共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理

共 聚 焦 激 光 掃 描 熒 光 顯 微 鏡 什 么 是 共 聚 焦 激 光 掃 描 熒 光 顯 微 鏡 ？ 共 聚 焦 激 光 掃 描 熒 光 顯 微 鏡（ LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM ） 以 激 光 作 為 光 源 ， 采 用 光 源 針 孔 與 檢 測 針 孔 共 軛 聚 焦 技術(shù) ， 對(duì) 樣 本 進(jìn) 行 斷 層 掃 描 ， 以 獲 得 高 分 辨 率 光 學(xué) 切 片 的 熒 光 顯微 鏡 系 統(tǒng)共 聚 焦 系 統(tǒng) 細(xì) 胞 CT 熒 光 和 熒 光 顯 微 鏡一 、 熒 光 的 基 礎(chǔ) 術(shù) 語熒光物質(zhì)： 某些物質(zhì)在特定波長范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)出波長比照射光長的光線 熒光。受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱熒光物質(zhì)或熒光素激發(fā)光(EXCITATION)： 能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內(nèi)的光線稱為該熒光素的激發(fā)光。激發(fā)/吸收光譜；吸收波峰(最大吸收波長) 488nm 520nm異硫氰酸熒光素(FITC)發(fā)射光(EMISSION): 發(fā)射光譜；發(fā)射波峰(最大發(fā)射波長)熒光探針： 能產(chǎn)生熒光的特異性生物染料（PI, Dapi)、標(biāo)有熒光素的特異性蛋白結(jié)合物（熒光抗體）自發(fā)熒光(AUTOFLUORESCENCE): 組織或細(xì)胞中的某些成份受激發(fā)時(shí)可發(fā)出熒光自發(fā)熒光。漂白(BLEACH)： 熒光物質(zhì)受激發(fā)時(shí)，其發(fā)射熒光的能力逐漸下降并最終喪失 漂白。 二 、 熒 光 顯 微 鏡 術(shù) 的 基 本 原 理熒 光 顯 微 鏡激 發(fā) 濾 鏡 ： 從 光 源 中 分 濾 出 一 定 波 長 范 圍 的 激 發(fā) 光 。 帶 通 濾 色 鏡 (BP)： 有 寬 、 窄 帶 之 分 。 如 ： BP450-490 長 、 短 通 濾 色 鏡 組 合 （ LP + KP） ： LP450 + KP490 雙 色 鏡 ： 雙 色 分 光 鏡 ； 反 射 短 波 長 ， 透 過 長 波 長 。阻 斷 濾 鏡 ： 多 為 長 通 濾 色 鏡 ； LP490紫外藍(lán)綠高壓汞燈被熒光探針染色的生物樣本激 發(fā)被標(biāo)記結(jié)構(gòu)的熒光光學(xué)圖像光 學(xué)成 像濾 鏡分 光 488nm 520nmFITC450nm 490nm 熒 光 顯 微 鏡 的 不 足 :1.無 法 實(shí) 現(xiàn) 對(duì) 熒 光 ,透 射 光 的 同 時(shí) 采 集 ,無 法 實(shí) 現(xiàn) 多重 熒 光 的 同 時(shí) 采 集 及 共 定 位 。2.熒 光 散 射 光 太 強(qiáng) ， 造 成 實(shí) 際 分 辨 率 的 大 大 下 降 。3.熒 光 漂 白 及 對(duì) 細(xì) 胞 組 織 的 照 射 損 傷 。4.無 法 對(duì) 樣 品 進(jìn) 行 斷 層 掃 描 ,完 成 3D的 工 作 。5.濾 鏡 對(duì) 熒 光 信 號(hào) 衰 減 大 ,靈 敏 度 熒 光 強(qiáng) 度 不 夠 。6.可 以 觀 查 活 細(xì) 胞 或 組 織 但 細(xì) 胞 或 組 織 內(nèi) 結(jié) 構(gòu) 高 度重 疊7.只 能 在 二 維 環(huán) 境 下 觀 察 。8.樣 品 不 能 太 厚 。9.熒 光 的 串 繞 無 法 回 避 。10.放 大 倍 率 小 。 共 聚 焦 激 光 掃 描 熒 光 顯 微 鏡 基 本 配 置Laserand electronic Control Unit激光光源及控制裝置Computer計(jì)算機(jī)Confocal scan and detector unit 共聚焦掃描及檢測裝置Microscope熒光顯微鏡Anti-vibration table防震臺(tái)Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System Nikon的 Eclipse C1 Plus 1 .性能卓越的平場復(fù)消色差TIRF物鏡（ 6 0 x ，1 0 0 x）， NA = 1 .4 9 .。這是當(dāng)前數(shù)值孔徑最高的油浸物鏡 2 .四孔位針孔轉(zhuǎn)盤：用電腦控制針孔的大小，可在分辨率和光切厚度之間取得最佳平衡。 