激光共聚焦顯微鏡原理

激 光 共 聚 焦 顯 微 鏡 原 理 和 應(yīng) 用 激 光 掃 描 共 聚 焦 顯 微 鏡 LSCMLASER SCANNING CONFOCAL MICROSCOPE 以 激 光 作 為 光 源 ， 激 光 器 發(fā) 出 的 激 光 通 過 照明 針 孔 形 成 點(diǎn) 光 源 ， 經(jīng) 過 透 鏡 、 分 光 鏡 形 成 平 行光 后 ， 再 通 過 物 鏡 聚 焦 在 樣 品 上 ， 并 對(duì) 樣 品 內(nèi) 聚焦 平 面 上 的 每 一 點(diǎn) 進(jìn) 行 掃 描 。 樣 品 被 激 光 激 發(fā) 后的 出 射 光 波 長 比 入 射 光 長 ， 可 通 過 分 光 鏡 ， 經(jīng) 過透 鏡 再 次 聚 焦 ， 到 達(dá) 探 測 針 孔 處 ， 被 后 續(xù) 的 光 電倍 增 管 檢 測 到 ， 并 在 顯 示 器 上 成 像 ， 得 到 所 需 的熒 光 圖 像 ， 而 非 聚 焦 光 線 被 探 測 針 孔 光 欄 阻 擋 ，不 能 通 過 探 測 針 孔 ， 因 而 不 能 在 顯 示 器 上 顯 出 熒光 信 號(hào) 。 這 種 雙 共 軛 成 像 方 式 稱 為 共 聚 焦 。 因 采用 激 光 作 為 光 源 ， 故 稱 之 為 “ 激 光 掃 描 共 聚 焦 顯微 鏡 ” 。 發(fā) 展 歷 史 1957年 ， Malwin Minsky在 其 專 利 中 首 次 闡 明 了 激 光 共 聚 焦 顯 微 鏡 技術(shù) 的 基 本 工 作 原 理 ， 1967年 ， Egger第 一 次 成 功 能 共 聚 焦 顯 微 鏡 產(chǎn) 生 了 一 個(gè) 光 學(xué) 橫 斷 面 ， 1970年 ， Sheppard和 Wilson 推 出 第 一 臺(tái) 單 光 束 共 聚 集 激 光 掃 描 顯 微鏡 1987年 ， White 和 Amos在 Nature雜 志 發(fā) 表 了 “ Confocal microscopy come of age” ,標(biāo) 志 著 LSCM已 成 為 科 學(xué) 研 究 的 重 要 工 具 。 普 通 熒 光 顯 微 鏡 和 激 光 共 聚 焦 顯 微 鏡 圖 像 的 差 別 激 光 共 聚 焦 顯 微 鏡 的 基 本 原 理利 用 放 置 在 光 源 后 的 照 明 針 孔(P1)和 放 置 在 檢 測 器 前 的 探 測 針孔 (P2)實(shí) 現(xiàn) 點(diǎn) 照 明 和 點(diǎn) 探 測 ； 激光 經(jīng) 過 照 明 針 孔 形 成 點(diǎn) 光 源 ，由 物 鏡 聚 焦 在 樣 品 焦 面 的 某 個(gè)點(diǎn) 上 ， 只 有 該 點(diǎn) 所 發(fā) 射 的 熒 光成 像 在 探 測 針 孔 上 ， 該 點(diǎn) 以 外的 任 何 發(fā) 射 光 線 被 探 測 器 阻 擋 ，不 能 到 達(dá) PMT探 測 器 ， 從 而 提高 了 成 像 效 果 。 照 明 針 孔 和 探測 針 孔 共 焦 ， 共 焦 點(diǎn) 為 被 探 測點(diǎn) ， 被 探 測 點(diǎn) 所 在 的 平 面 為 共焦 平 面 。 LSCM的 基 本 組 成 激 光 發(fā) 射 器 顯 微 鏡 部 分 掃 描 裝 置 計(jì) 算 機(jī) 系 統(tǒng) 基 本 結(jié) 構(gòu) 激 光 光 源 LASER “Light amplification by stimulated emission of radiation” 受 激 發(fā) 射 的 輻 射 光 放 大 。 激 光 光 源 的 產(chǎn) 生 受 激 吸 收 ： 處 于 較 低 能 級(jí) 的 粒 子 在 受 到 外 界 的 激 發(fā) （ 即 與 其 他 的 粒 子 發(fā) 生 了 有能 量 交 換 的 相 互 作 用 ， 如 與 光 子 發(fā) 生 非 彈 性 碰 撞 ） ， 吸 收 了 能 量 時(shí) ， 躍 遷 到 與此 能 量 相 對(duì) 應(yīng) 的 較 高 能 級(jí) 。 自 發(fā) 輻 射 ： 粒 子 受 到 激 發(fā) 而 進(jìn) 入 的 激 發(fā) 態(tài) ， 不 是 粒 子 的 穩(wěn) 定 狀 態(tài) ， 自 發(fā) 地 從 高能 級(jí) 激 發(fā) 態(tài) （ E2） 向 低 能 級(jí) （ E1） 躍 遷 ， 同 時(shí) 產(chǎn) 生 光 輻 射 的 過 程 。 眾 多 原 子以 自 發(fā) 輻 射 發(fā) 出 的 光 ， 不 具 有 相 位 、 偏 振 態(tài) 、 傳 播 方 向 上 的 一 致 ， 是 物 理 上 所說 的 非 相 干 光 。 受 激 輻 射 ： 除 自 發(fā) 輻 射 外 ， 處 于 高 能 級(jí) E2上 的 粒 子 還 可 以 另 一 方 式 躍 遷 到 較 低能 級(jí) 。 