）掃描與Z軸（光軸）掃描相結(jié)合，通過累加連續(xù)層次的二維圖像，經(jīng)過專門的計算機軟件處理，可以獲得樣品的三維圖像。 觀察方式：以熒光為主光源：激光（紫外、可見光、近紅外）照明方式：點照明、逐點掃描成像方式：共聚焦、逐點成像輸出：實時觀測,數(shù)字化圖像，可以進行圖像處理和定量分析多重染色樣品的觀察LSCM的基本特點 3. 共聚焦掃描顯微鏡在生命科學研究中的應(yīng)用細胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)（如受體、抗原、抗體、酶、細胞骨架蛋白等基因表達產(chǎn)物）、DNA、RNA等細胞膜流動性（熒光光漂白恢復技術(shù)）細胞內(nèi)氧自由基活性細胞內(nèi)鈣離子濃度變化膜電位 三、試劑與器材青蛙冷丙酮、 DAPI 、甘油/PBS封片劑、濾紙、吸管、載玻片、蓋玻片激光掃描共聚焦顯微鏡 四、實驗步驟1.取涂有細胞的載玻片（細胞涂在中間），冷丙酮40C固定10 min;2. PBS漂洗2次，每次3 min; 3.滴加DAPI溶液100 ul室溫孵育30 min; 4. PBS漂洗3次，每次5min; 5.滴一小滴甘油/PBS封片劑(pH8.5，PBS:甘油=1:9，v/v)封片;6.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。 五、注意事項注意染色時間注意避光 六、作業(yè)與思考題：試述激光掃描共聚焦顯微鏡成像基本原理，并描述實驗中所觀察的現(xiàn)象思考題：激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到的圖象為什么比普通的熒光顯微鏡的清晰度、層次感要強許多？