3 .時(shí)間間隔可變的Time Lapse: 可以在拍攝過程中不同的時(shí)間段采用不同的時(shí)間間隔。 一、基本組成（一）激光器:多線氬離子(4 5 8 nm, 4 8 8 nm, 5 1 4 nm) 、氦氖綠(5 4 3 nm)、氦氖紅(6 3 3 nm)（二）掃描器(內(nèi)裝有針孔光欄、分光鏡、發(fā)射熒光單色器及檢測器)（三）光學(xué)裝置：根據(jù)樣品中熒光信號(hào)的強(qiáng)弱、大小及分布，調(diào)節(jié)激光能量、檢測孔光欄、光電倍增管（PMT）的檢測范圍、物鏡和電子放大倍數(shù)（zoom），以利于采集各種熒光信號(hào)。（四）計(jì)算機(jī)圖像存儲(chǔ)與處理及控制系統(tǒng)：實(shí)現(xiàn)了圖像的優(yōu)化、三維重建，實(shí)現(xiàn)了全自動(dòng)程序化控制采集（檢測）樣品熒光圖像的時(shí)間和空間，并和同時(shí)采集樣品中多重?zé)晒庑盘?hào)的分解及合成圖像，對(duì)其進(jìn)行定量測定。 一.分辨率（0 .1 8 m）二.可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)三.無損傷、連續(xù)光學(xué)切片四.光譜掃描（分辨由光源波長，物鏡參數(shù)和針孔直徑等決定，如6 0 X，NA1 .4的物鏡水平分辨率約為0 .2 m，垂直分辨率約為0 .5 m。）（細(xì)菌細(xì)胞1 -2 m，原核生物細(xì)胞1 -1 0 m） 利用照明針孔和探測針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和探測，并且被探測點(diǎn)位于焦平面。照明針孔與探測針孔對(duì)被照射點(diǎn)或被探測點(diǎn)來說是共軛的，因此被探測點(diǎn)即共焦點(diǎn)。 1 .點(diǎn)照明（為作圖方便已將光線發(fā)散角放大） 假設(shè)是場照明（非共聚焦），會(huì)導(dǎo)致： 一.發(fā)生衍射，使像模糊； 二.散射光干擾（即除了成像點(diǎn)外，其余 點(diǎn)處有散射光進(jìn)入探測針孔）； 而點(diǎn)照明則不會(huì)有這些問題。 消除衍射影響消除背景雜光 2 .焦平面點(diǎn)成像 焦平面上的像是最清晰的，從上面的圖可以看出，非焦平面點(diǎn)所成 的像的光像被探測針孔擋住，不會(huì)進(jìn)入光探頭，所以焦平面點(diǎn)成像使像更清晰。 所以共聚焦成像方式可以很大的提高分辨率和成像質(zhì)量。 一. XY軸掃描二. Z軸掃描 （1）單光束掃描模式其中最常見的掃描安排結(jié)合了兩個(gè)獨(dú)立的掃描鏡，具有中繼光學(xué)系統(tǒng)。移動(dòng)的垂直軸的反射鏡即在試樣上產(chǎn)生XY平面的掃描。但中間需要增加高級(jí)別的像差校正光學(xué)系統(tǒng)，導(dǎo)致發(fā)光效率降低。 （1）單光束掃描模式 （2）多光束掃描（尼普可夫圓盤掃描）多光束掃描技術(shù)提供了一個(gè)替代的單光束掃描配置照明效率低，而且掃描速度更快。其中旋轉(zhuǎn)盤掃描儀有數(shù)百個(gè)孔，其功能作為照明和探測的針孔。由于磁盤掃描顯微鏡形成的實(shí)像，可以直接位于CCD照相機(jī)的圖像平面中。盡管這方面的優(yōu)勢，它允許實(shí)時(shí)聚焦和成像的動(dòng)態(tài)過程，有幾個(gè)缺點(diǎn)限制了磁盤掃描共聚焦系統(tǒng)的實(shí)際效用。其中最嚴(yán)重的是典型的依賴于傳統(tǒng)的廣譜光源，和在磁盤發(fā)生極端的光損失。 （2）多光束掃描 奧林巴斯Fluo View3 0 0 激光共聚焦掃描系統(tǒng)光電倍增器雙色鏡 激發(fā)和發(fā)射濾波滑動(dòng)器強(qiáng)度調(diào)整密度塔激發(fā)發(fā)射和射柱準(zhǔn)直儀電源X-Y檢流計(jì)鏡掃描控制器出入口透鏡系統(tǒng) 同樣可以實(shí)現(xiàn)XZ軸，YZ軸掃描 通常的方法是通過計(jì)算機(jī)控制的馬達(dá)以預(yù)先設(shè)定的步距移動(dòng)顯微鏡的鏡臺(tái)然后采集圖像。（當(dāng)然也有通過改變焦平面位置的方法） 通 過 精 細(xì) 平 面 光 切 ， 形 成 生 物 樣 品 不 同 平面 的 精 細(xì) 圖 象 ， 將 一 個(gè) 連 續(xù) 的 光 切 圖 象 Z軸重 疊 就 可 形 成 一 個(gè) 完 整 的 三 維 圖 象 切片的厚度受物鏡的數(shù)值孔徑和針孔直徑影響，比如6 0 X，NA1 .4的鏡頭當(dāng)針孔設(shè)定為1 mm時(shí)，光學(xué)切片厚度為0 .4微米。 光電倍增管掃瞄裝置空氣冷卻氬激光器 激發(fā)光濾器共焦針孔屏障濾光片(檢流計(jì)物鏡 謝謝！