實(shí)驗(yàn)九底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響

底 物 濃 度 對 酶 促 反 應(yīng) 速 度 的 影 響 實(shí) 驗(yàn) 目 的 1 了 解 底 物 濃 度 對 酶 促 反 應(yīng) 速 度 的 影 響 。 2 學(xué) 習(xí) 測 定 米 氏 常 數(shù) 的 原 理 和 方 法 。 實(shí) 驗(yàn) 原 理1913年 ， Michaelis和 Menten提 出 了 酶 促 反 應(yīng) 速 度 和 底 物 濃度 的 關(guān) 系 式 ， 即 米 氏 方 程 。 V S / ( Km+S )式 中 ： 為 反 應(yīng) 初 速 度 V為 最 大 反 應(yīng) 速 度 S為 底 物 濃 度 Km為 米 氏 常 數(shù) Km值 是 酶 的 一 個(gè) 特 征 性 常 數(shù) ， 可 近 似 表 示 酶 與 底 物 的 親 和力 。 Lineweaver-Burk作 圖 法 是 用 實(shí) 驗(yàn) 方 法 測 定 Km值 的 最 常 用 的方 法 。 1 Km 1 1 = + V Vmax S Vmax -4 -2 0 2 4 6 8 100.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1/S(1/mmol.L-1) 1/v 1/Vmax 斜 率 =K m/Vmax-1/K m 米 氏 常 數(shù) Km的 測 定 n 實(shí) 驗(yàn) 時(shí) 選 擇 不 同 的 S， 測 定 相 對 應(yīng) 的 。 求出 兩 者 的 倒 數(shù) ， 以 1/ 對 1/S作 圖 ， 則 得 到 一個(gè) 斜 率 為 Km/V的 直 線 。 將 直 線 外 推 與 橫 軸 相 交 ，其 橫 軸 截 矩 為 ： 1/S 1/ Km， 由 此 求 出 Km值 。該 法 比 較 簡 便 。n 本 實(shí) 驗(yàn) 以 胰 蛋 白 酶 消 化 酪 蛋 白 為 例 ， 采 用Lineweaver-Burk雙 倒 數(shù) 作 圖 法 測 定 Km值 。n 胰 蛋 白 酶 能 催 化 蛋 白 質(zhì) 中 堿 性 氨 基 酸 （ L 精氨 酸 和 L 賴 氨 酸 ） 的 羧 基 所 形 成 的 肽 鍵 水 解 。水 解 時(shí) 生 成 自 由 氨 基 酸 ， 故 可 用 甲 醛 滴 定 法 判 斷自 由 氨 基 增 加 的 數(shù) 量 來 追 蹤 反 應(yīng) 。 n 甲 醛 滴 定 法 由 于 氨 基 酸 分 子 在 溶 液 中 主 要 是 兩 性 離 子 ， 故 不 能 用 酸 、 堿 滴 定 其 含量 。 但 氨 基 酸 的 氨 基 可 與 甲 醛 反 應(yīng) 生 成 羥 甲 基 和 二 羥 甲 基 氨 基 酸 ， 使 上 述 平 衡 向 右 移動 ， 促 使 氨 基 酸 分 子 上 的 一 NH3十 基 解 離 釋 放 出 H+， 從 而 使 溶 液 酸 性 增 加 ， 就 可 以 酚酞 作 指 示 劑 用 NaOH來 滴 定 。 n 小 知 識 點(diǎn) ：n 酚 酞 是 堿 性 指 示 劑 （ 變 色 范 圍 是 堿 性 ） ， 酸 滴堿 時(shí) 用 堿 性 指 示 劑 ； 反 之 堿 滴 酸 時(shí) 用 酸 性 指 示劑 比 如 甲 基 橙 甲 基 紅 。 n 三 、 器 材 n 錐 形 瓶 滴 定 管 移 液 管 水 浴鍋 量 筒 等n 四 、 試 劑 與 材 料n 1. 酪 蛋 白n 2. 胰 蛋 白 酶n 3. 甲 醛n 4. 酚 酞 n 5. 氫 氧 化 鈉 五 、 操 作 分 別 向 6個(gè) 小 錐 形 瓶 中 加 入 5 mL甲 醛 溶 液 和 1滴酚 酞 ， 并 滴 加 0.1 mol/L標(biāo) 準(zhǔn) 氫 氧 化 鈉 溶 液 ， 直 至混 合 物 呈 微 粉 紅 色 。 注 意 ： 每 個(gè) 錐 形 瓶 中 的 顏 色 應(yīng)一 致 。 