離子交換法-zuihou

1 第八章 離子交換法 (ion-exchange) 第一節(jié) 基本原理 離子交換法：利用溶液中 帶電粒子 與離子 交換劑之間 結(jié)合力 的差異進行物質(zhì)分離的 操作方法。 帶電粒子與離子交換劑間的作用力是 靜電 力 。 電荷密度、電荷種類 2 離子交換劑 離子交換劑： 由惰性的不溶性載體 、 功能基團和平 衡離子組成 。 陽離子交換劑：平衡離子帶正電荷 。 陰離子交換劑：平衡離子帶負電荷 。 R-X+ + Y+ R-Y+ + X+ R-表示陽離子交換劑的功能基團和載體； X+ 為平衡 離子； Y+為交換離子。 3 吸附 選擇性吸附 ： 調(diào)節(jié)溶液的 pH值， 使目的物帶 有相當數(shù)量的靜電荷，而主要雜質(zhì)離子帶相 反電荷或較弱的電荷。 選擇合適的樹脂（如陽離子交換樹脂），使 目的物被離子交換樹脂吸附，而雜質(zhì)較少被 吸附。 4 洗脫 （ 1） 調(diào)節(jié)洗脫液的 pH值 。 （ 2） 用高濃度的同性離子將目的物離子取 代下來 。 對陽離子交換樹脂而言，目的物的 pI值愈大 （愈堿），將其洗脫下來所需溶液的 pH值也 愈高。 5 離子交換樹脂吸附和洗脫過程 （ 1） X+為平衡離子， YH+及 Z+為待分離離子； （ 2） YH+和 Z+取代 X+而被吸附； （ 3）加堿后 YH+失去正電荷，被洗脫； （ 4）提高 X+的濃度取代出 Z+ 動畫 6 樹脂的選擇 pH大于等電點時 ， 物質(zhì)帶負電荷 ， 與陰離子交換劑進行交換； pH小于等電點時 ， 物質(zhì)帶正電荷 ， 可以與陽離子交換劑進行交換 。 7 蛋白質(zhì)等電點與所用交換劑 8 離子交換技術(shù)的應(yīng)用 9 第二節(jié) 離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)和種類 離子交換樹脂構(gòu)成： （ 1）惰性的不溶性高分子固定骨架，稱 載體 。 （ 2）與載體 共價鍵 連接的不能移動的活性基團， 又稱 功能基團 。 （ 3）與功能基團以 離子鍵 連接的可移動的活性離 子，亦稱 平衡離子 。 如聚苯乙烯磺酸型鈉樹脂 。 10 一、樹脂分類 陽離子交換樹脂 強酸型樹脂：磺酸型樹脂，功 能基團為磺酸根 ( SO3H)及甲 基磺酸根 ( CH2SO3H)， 有好 的解離能力 。 中酸性樹脂：磷酸型樹脂（ PO3H2 ） 弱酸性樹脂：羧酸型樹脂和酚 型樹脂 （ COOH , ） ， 在 酸性環(huán)境中解離度受到抑制 。 11 陰離子交換樹脂 強堿型陰離子交換樹脂： 弱堿型陰離子交換樹脂：活性基團為伯 、 仲 、 叔胺 基 。 在堿性環(huán)境中解離度受到抑制 。 中強堿性陰離子交換樹脂：兼有以上兩類活性基團。 12 離子交換樹脂功能基團的電離常數(shù) 13 離子交換樹脂的性能 14 兩性樹脂： 蛇籠樹脂 (snake-cage resins) Na+CI- 15 二、離子交換樹脂的命名： 強酸類 1 100號； 弱酸類 101 200； 強堿類 201 300； 弱堿類 301400； 中強酸類 401 500 交聯(lián)度 ：是合成載體骨架時交聯(lián)劑重量的百分數(shù) ， 用 “ ”將樹脂編號與交聯(lián)度分開 。 弱酸 101 4其交聯(lián)度為 4 。 國內(nèi)常用樹脂命名： 724； 732； 717 16 常用樹脂 724；弱酸陽離子交換樹脂 732；強酸陽離子交換樹脂 717；強堿陰離子交換樹脂 17 三、離子交換樹脂的骨架 （一）苯乙烯型離子交換樹脂 由 苯乙烯 與 二 乙烯苯 經(jīng)過氧 苯甲酰催化聚 合而成 。 