當(dāng) 一 個(gè) 外 來 光 子 帶 來 的 能 量 正 好 對(duì) 應(yīng) 能 級(jí) 差 時(shí) （ E2-E1） ， 也 會(huì) 引 發(fā) 粒子 以 一 定 的 概 率 ， 迅 速 地 從 能 級(jí) E2躍 遷 到 能 級(jí) E1， 同 時(shí) 輻 射 一 個(gè) 與 外 來 光 子頻 率 、 相 位 、 偏 振 態(tài) 以 及 傳 播 方 向 都 相 同 的 光 子 的 過 程 。 受 激 輻 射 激 光 光 源 的 產(chǎn) 生 單 色 性 好 方 向 性 好 亮 度 高 相 干 和 偏 振 性 好激 光 的 特 征激 光 就 是 受 激 幅 射 產(chǎn) 生 的 ， 激 光 束 里 處 于 相 同 狀 態(tài) 的 光 子 是 相 干的 ， 偏 振 的 ， 并 沿 同 一 方 向 傳 播 的 。激 光 器 ： 405， 440， 635， 488， 559 掃 描 器 系 統(tǒng) 針 孔 ： confocal一 個(gè) 重 要 組 成 部 分 ， 它 是 放 在 檢 測 器 及 激 光 光源 前 面 的 一 個(gè) 小 孔 ， 作 用 是 控 制 光 切 片 的 厚 度 ， 對(duì) 實(shí) 現(xiàn) 斷 層 掃描 成 像 ， 排 除 焦 面 雜 散 光 起 關(guān) 鍵 作 用 分 光 鏡 ： 作 用 是 按 照 波 長 來 改 變 光 線 的 傳 播 方 向 。 發(fā) 射 熒 光 分 色 鏡 ： 作 用 是 選 擇 出 一 定 的 波 長 范 圍 的 光 進(jìn) 行 檢 測 ，不 同 型 號(hào) 的 儀 器 采 用 的 分 色 器 的 部 件 有 所 不 同 。 目 前 用 于 分 色器 的 部 件 主 要 由 濾 光 片 、 棱 鏡 和 光 柵 三 種 類 型 。 檢 測 器 ： 采 用 高 靈 敏 度 的 光 電 倍 增 管 ， 其 檢 測 的 范 圍 和 靈 敏 度可 根 據(jù) 強(qiáng) 度 進(jìn) 行 連 續(xù) 調(diào) 節(jié) 。 熒 光 顯 微 鏡 系 統(tǒng) 類 型 ： 正 置 ， 倒 置 光 路 ： 光 源 ： 汞 燈 、 氙 燈 ， 觀 察 分 辨 樣 品 中 產(chǎn) 生 熒 光 物 質(zhì) 的 成 分 與 位置 。 源 發(fā) 濾 光 片 ： 選 擇 適 合 熒 光 物 質(zhì) 激 發(fā) 波 波 長 的 范 圍 雙 色 分 光 鏡 ： 初 步 分 開 激 發(fā) 和 發(fā) 射 光 組 件 、 阻 濾 片 ： 獲 得 更 純 的 發(fā) 射 熒 光 物 鏡 ： 激 發(fā) 和 發(fā) 射 都 由 同 一 物 鏡 實(shí) 現(xiàn) 。 目 鏡 ： 10 用 于 LSCM的 熒 光 顯 微 鏡 ： 側(cè) 面 有 掃 描 器 接 口 ， 裝 有 微 量 步 進(jìn)馬 達(dá) ， 有 防 振 裝 置 ， 有 光 路 轉(zhuǎn) 換 裝 置 ， 配 高 數(shù) 值 孔 徑 的 物 鏡 。 計(jì) 算 機(jī) 系 統(tǒng) 數(shù) 據(jù) 采 集 、 處 理 、 轉(zhuǎn) 換 、 應(yīng) 用 軟 件 基 本 功 能 多 種 圖 像 掃 描 方 式 2D: xy， xz， xt 3D： XYZ， Xyt 4D： XYZt 光 譜 掃 描 多 色 熒 光 同 時(shí) 檢 測 ： 圖 像 分 析 與 定 量 處 理 ： 3D重 建 ， 立 體 重 建 ， 斷 面 輪 廓 分 析 。 圖 像 分 析 ： 特 定 區(qū) 域 的 強(qiáng) 度 、 周 長 的 測 量 ， 以 及 延 時(shí) 觀 察 分 析 t等 。 熒 光 光 譜 拆 分 組 織 和 細(xì) 胞 中 的 熒 光 來 源 自 發(fā) 熒 光 ： 指 組 織 細(xì) 胞 不 經(jīng) 過 任 何 熒 光 染 色 便 能 在 短 波 長 光 的激 發(fā) 下 發(fā) 射 出 的 熒 光 ， GFP就 具 有 自 發(fā) 熒 光 ， 是 標(biāo) 記 靶 蛋 白 的特 異 性 熒 光 探 針 。 熒 光 染 色 ： 很 多 熒 光 染 料 與 組 織 細(xì) 胞 作 用 ， 能 夠 在 光 的 作 用 發(fā)出 特 征 波 長 的 熒 光 ， 借 以 觀 察 組 織 細(xì) 胞 的 形 態(tài) 結(jié) 構(gòu) 、 化 學(xué) 組 成和 功 能 。 有 些 可 做 活 體 染 色 。 免 疫 熒 光 ： 熒 光 抗 體 法 產(chǎn) 生 熒 光 。 外 源 性 熒 光 物 質(zhì) 進(jìn) 入 組 織 內(nèi) 產(chǎn) 生 的 熒 光 。 某 些 藥 物 誘 發(fā) 熒 光 ： 生 物 胺 類 能 與 某 些 醛 類 物 質(zhì) 在 一 定 條 件 下 縮 合 而 發(fā)生 熒 光 。 酶 致 熒 光 ： 某 些 酶 的 反 應(yīng) 能 夠 發(fā) 射 熒 光 。LSCM主 要 用 于 測 定 具 有 熒 光 的 樣 品 ， 因 此 對(duì) 本 身 沒有 特 征 熒 光 的 生 物 樣 品 ， 就 需 要 用 熒 光 標(biāo) 記 的 方 法 使樣 品 待 測 物 質(zhì) 具 有 熒 光 ， 然 后 再 進(jìn) 行 檢 測 。 