熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)及熒光染色

熒 光 顯 微 術(shù) 1.了 解 熒 光 顯 微 鏡 的 基 本 構(gòu) 成 和 基 本 原 理 。2. 初 步 掌 握 熒 光 顯 微 鏡 的 調(diào) 節(jié) 步 驟 和 使 用 。實 驗 目 的 實 驗 用 品Olympus熒 光 顯 微 鏡 ， 載 玻 片 ， 蓋玻 片 ， 擦 鏡 紙 ， 吖 啶 橙 染 料 等 實 驗用 材 料 。 實 驗 內(nèi) 容一 、 熒 光 顯 微 鏡 的 成 像 原 理二 、 熒 光 顯 微 鏡 的 基 本 結(jié) 構(gòu)三 、 熒 光 顯 微 鏡 的 使 用 方 法四 、 觀 察 動 植 物 細(xì) 胞 的 自 發(fā) 熒 光和 繼 發(fā) 性 熒 光 一 、 顯 微 鏡 的 成 像 原 理 熒 光 顯 微 鏡 是 利 用 一 定 波 長 的 光 使 樣 品 受 到 激 發(fā) ， 產(chǎn)生 不 同 顏 色 的 熒 光 ， 以 用 來 觀 察 和 分 辨 樣 品 中 某 些 化 學(xué) 成分 和 細(xì) 胞 組 分 的 一 種 顯 微 鏡 。自 發(fā) 熒 光 : 組 織 、 細(xì) 胞 不 經(jīng) 熒 光 色 素 染 色 ， 在 紫 外 光 照 射下 ， 某 些 成 分 所 呈 現(xiàn) 的 熒 光 ， 稱 為 自 發(fā) 熒 光 。繼 發(fā) 性 熒 光 : 組 織 、 細(xì) 胞 經(jīng) 熒 光 色 素 染 色 ， 由 于 熒 光 色 素和 組 織 細(xì) 胞 內(nèi) 的 某 種 成 分 結(jié) 合 后 而 呈 現(xiàn) 的 熒 光 為 繼 發(fā) 性 熒光 。 二 、 熒 光 顯 微 鏡 的 基 本 結(jié) 構(gòu) 和 光 路圖1. 基 本 結(jié) 構(gòu) : 光 源 ： 超 高 壓 汞 燈 ,用 以 產(chǎn) 生 強 光 照 (含 大 量 紫 外 光 ,藍 紫光 ) 濾 片 系 統(tǒng) : 激 發(fā) 濾 色 鏡 ， 提 供 一 定 波 長 范 圍 的 激 發(fā) 光 . 阻 斷 濾 色 鏡 ,透 過 相 應(yīng) 波 長 范 圍 的 熒 光 ,阻 斷 或 吸 收剩 余 激 發(fā) 光 . 二 向 分 色 鏡 ， 透 射 長 波 光 線 和 反 射 短 波 光 線 的 功 能 . 熒 光 物 鏡普 通 顯 微 鏡 熒 光 顯 微 鏡 結(jié) 構(gòu) 圖 熒 光 顯 微 鏡 的 光 路 圖 三 熒 光 顯 微 鏡 的 使 用 方 法1.汞 燈 的 安 裝 : 切 斷 電 源 ,從 插 座 上 拔 下 電 源 線 . 開 啟 燈 室 ,將 汞 燈 安 裝 到 燈 架 上 . 嚴(yán) 防 手 指 觸 摸 燈 管 ,特 別 是 中 心 球 狀 部 分 ,以免 污 染 汞 燈 裝 入 燈 室 ,封 上 燈 室 蓋 后 ,方 可 按 通 電源 .（ 一 ） 熒 光 顯 微 鏡 的 調(diào) 整 方 法 2. 汞 燈 的 點 亮 : 確 信 各 連 接 部 分 皆 處 于 正 常 狀 態(tài) 接 通 啟 動 器 電 源 開 關(guān) ,按 下 起 動 鈕 ,汞 燈點 亮 ,經(jīng) 2-3min ,電 弧 趨 于 穩(wěn) 定 . 點 亮 后 15min內(nèi) ,勿 切 斷 電 源 ,一 旦 汞 燈熄 滅 ,在 5min或 稍 長 時 間 內(nèi) ,不 許 重 新 點 亮 ,待 汞 燈 冷 卻 后 ,始 能 再 次 點 亮 . 