交聯(lián)度 18 19 （二） 丙烯酸型離子交換樹脂 丙烯酸型陽離子交換樹脂：是由 丙烯酸甲酯 與 二乙烯苯 經(jīng)過氧苯甲酰催化聚合而成。 20 丙烯酸型陽離子交換樹脂 110樹脂： 丙烯酸甲酯與二乙烯苯聚合而成。 724樹脂： 它是由甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲 酯和二乙烯苯三元共聚而得 。 21 （三）其它離子交換樹脂 蛇籠樹脂 ： 脫鹽 螯形樹脂 ：金屬離子 吸附樹脂 ：“ 脫色樹脂 ” 熱再生離子交換樹脂： 22 第三節(jié) 離子交換動力學 一 、 離子交換平衡 R代表離子交換樹脂 ， Z1及 Z2分別為交換離子 A1和 平衡離子 A2的價電數(shù) 。 23 尼科爾斯基方程式 用 m1、 m2及 C1、 C2分別代表樹脂上和溶液中 的兩種離子的濃度 。 數(shù)量關(guān)系可表示 : 尼科爾斯基方程式 K 1時 交換離子 A1比平衡離子 A2對樹脂有較大 的吸引力 24 二、離子交換速度 R B+ + A+ R A+ + B+ 離子交換過程 ： 1、 A+從溶液擴散到樹脂表面 。 2、 A+從樹脂顆粒表面擴散到顆粒中 心 。 3、 交換離子 A+ 與平衡離子 B+交換 。 4、 B+從交換中心擴散到顆粒表面 。 5、 B+ 再擴散到溶液中 。 25 粒子擴散 速度： 顆?？讖?、 顆粒半徑 、 樹脂交換容量 、 交換離子 A+的半徑與電荷 、 平衡離子的性質(zhì) （ 電荷 、 半徑 ） 。 26 離子交換速度的影響因素： 1、 樹脂粒度 ：樹脂粒度大 ， 交換速度慢 。 2、 攪拌速度 3、 樹脂交聯(lián)度 ：交聯(lián)度大 ， 交換速度低 。 4、 離子半徑和離子價 ：離子每增加一個電荷 ， 交換速度下降一個數(shù)量級 。 5、 溫度 。 6、 離子濃度 ：交換速度隨離子濃度的上升而加 快 。 27 三、離子交換動力學 交換離子被吸附，平衡離子被釋放。 交換帶 ： 交換離子 A1由于被樹脂吸附，其 濃度從起始濃度 Co逐漸下降到 0的樹脂層。 交換帶窄： K 1 ； A1濃度??；流速慢 。 28 第四節(jié) 離子交換樹脂的性能 一 、 離子交換對樹脂的基本要求 二 、 影響樹脂性能的幾個因素 三 、 主要理化常數(shù)的測定 29 一、離子交換對樹脂的基本要求： 1、 有盡可能大的 交換容量 。 2、 有良好的 交換選擇性 。 3、 化學性質(zhì)穩(wěn)定 。 4、 化學動力學性能好 。 5、 物理性能好 。 30 二、影響樹脂性能的幾個因素 1、 離子交換樹脂具有的 功能基團性質(zhì) 和 數(shù) 目 ， 數(shù)目 是其交換容量的基礎(chǔ) 。 （ pH） 2、 樹脂的 交聯(lián)度 樹脂強度 、 交換選擇 性 、 動力學性質(zhì) 。 3、 樹脂骨架 和 平衡離子 。 31 pH對交換容量的影響 32 鈉型樹脂與氫型樹脂 偶極離子 RSO3-Na+ + H3+NRCOO - RSO3- H3+ NRCOO - +Na+ RSO3- H + + H3+NRCOO - RSO3- H3+ NRCOO H 鈉鹽樹脂 氫型樹脂 ，被取代的氫離子為羧基所固定，使被吸附 的氨基酸不能形成偶極，與樹脂之磺酸基沒有排斥力。 與鈉型樹脂相比， 氫型樹脂 有較 大 的有效 交換容量 。 33 三、主要理化常數(shù)的測定 1、 含水量 ：常用 干燥法和離 心法 測得 。 