熒 光 探 針 熒 光 標(biāo) 記 與 熒 光 探 針 ： 采 用 一 定 的 標(biāo) 記 物 ， 使 樣 品 待 測 物質(zhì) 具 有 特 定 的 熒 光 特 征 ， 這 種 標(biāo) 記 物 被 稱 為 熒 光 探 針 。 這種 組 樣 品 賦 予 特 征 熒 光 的 操 作 過 程 稱 為 熒 光 標(biāo) 記 。 熒 光 探 針 的 種 類 ： 蛋 白 質(zhì) 、 單 糖 和 多 糖 探 針 ， 細(xì) 胞 器 探 針 、核 酸 探 針 、 細(xì) 胞 活 性 探 針 、 膜 結(jié) 合 受 體 探 針 等 。 如 何 選 擇 探 針 根 據(jù) 實(shí) 驗(yàn) 目 的 確 定 需 要 檢 定 的 指 標(biāo) 確 定 可 供 選 擇 的 熒 光 探 針 的 范 圍 ： 根 據(jù) 需 要 檢 測 的 指 標(biāo) ， 選 擇應(yīng) 成 熟 的 探 針 或 標(biāo) 記 方 法 。 可 通 過 查 找 文 獻(xiàn) 和 試 劑 公 司 產(chǎn) 品 目錄 確 定 可 以 標(biāo) 記 待 測 物 的 熒 光 探 針 的 種 類 或 范 圍 。 考 慮 熒 光 探 針 的 特 性 ： 熒 光 探 針 與 樣 品 的 反 應(yīng) 特 性 （ 與 待 測 分子 或 離 子 反 應(yīng) 的 選 擇 性 或 專 一 性 等 ） ， 熒 光 探 針 的 靈 敏 度 和 熒光 強(qiáng) 度 ， 熒 光 探 針 標(biāo) 記 后 樣 品 的 光 譜 特 征 （ 需 要 在 儀 器 的 檢 測范 圍 內(nèi) ） ， 熒 光 的 穩(wěn) 定 性 ， 樣 品 中 多 重 熒 光 的 相 互 影 響 （ 避 免光 譜 交 叉 ） 。 熒 光 樣 品 的 制 備 要 求 熒 光 標(biāo) 記 反 應(yīng) 特 異 性 強(qiáng) ， 熒 光 信 號(hào) 定 位 準(zhǔn) 確 保 持 樣 品 應(yīng) 有 的 形 態(tài) 結(jié) 構(gòu) 的 完 整 性 熒 光 信 號(hào) 響 應(yīng) 百 準(zhǔn) 確 靈 敏 ， 具 有 可 重 復(fù) 性 熒 光 強(qiáng) 度 適 度 熒 光 穩(wěn) 定 性 好 。 樣 品 的 熒 光 分 布 均 勻 兩 種 或 兩 種 以 上 的 熒 光 信 號(hào) 之 間 熒 光 光 譜 交 叉 可 以 得 到 消 除 。 圖 象 背 景 干 凈 ， 干 擾 雜 質(zhì) 少 。 熒 光 樣 品 的 制 備 過 程 樣 品 的 預(yù) 處 理組 織 切 片 樣 品 的 處 理 ： 活 組 織 切 片 ， 無 需 固 定 ， 可 觀 察 和 測 定 活 性狀 態(tài) 下 的 一 些 生 理 指 標(biāo) ， 缺 點(diǎn) 是 保 存 條 件 高 ， 時(shí) 間 短 ， 切 片 厚 。 冰凍 切 片 ： 熒 光 背 景 低 ， 引 入 雜 質(zhì) 干 擾 少 。 固 定 組 織 切 片 ： 易 操 作 ，樣 品 易 保 存 ， 但 易 引 入 干 擾 熒 光 。細(xì) 胞 樣 本 制 備 ： 雜 細(xì) 胞 的 干 擾 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 ， 需 要 注 意 鑒 別 細(xì) 胞 的 種 類和 純 度 。 細(xì) 胞 密 度 約 在 20-80%， 活 的 細(xì) 胞 需 用 專 用 培 養(yǎng) 皿 。 用 熒 光 探 針 標(biāo) 記 樣 品標(biāo) 記 方 式 ： 直 接 標(biāo) 記 ， 生 物 樣 品 與 熒 光 探 針 直 接 作 用 ， 使 樣 品 具 有熒 光 。 間 接 標(biāo) 記 法 ： 熒 光 探 針 將 某 些 特 定 分 子 標(biāo) 記 ， 這 些 特 定 分 子再 與 細(xì) 胞 作 用 ， 使 樣 品 具 有 熒 光 ， 如 免 疫 熒 光 法 ， 熒 光 標(biāo) 記 的 藥 物 。顯 微 注 射 法 ： 利 用 顯 微 注 射 向 細(xì) 胞 內(nèi) 導(dǎo) 入 熒 光 探 針 ， 此 法 得 到 的 熒光 細(xì) 胞 少 ， 適 合 監(jiān) 測 少 量 細(xì) 胞 。 膜 通 透 法 ： 利 用 透 膜 劑 ， 低 滲 培 養(yǎng)液 短 期 刺 激 增 強(qiáng) 探 針 跨 膜 能 力 ， 從 而 使 探 針 進(jìn) 入 細(xì) 胞 中 。確 定 熒 光 探 針 標(biāo) 記 樣 品 的 條 件 ： 標(biāo) 記 探 針 的 濃 度 ， 反 應(yīng) 溫 度 ， 時(shí) 間等 。 熒 光 探 針 標(biāo) 記 的 注 意 事 項(xiàng) 熒 光 強(qiáng) 度 過 高 ： 看 不 清 細(xì) 胞 結(jié) 構(gòu) 細(xì) 節(jié) ， 不 利 于 形 態(tài) 觀 察 ， 可 降低 探 針 濃 度 ， 減 少 反 應(yīng) 時(shí) 間 。 