3. 汞 燈 的 調(diào) 中 : 開 啟 光 閥 . 開 放 孔 徑 光 闌 和 視 場 光 闌 至 最 大 開 度 ,即“ Min” - “Max” . 旋 轉(zhuǎn) 物 鏡 轉(zhuǎn) 換 器 ,無 物 鏡 的 空 洞 進 入 光 路 , 旋 下 防 塵 蓋 光 線 射 向 鏡 臺 . 載 物 臺 上 放 一 白 紙 ,讓 汞 燈 電 弧 像 投 在 其上 . 用 燈 室 外 的 聚 焦 桿 ,使 電 弧 像 在 白 紙 上 聚 焦 ，并 用 調(diào) 中 螺 釘 ,調(diào) 中 汞 燈 。 4.濾 色 鏡 系 統(tǒng) 的 配 合 使 用 : 該 熒 光 顯 微 鏡 具 激 發(fā) 濾 色 鏡 ,阻 斷 濾 色 鏡 和 二 向 色鏡 等 。 5. 樣 品 聚 焦 : 經(jīng) 熒 光 染 料 染 色 的 樣 品 放 在 載 物 臺 上 ,先 用 溴 鎢 燈 透射 照 明 ,用 低 倍 物 鏡 聚 焦 ,待 尋 找 到 最 佳 影 像 后 ,熄 滅 溴鎢 燈 改 用 汞 燈 . 點 亮 汞 燈 ,嵌 入 系 統(tǒng) 濾 色 鏡 使 用 UVFL 40X(Oil)和 UVFL 100X(Oil) 油 浸 物 鏡 ,應(yīng) 用 無 熒 光 浸 油 ,物 鏡 的 內(nèi) 裝 可 變 光 闌 應(yīng) 適 當(dāng) 縮 小 ,以 增大 影 像 反 差 和 清 晰 度 . 在 UVFL 40X(dry)物 鏡 內(nèi) 裝 有 校 正 環(huán) ,對 較 薄 或 較 厚 的蓋 片 進 行 球 面 校 正 . 6.縮 小 光 闌 開 度 視 場 光 闌 (F)和 孔 徑 光 闌 (A)的 開 度 ,在 觀 察 樣 品時 應(yīng) 朝 “ Min”向 轉(zhuǎn) 動 ,使 其 適 當(dāng) 縮 小 .7.光 閥 的 使 用 在 熒 光 觀 察 暫 短 中 止 時 ,可 用 光 閥 阻 斷 光 路 ,勿 熄 滅 汞 燈 ,以 免 減 短 其 使 用 壽 命 . （ 二 ） 熒 光 鏡 檢 樣 品 的 制 作1. 不 能 使 用 本 身 能 產(chǎn) 生 熒 光 的 藥 劑2. 切 片 標(biāo) 本 不 能 太 厚3. 因 石 蠟 可 產(chǎn) 生 青 色 熒 光 ， 采 用 石 蠟 制 片 時 ， 脫 蠟必 須 徹 底 。 切 片 進 入 水 后 ， 應(yīng) 充 分 水 洗 ， 再 經(jīng) 熒 光染 料 處 理 。4. 最 好 采 用 螢 石 玻 璃 制 成 的 載 玻 片 、 蓋 玻 片 。5. 封 片 時 可 采 用 甘 油 等 無 熒 光 的 封 固 劑 。 材 料 : 藻 類 , 鴨 趾 草 下 表 皮 , 動 物 結(jié) 締 組 織 , 血細(xì) 胞 , 花 粉 . 染 液 : 0.01%丫 啶 橙 染 液 .觀 察 藻 類 ， 鴨 趾 草 下 表 面 葉 綠 體 的 自 發(fā) 熒 光丫 啶 橙 染 花 粉 , 血 細(xì) 胞 , 疏 松 結(jié) 締 組 織 。四 、 觀 察 動 植 物 細(xì) 胞 的 自 發(fā) 熒 光 和繼 發(fā) 性 熒 光 1.影 響 熒 光 顯 微 鏡 成 像 質(zhì) 量 的 因 素2.激 發(fā) 濾 色 鏡 和 阻 斷 濾 色 鏡 的 功 能 及 區(qū) 別 ？ 兩 者 有何 關(guān) 系 ？ 怎 樣 選 用 ？思 考 題