取 100 mL酪 蛋 白 溶 液 ， 加 入 另 一 錐 形 瓶 中 ， 在37 水 浴 中 保 溫 10分 鐘 。 將 胰 蛋 白 酶 也 在 37 水浴 中 保 溫 10分 鐘 。 然 后 精 確 量 取 10 mL酶 液 加 到 酪蛋 白 溶 液 中 （ 同 時(shí) 計(jì) 時(shí) ） 。 充 分 混 合 后 ， 隨 即 取 出 10 mL反 應(yīng) 混 合 物（ 作 為 零 時(shí) 的 樣 品 ） 吹 至 一 含 甲 醛 的 錐 形 瓶 中 。用 0.1 mol/LNaOH溶 液 滴 定 ， 直 至 混 合 物 呈 微 粉紅 色 ， 記 下 所 用 0.1 mol/LNaOH溶 液 的 mL數(shù) 。 在 2、 4、 6、 8和 10分 鐘 時(shí) ， 分 別 取 出 10 mL消 化樣 品 ， 準(zhǔn) 確 照 上 法 操 作 。 注 意 ： 在 每 個(gè) 樣 品 中 滴 定 終點(diǎn) 的 顏 色 應(yīng) 當(dāng) 一 致 。 用 增 加 的 滴 定 度 對 時(shí) 間 作 圖 ， 測定 初 速 度 。 配 制 不 同 濃 度 的 酪 蛋 白 溶 液 （ 7.5、 10、 15、 20、30 g/L） 測 定 不 同 底 物 濃 度 時(shí) 的 活 力 。 用 實(shí) 驗(yàn) 測 得 的 結(jié) 果 ， 以 以 1/ 對 1/S作 圖 ， 求出 V和 Km的 數(shù) 值 。 n 【 注 意 事 項(xiàng) 】n 1 實(shí) 驗(yàn) 表 明 ， 反 應(yīng) 速 度 只 在 最 初 一 段 時(shí) 間 內(nèi) 保 持 恒 定 ，隨 著 反 應(yīng) 時(shí) 間 的 延 長 ， 酶 促 反 應(yīng) 速 度 逐 漸 下 降 。 原 因有 多 種 ， 如 底 物 濃 度 降 低 ， 產(chǎn) 物 濃 度 增 加 而 對 酶 產(chǎn) 生抑 制 作 用 并 加 速 逆 反 應(yīng) 的 進(jìn) 行 ， 酶 在 一 定 pH及 溫 度 下部 分 失 活 等 。 因 此 ， 研 究 酶 的 活 力 以 酶 促 反 應(yīng) 的 初 速度 為 準(zhǔn) 。n 2 本 實(shí) 驗(yàn) 是 一 個(gè) 定 量 測 定 方 法 ， 為 獲 得 準(zhǔn) 確 的 實(shí) 驗(yàn) 結(jié)果 ， 應(yīng) 盡 量 減 少 實(shí) 驗(yàn) 操 作 中 帶 來 的 誤 差 。 因 此 配 制 各種 底 物 溶 液 時(shí) 應(yīng) 用 同 一 母 液 進(jìn) 行 稀 釋 ， 保 證 底 物 濃 度的 準(zhǔn) 確 性 。 各 種 試 劑 的 加 量 也 應(yīng) 準(zhǔn) 確 ， 并 嚴(yán) 格 控 制 準(zhǔn)確 的 酶 促 反 應(yīng) 時(shí) 間 。 n 【 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 】n 1 測 定 并 計(jì) 算 酶 促 反 應(yīng) 速 度 。n 2 用 實(shí) 驗(yàn) 所 得 的 反 應(yīng) 速 度 ， 對 相 應(yīng) 的 底 物 濃度 作 圖 。 n 【 實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告 】n 總 結(jié) 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 ， 并 回 答 如 下 問 題 ：n 1 試 述 底 物 濃 度 對 酶 促 反 應(yīng) 速 度 的 影 響 。n 2 在 什 么 條 件 下 ， 測 定 酶 的 Km值 可 以 作 為 鑒定 酶 的 一 種 手 段 ， 為 什 么 ？n 3 米 氏 方 程 中 的 Km值 有 何 實(shí) 際 應(yīng) 用 ？