熒 光 強(qiáng) 度 弱 ： 熒 光 探 針 濃 度 過 低 ， 標(biāo) 記 條 件 不 當(dāng) ， 探 針 溶 解 不充 分 ， 探 針 選 擇 錯(cuò) 誤 等 。 在 操 作 過 程 中 ， 避 免 對(duì) 樣 品 造 成 損 傷 防 止 影 響 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 熒 光 標(biāo) 記 要 避 光 進(jìn) 行 。 防 止 非 特 異 性 標(biāo) 記 ， 設(shè) 立 正 確 的 對(duì) 照 組 。 熒 光 標(biāo) 記 后 要 盡 快 上 機(jī) 采 集 圖 像 。 LSCM的 優(yōu) 越 性 動(dòng) 態(tài) 連 續(xù) 掃 描 及 三 維 圖 像 重 組 LSCM可 以 對(duì) 對(duì) 活 細(xì) 胞 和組 織 或 細(xì) 胞 切 片 樣 品 的 不 同 層 面 進(jìn) 行 連 續(xù) 逐 層 掃 描 , 來 獲 得 各 個(gè)層 面 的 圖 像 ， 即 所 謂 的 “ 無 損 傷 的 光 學(xué) 切 片 ” 。 激 光 掃 描 共 聚焦 顯 微 鏡 掃 描 的 每 個(gè) 層 面 之 間 的 間 距 可 以 達(dá) 到 0.1um甚 至 更 小 。獲 得 的 圖 像 通 過 計(jì) 算 機(jī) 重 組 ， 可 獲 得 精 細(xì) 的 細(xì) 胞 骨 架 、 染 色 體 、細(xì) 胞 器 和 細(xì) 胞 膜 系 統(tǒng) 的 三 維 圖 像 。 與 普 通 光 學(xué) 顯 微 鏡 獲 得 的 圖像 相 比 ， LSCM所 得 到 的 重 組 三 維 圖 像 清 晰 度 高 、 立 體 感 強(qiáng) , 可 通 過 計(jì) 算 機(jī) 軟 件 對(duì) 細(xì) 胞 內(nèi) 所 研 究 的 結(jié) 構(gòu) 進(jìn) 行 各 種 測 量 ， 對(duì) 細(xì)胞 內(nèi) 的 空 間 結(jié) 構(gòu) 和 某 些 物 質(zhì) 在 細(xì) 胞 內(nèi) 的 定 位 方 面 的 研 究 中 有 廣泛 的 應(yīng) 用 。 同 時(shí) 多 種 物 質(zhì) 標(biāo) 記 利 用 LSCM， 通 過 對(duì) 膜 上 、 胞 漿 內(nèi) 多 種物 質(zhì) 的 熒 光 標(biāo) 記 ， 可 以 實(shí) 現(xiàn) 在 同 一 樣 品 上 同 時(shí) 進(jìn) 行 多 重 物 質(zhì) 的觀 察 ， 比 如 檢 測 細(xì) 胞 內(nèi) 鈉 、 鈣 、 鎂 等 離 子 濃 度 的 比 率 及 動(dòng) 態(tài) 變化LSCM的 優(yōu) 越 性 瞬 時(shí) 分 辨 率 高 可 以 實(shí) 時(shí) 動(dòng) 態(tài) 觀 察 活 體 組 織 標(biāo) 本 。 LSCM 的熒 光 檢 測 器 可 以 毫 秒 級(jí) 或 微 秒 級(jí) 的 速 度 檢 測 熒 光 ， 即 其 時(shí) 間 分辨 率 極 高 ， 能 對(duì) 細(xì) 胞 內(nèi) 的 分 子 進(jìn) 行 功 能 性 動(dòng) 態(tài) 觀 察 。 LSCM技術(shù) 可 對(duì) 活 細(xì) 胞 在 無 損 傷 處 理 的 情 況 下 進(jìn) 行 觀 察 ， 跟 蹤 活 細(xì) 胞 內(nèi)的 物 質(zhì) 或 結(jié) 構(gòu) 和 生 理 過 程 隨 時(shí) 間 變 化 的 情 況 ， 得 到 實(shí) 時(shí) 動(dòng) 態(tài) 的連 續(xù) 圖 像 。LSCM的 優(yōu) 越 性 高 質(zhì) 量 數(shù) 字 圖 像 普 通 顯 微 鏡 采 用 的 自 然 光 或 燈 光 是 一 種 場光 源 ， 標(biāo) 本 上 每 一 點(diǎn) 的 圖 像 都 會(huì) 受 到 鄰 近 點(diǎn) 的 衍 射 光 或 散 射 光的 干 擾 。 LSCM以 激 光 為 光 源 ， 激 光 具 有 單 色 性 強(qiáng) 、 方 向 性 好 、高 亮 度 相 干 性 好 等 優(yōu) 點(diǎn) ， 可 以 避 免 普 通 顯 微 鏡 的 缺 點(diǎn) 。 一 般常 用 的 氣 體 激 光 器 如 氬 (Ar) 氪 (Kr) 氦 (He) 氖 (Ne)。 由 于LSCM的 樣 品 焦 平 面 以 外 的 點(diǎn) 不 會(huì) 在 探 測 針 孔 處 成 像 ， 這 樣 就避 免 了 傳 統(tǒng) 光 學(xué) 顯 微 鏡 由 于 光 散 射 造 成 的 圖 像 信 噪 比 降 低 ， 圖像 清 晰 度 和 分 辨 率 不 高 的 缺 點(diǎn) 。 而 且 ， LSCM的 圖 像 是 以 電 信號(hào) 的 形 式 記 錄 下 來 的 ， 可 以 采 用 各 種 模 擬 的 和 數(shù) 字 的 電 子 技 術(shù)進(jìn) 行 各 種 圖 像 處 理 。LSCM的 優(yōu) 越 性 LSCM在 生 物 醫(yī) 學(xué) 中 的 應(yīng) 用 組 織 和 細(xì) 胞 中 分 子 或 結(jié) 構(gòu) 的 定 位 ， 定 量 分 析 ： 利 用 LSCM可 以 在 細(xì) 胞 原 位 用 特 異 的 熒 光 標(biāo) 記 探 針 標(biāo) 記 出 核 酸 、 蛋 白質(zhì) 、 多 肽 、 酶 、 激 素 、 磷 脂 、 多 糖 、 受 體 等 分 子 ， 實(shí) 現(xiàn) 對(duì)其 定 位 、 定 性 和 定 量 檢 測 ， 也 可 觀 察 細(xì) 胞 及 亞 細(xì) 胞 形 態(tài) 結(jié)構(gòu) 。 如 在 細(xì) 胞 原 位 檢 測 核 酸 、 原 位 檢 測 蛋 白 ， 抗 體 及 其 他分 子 ， 檢 測 細(xì) 胞 凋 亡 、 細(xì) 胞 器 觀 察 及 測 定 ， 檢 測 細(xì) 胞 整 合 、觀 察 細(xì) 胞 骨 架 ， 檢 測 細(xì) 胞 間 縫 隙 連 接 通 訊 等 多 種 應(yīng) 用 。 標(biāo)本 的 制 備 方 法 主 要 有 免 疫 熒 光 組 織 和 細(xì) 胞 化 學(xué) 法 、 熒 光 蛋白 標(biāo) 記 分 子 法 ， 熒 光 細(xì) 胞 染 料 標(biāo) 記 法 等 。 LSCM不 但 可 對(duì)單 標(biāo) 記 或 雙 標(biāo) 記 細(xì) 胞 及 組 織 標(biāo) 本 的 共 聚 焦 熒 光 進(jìn) 行 定 量 分析 ， 還 可 利 用 沿 縱 軸 上 移 動(dòng) 標(biāo) 本 進(jìn) 行 多 個(gè) 光 學(xué) 切 片 的 疊 加形 成 組 織 或 細(xì) 胞 中 熒 光 標(biāo) 記 結(jié) 構(gòu) 的 總 體 圖 像 ， 以 顯 示 熒 光在 形 態(tài) 結(jié) 構(gòu) 上 的 精 確 定 位 。 原 位 檢 測 細(xì) 胞 中 的 核 酸 用 于 細(xì) 胞 核 的 定 位 及 形 態(tài) 學(xué) 觀 察 ， 檢 測 細(xì) 胞 內(nèi) DNA的 復(fù) 制 及 斷 裂 情 況 以 及 染 色 體 定 位 觀 察 等 。 常 的 熒 光 探 針 ： PI,EB， DAPI, AO, TOTO-1等 熒 光 原 位 雜 交 （ FISH） 利 用 非 放 射 性 的 熒 光 信 號(hào) 對(duì) 原 位 雜 交 樣 本 進(jìn) 行 檢 測 的技 術(shù) 。 用 標(biāo) 記 有 熒 光 的 DNA或 RNA為 探 針 ， 在 原 位測 組 織 細(xì) 胞 內(nèi) 特 定 的 DNA或 RNA片 斷 ， 從 而 對(duì) 染 色體 或 基 因 異 常 的 細(xì) 胞 、 組 織 樣 本 進(jìn) 行 檢 測 和 診 斷 。 把熒 光 信 號(hào) 的 高 靈 敏 度 、 安 全 性 、 直 觀 性 和 原 位 雜 交 的高 準(zhǔn) 確 性 結(jié) 合 起 來 。 原 位 檢 測 蛋 白 質(zhì) 及 其 它 分 子 常 用 熒 光 探 針 FITC,TRITC, Cy3， Cy5等 免 疫 熒 光 標(biāo) 記 ： 將 抗 體 標(biāo) 記 上 熒 光 素 ， 與 細(xì) 胞 或 組 織內(nèi) 相 應(yīng) 的 抗 原 結(jié) 合 后 ， 通 過 檢 測 特 征 性 的 熒 光 ， 定 位 ，定 性 、 定 量 檢 測 樣 品 中 的 抗 體 。 既 有 免 疫 反 應(yīng) 的 特 異性 ， 又 有 熒 光 檢 測 的 敏 感 性 。 熒 光 蛋 白 ： 跟 蹤 組 織 或 細(xì) 胞 內(nèi) 基 因 表 達(dá) 及 蛋白 定 位 的 標(biāo) 記 物 GFP， 綠 色 熒 光 蛋 白 ， 在 任 何 活 細(xì) 胞 中 都 表 達(dá) ， 可作 為 活 細(xì) 胞 的 分 子 探 針 ， GFP連 接 上 目 的 基 因 后 轉(zhuǎn)染 細(xì) 胞 ， 可 分 析 目 的 基 因 的 生 物 學(xué) 功 能 和 特 性 。 可 對(duì)活 細(xì) 胞 中 的 蛋 白 質(zhì) 進(jìn) 行 準(zhǔn) 確 定 位 及 動(dòng) 態(tài) 觀 察 ， 可 實(shí) 時(shí)原 位 跟 蹤 特 定 蛋 白 在 細(xì) 胞 生 長 、 分 裂 、 分 化 過 程 中 或外 界 刺 激 因 子 的 作 用 下 的 時(shí) 空 表 達(dá) ， 如 某 種 轉(zhuǎn) 錄 因 子的 核 轉(zhuǎn) 位 ， 蛋 白 激 酶 C的 膜 轉(zhuǎn) 位 ， 還 可 用 于 觀 察 分 子的 運(yùn) 動(dòng) ， 及 蛋 白 之 間 的 相 互 作 用 。 檢 測 細(xì) 胞 凋 亡 Annexin V/PI雙 染 ：Annexin V是 檢 測 凋 亡 早 期 細(xì)胞 膜 損 傷 的 方 法 ， 凋 亡 早 期 細(xì)胞 膜 膜 磷 脂 失 去 平 衡 ， 細(xì) 胞 膜上 的 磷 脂 酰 絲 氨 酸 （ PS） 會(huì)從 細(xì) 胞 內(nèi) 側(cè) 翻 轉(zhuǎn) 到 外 側(cè) ， 暴 露于 細(xì) 胞 外 環(huán) 境 中 ， Annexin V與 磷 脂 具 有 高 度 親 和 力 ， 可 與轉(zhuǎn) 移 到 膜 外 的 PS結(jié) 合 。 對(duì) 于凋 亡 晚 期 細(xì) 胞 和 死 細(xì) 胞 ， PI能透 膜 而 使 其 染 紅 。 兩 者 配 合 使用 可 以 初 步 確 定 細(xì) 胞 的 凋 亡 進(jìn)程 。 檢 測 細(xì) 胞 器 標(biāo) 記 線 粒 體 ： Rodamin 123， JC1, Mitotracker Green FM, Mito Tracker Red 標(biāo) 記 溶 酶 體 ： Lyso tracker green， Lyso tracker blue, Lyso tracker red 標(biāo) 記 內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng) ： DiOC6 標(biāo) 記 高 爾 基 體 ： NBD C6-ceramine 斑 馬 魚 腦 部 的血 管 與 神 經(jīng) 元綠 色 ： 神 經(jīng) 元紅 色 ： 血 管 藍(lán) 色 細(xì) 胞 核 ， 綠 色 微 管 LSCM在 生 物 醫(yī) 學(xué) 中 的 應(yīng) 用 活 體 細(xì) 胞 和 組 織 功 能 的 實(shí) 時(shí) 動(dòng) 態(tài) 監(jiān) 測 ： 利 用 相 應(yīng) 的 特 異性 熒 光 標(biāo) 記 所 要 觀 察 的 物 質(zhì) 后 ， 用 LSCM可 實(shí) 時(shí) 動(dòng) 態(tài) 監(jiān) 測 單 個(gè)細(xì) 胞 不 同 部 位 或 不 同 組 織 區(qū) 域 接 受 刺 激 后 的 整 個(gè) 變 化 過 程 。 如 ：實(shí) 時(shí) 定 量 測 定 細(xì) 胞 內(nèi) Ca離 子 的 變 化 ， 測 定 細(xì) 胞 內(nèi) PH變 化 、 檢測 膜 電 位 的 變 化 、 檢 測 細(xì) 胞 內(nèi) 活 性 氧 物 種 的 產(chǎn) 生 、 檢 測 藥 物 等跨 膜 進(jìn) 入 組 織 或 細(xì) 胞 過 程 及 其 定 位 、 檢 測 熒 光 共 振 能 量 轉(zhuǎn) 移(FRET)、 等 多 種 對(duì) 活 細(xì) 胞 的 實(shí) 時(shí) 動(dòng) 態(tài) 監(jiān) 測 。 游 離 鈣 離 子 變 化 熒 光 探 針 此 類 探 針 多 為 鈣 離 子 螯 合 劑 ， 可 用 常 用 的 探 針 Fluo-3， 其 乙 酰羥 甲 基 酯 (AM)形 式 為 不 帶 電 荷 的 親 脂 性 化 合 物 ， 易 于 滲 透 脂 膜進(jìn) 入 活 細(xì) 胞 內(nèi) ， 在 胞 內(nèi) 被 非 特 異 酯 酶 水 解 ， 釋 放 出 無 熒 光 的 游離 酸 形 式 的 熒 光 探 針 分 子 ， 探 針 分 子 一 旦 與 Ca離 子 結(jié) 合 便 形 成復(fù) 合 物 ， 并 產(chǎn) 生 較 強(qiáng) 的 熒 光 ， 從 而 發(fā) 揮 其 鈣 探 針 的 作 用 。 一 般來 說 ， 電 生 理 記 錄 裝 置 加 攝 像 技 術(shù) 檢 測 細(xì) 胞 內(nèi) 離 子 量 變 化 的 速度 相 對(duì) 較 快 ， 但 其 圖 像 本 身 的 價(jià) 值 較 低 ， 而 LSCM可 以 提 供 更好 的 亞 細(xì) 胞 結(jié) 構(gòu) 中 鈣 離 子 濃 度 動(dòng) 態(tài) 變 化 的 圖 像 。 常 用 探 針 Fluo-3-AM， Indo-1, Fura-2， Calcium Green-1， Calcium Green-2等 。 藥 物 進(jìn) 入 細(xì) 胞 的 動(dòng) 態(tài) 過 程 及 定 位 分 布 為 檢 測 藥 物 分 子 、 病 毒 、 細(xì) 菌 等 外 界 物 質(zhì) 能 否 跨 膜 進(jìn) 入 細(xì) 胞（ 或 組 織 ） ， 需 要 利 用 這 些 物 質(zhì) 特 異 性 的 自 發(fā) 熒 光 或 對(duì) 其 進(jìn) 行熒 光 標(biāo) 記 。 這 些 具 有 熒 光 的 物 質(zhì) 與 細(xì) 胞 （ 或 組 織 ） 充 分 作 用 后 ，如 果 與 細(xì) 胞 （ 或 組 織 ） 結(jié) 合 ， 則 細(xì) 胞 （ 或 組 織 ） 中 會(huì) 有 特 征 熒光 出 現(xiàn) ， 利 用 激 光 共 聚 集 顯 微 鏡 檢 測 細(xì) 胞 （ 或 組 織 ） 內(nèi) 該 熒 光出 現(xiàn) 的 位 置 和 含 量 ， 還 可 檢 測 該 物 質(zhì) 跨 膜 進(jìn) 入 細(xì) 胞 的 動(dòng) 態(tài) 過 程 。 熒 光 漂 白 技 術(shù) 原 理 ： 使 用 強(qiáng) 激 光 照 射 ， 將 細(xì) 胞 內(nèi) 的 一 個(gè) 區(qū) 域 的 熒 光 分 子 漂 白 ，然 后 觀 察 未 漂 白 的 熒 光 分 子 的 運(yùn) 動(dòng) 。 GFP較 適 合 用 于 光 漂 白 研究 的 熒 光 分 子 ： 它 比 較 亮 ， 穩(wěn) 定 ， 在 活 細(xì) 胞 內(nèi) 沒 有 毒 性 ， 在 使用 低 激 光 強(qiáng) 度 拍 攝 圖 像 時(shí) 漂 白 較 少 ， 其 次 ， 在 使 用 高 強(qiáng) 度 激 光照 射 時(shí) ， GFP的 光 漂 白 是 非 可 逆 的 ， 并 且 GFP的 光 漂 白 不 會(huì) 造成 細(xì) 胞 損 傷 ， 另 外 ， 分 子 融 合 技 術(shù) 將 GFP與 特 定 蛋 白 分 子 融 合 ，使 得 光 漂 白 技 術(shù) 可 用 于 研 究 蛋 白 分 子 在 細(xì) 胞 內(nèi) 的 運(yùn) 動(dòng) 。 兩 種 漂 白 實(shí) 驗(yàn) ： 一 是 熒 光 漂 白 丟 失 （ FLIP） ， 觀 察 漂 白 后 的 熒光 丟 失 現(xiàn) 象 ； 二 是 熒 光 漂 白 恢 復(fù) （ FRAP） ， 觀 察 的 熒 光 恢 復(fù)現(xiàn) 象 。 熒 光 漂 白 丟 失 FLIP 將 細(xì) 胞 內(nèi) 一 個(gè) 區(qū) 域 的 熒 光 分 子 反 復(fù) 漂 白 ， 然 后 觀 察 漂白 區(qū) 域 外 熒 光 丟 失 的 情 況 。 可 以 研 究 不 同 部 位 的 熒 光分 子 的 轉(zhuǎn) 運(yùn) 或 連 續(xù) 性 ， 如 GFP整 合 蛋 白 分 子 在 不 同細(xì) 胞 器 內(nèi) 的 分 布 等 。 熒 光 漂 白 恢 復(fù) （ FRAP） FRAP是 利 用 高 能 量 激 光 束 將 細(xì) 胞 內(nèi) 某 一 部 分 中 選 定 靶 區(qū) 域 的某 種 熒 光 淬 滅 ， 然 后 觀 察 鄰 近 相 同 的 非 淬 滅 熒 光 標(biāo) 記 物 重 新 擴(kuò)散 入 該 區(qū) 域 的 速 度 和 方 式 ， 從 而 分 析 細(xì) 胞 內(nèi) 蛋 白 質(zhì) 運(yùn) 輸 、 受 體在 細(xì) 胞 膜 上 的 流 動(dòng) 和 大 分 子 組 裝 等 細(xì) 胞 生 物 學(xué) 過 程 。 熒 光 共 振 能 量 轉(zhuǎn) 移 （ FRET) 用 于 研 究 細(xì) 胞 內(nèi) 蛋 白 質(zhì) 分 子 間 或 蛋 白 質(zhì) 分 子 內(nèi) 的 相 互 作 用 。 可以 獲 得 兩 個(gè) 蛋 白 分 子 之 間 相 互 作 用 的 空 間 信 息 。 關(guān) 于 蛋 白 分 子的 共 定 位 ， 蛋 白 分 子 聚 合 體 ， 轉(zhuǎn) 錄 機(jī) 制 ， 蛋 白 折 疊 等 問 題 可 通過 FRET來 解 決 。 LSCM在 生 物 醫(yī) 學(xué) 中 的 應(yīng) 用 長 時(shí) 程 觀 察 細(xì) 胞 遷 移 和 生 長 ： 目 前 的 LSCM的 軟 件 一 般均 可 自 動(dòng) 控 制 進(jìn) 行 定 時(shí) 和 定 方 式 的 激 光 掃 描 ， 新 一 代 的 LSCM探 測 效 率 提 高 ， 只 需 很 小 激 光 量 就 可 達(dá) 到 較 好 的 圖 像 質(zhì) 量 ， 從而 減 小 了 每 次 掃 描 時(shí) 激 光 束 對(duì) 細(xì) 胞 的 損 傷 ， 因 此 可 以 用 于 數(shù) 小時(shí) 的 長 時(shí) 間 的 定 時(shí) 掃 描 ， 記 錄 細(xì) 胞 遷 移 和 生 長 等 細(xì) 胞 生 物 學(xué) 現(xiàn)象 。 激 光 共 聚 焦 顯 微 鏡 在 各 研 究 領(lǐng) 域 中 應(yīng) 用 細(xì) 胞 生 物 學(xué) ： 細(xì) 胞 結(jié) 構(gòu) 、 細(xì) 胞 骨 架 、 細(xì) 胞 膜 結(jié) 構(gòu) 、 流 動(dòng) 性 、 受 體 、細(xì) 胞 器 結(jié) 構(gòu) 和 分 布 變 化 、 細(xì) 胞 凋 亡 等 ； 生 物 化 學(xué) ： 酶 、 核 酸 、 FISH 、 受 體 分 析 等 ； 藥 理 學(xué) ： 藥 物 對(duì) 細(xì) 胞 的 作 用 及 其 動(dòng) 力 學(xué) 等 ； 生 理 學(xué) ： 膜 受 體 、 離 子 通 道 、 離 子 含 量 、 分 布 、 動(dòng) 態(tài) 等 ； 遺 傳 學(xué) 和 組 胚 學(xué) ： 細(xì) 胞 生 長 、 分 化 、 成 熟 變 化 、 細(xì) 胞 的 三 維 結(jié) 構(gòu) 、染 色 體 分 析 、 基 因 表 達(dá) 、 基 因 診 斷 等 ； 神 經(jīng) 生 物 學(xué) ： 神 經(jīng) 細(xì) 胞 結(jié) 構(gòu) 、 神 經(jīng) 遞 質(zhì) 的 成 分 、 運(yùn) 輸 和 傳 遞 等 ； 微 生 物 學(xué) 和 寄 生 蟲 學(xué) ： 細(xì) 菌 、 寄 生 蟲 形 態(tài) 結(jié) 構(gòu) 等 ； 病 理 學(xué) 及 病 理 學(xué) 臨 床 應(yīng) 用 ： 活 檢 標(biāo) 本 的 快 速 診 斷 、 腫 瘤 診 斷 、 自 身免 疫 性 疾 病 的 診 斷 等 ； 生 物 學(xué) 、 免 疫 學(xué) 、 環(huán) 境 醫(yī) 學(xué) 和 營 養(yǎng) 學(xué) ： 免 疫 熒 光 標(biāo) 記 （ 單 標(biāo) 、 雙 標(biāo) ）的 定 位 ， 細(xì) 胞 膜 受 體 或 抗 原 的 分 布 ,微 絲 、 微 管 的 分 布 、 兩 種 或 三 種蛋 白 的 共 存 與 共 定 位 、 蛋 白 與 細(xì) 胞 器 的 共 定 位 等 。 復(fù) 習(xí) 題 LSCM成 像 原 理 簡 述 LSCM在 生 物 醫(yī) 學(xué) 中 的 應(yīng) 用 超 微 結(jié) 構(gòu) 復(fù) 習(xí) 題 簡 述 細(xì) 胞 核 ， 線 粒 體 ， 高 爾 基 體 ， 內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng) ， 細(xì) 胞 膜 ， 溶 酶 體 的基 本 結(jié) 構(gòu) 。 線 粒 體 嵴 的 類 型 、 結(jié) 構(gòu) 特 點(diǎn) 和 意 義 線 粒 體 腫 脹 和 積 水 變 ， 嵴 內(nèi) 腫 脹 ， 線 粒 體 肥 大 和 增 生 ， 巨 線 粒體 常 見 的 線 粒 體 、 內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng) 包 含 物 粗 面 內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng) 肥 大 和 增 生 的 形 態(tài) 特 征 粗 面 內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng) 脫 粒 和 多 聚 核 糖 體 解 聚 形 態(tài) 特 征 和 意 義 微 絨 毛 形 態(tài) 特 征 纖 毛 形 態(tài) 特 征 常 見 的 病 理 改 變 類 型 常 見 的 細(xì) 胞 連 接 類 型 ， 基 本 結(jié) 構(gòu) 核 體 次 級(jí) 溶 酶 體 的 分 類 共 聚 焦 實(shí) 驗(yàn) 分 組2012.10.30102760 宋 鵬112679 吳 士 超112680 母 亞 雯119526 劉 麗 娜122779 公 丕 海122790 徐 世 慧122826 何 丹122827 董 惠 霞122832 王 文 君122835 王 新 玲122836 梁 辰122837 趙 虎 子122839 劉 靜 122841 王 穎122842 楊 龑 曉 曉122844 王 靜122845 劉 平 2012.11.01122850 吳 娛122851 王 春 雷122854 黃 炎 青122855 孟 思 明122858 孫 宇 寧122864 陳 穎122867 江 靜122868 李 子 惠122870 張 玲 玲122873 陸 建122874 楊 亞 茹122875 王 琳122876 陳 敏122877 許 榮 睿122878 樊 菊 香122879 程 峰122887 劉 元 果 電 鏡 觀 察 分 組2012.11.068： 00-9： 30 102760 宋 鵬112679 吳 士 超112680 母 亞 雯119526 劉 麗 娜9： 30-11： 10 122779 公 丕 海122790 徐 世 慧122826 何 丹 201211.138： 00-9： 30 122827董 惠 霞122832王 文 君122835王 新 玲122836梁 辰9： 30-11： 10122837趙 虎 子122839劉 靜122841王 穎 2012.11.208： 00-9： 30 122842 楊 龑 曉 曉122844 王 靜122845 劉 平122850 吳 娛9： 30-11： 10 122851 王 春 雷122854 黃 炎 青122855 孟 思 明2012.11.278： 00-9： 30 122858 孫 宇 寧122864 陳 穎 122867 江 靜122868 李 子 惠9： 30-11： 10 122870 張 玲 玲122873 陸 建122874 楊 亞 茹 2012.12.048： 00-9： 30 122875 王 琳122876 陳 敏122877 許 榮 睿9： 30-11： 10 122878 樊 菊 香122879 程 峰122887 劉 元 果