2、 膨脹度 ：膨脹系數(shù) K膨脹 。 3 濕真密度樹脂充滿水時 的密度 。 4.交換容量 :meq/g 樹脂。 34 交換容量測定方法 陽離子交換樹脂 （ 氫型 ） 的測定方法：一定量 樹脂中加入 NaOH溶液 ， 一天或數(shù)天后測定 NaOH剩余量 ， 從 消耗的堿量 求交換容量 。 陰離子交換樹脂 （ 氯型 ） 的測定方法：一定量 樹脂裝柱 ， 用過量 Na2SO4溶液進行離子交換 ， 測定 流出液中氯離子總量 ， 求交換容量 。 35 滴定曲線： 36 滴定曲線 1 強酸樹脂 Amberlite IR-120； 2 弱酸樹脂 Amberlite IRC-84； 3 強堿樹脂 Amberlite IRA-400； 4 弱堿樹脂 Amberlite IR-45 強酸強堿樹脂有水平段 轉(zhuǎn)折點位置 功能團種類 交換容量隨 pH值變化 37 第五節(jié) 離子交換的選擇性 影響離子交換選擇性的因素： 離子價與離子水合半徑 離子價與離子濃度 交換環(huán)境 樹脂結(jié)構(gòu) 偶極離子排斥 38 一、離子的化合價與水合半徑的影響： 相對親和力 和相對濃度。 電荷效應(yīng)越強的離子與樹脂的親和力越 大，而決定電荷效應(yīng)的主要因素是 價電 數(shù)和離子半徑 。 39 一價陽離子親和力的次序是： H+Li+ Na+ K+ NH4+ Ag+ 對 強堿性 樹脂陰離子親和力次序： F OH HCOO Cl Br I SO4 2- 對 弱堿性 樹脂陰離子親和力次序： F Cl Br =I =Ac SO4 2- OH 。 40 離子交換樹脂的性能 41 強酸強堿樹脂對各種離子的選擇系數(shù) H+Li+ Na+ K+ NH4+ Pb+ Cs+ Ag+ Ti+ 。 42 二、 離子化合價與離子濃度的影響： 設(shè)離子平衡后溶液中兩種離子的濃度比是定 值 P. C1/C2=P 在稀溶液 (C2較小 )中 ， 樹脂吸附高價離子的 傾向很大 。 43 舉例 例如： 當 k=2 P=1 m1+m2=1 C2=0.1mol/L Z2=1時 若 Z1=2 則 m1 0.9， m2 0.1 若 Z1=3 則 m1 0.97， m2 0.03 在較稀的溶液中，樹脂幾乎僅吸附高價離子。 44 三、交換環(huán)境的影響 1、 溶液的 pH： 解離度 、 交換容量 、 選擇性 。 2、 離子強度 ： 交換容量 、 選擇性 、 交換速度 3、 有機溶劑 ：能降低有機離子的解 離程度 。 45 四、樹脂結(jié)構(gòu)的影響 （ 一 ） 樹脂載體的交聯(lián)度 ： 交聯(lián)度上升 ， 膨脹度下降 ， K值增大 ， 樹 脂潛在的選擇能力提高 。 選擇性 的影響 ， 膨脹度增大時 ， K值減小 ， 促使樹脂吸附量降低； 空隙大小 的影響 ， 即膨脹度增大 ， 促使樹 脂吸附量增加 。 膨脹系數(shù)值很小時 ， 空間效應(yīng)占主要地位 。 膨脹系數(shù)增大到一定值時，選擇性占主要 地位。 圖 8.14 磺酸基樹脂 吸附土霉素的量與樹 脂膨脹度之間的關(guān)系 46 膨脹度與選擇性的關(guān)系 甲基丙烯酸 丙烯酰胺樹脂 ， 鏈霉素與鈉離子交換等溫線與樹脂膨脹度 的關(guān)系 1 膨脹系數(shù) 1.9； 2 膨脹系數(shù) 3； 3 膨脹系數(shù) 4.5； 4 膨脹系數(shù) 5.2； m1 樹脂對鏈霉素吸附量； C1， C2 溶液中鏈霉素和鈉離子濃度 47 （ 二 ） 輔助力 ：離子交換樹脂與被吸附離子間的 作用力除靜電力外 ， 還存在一種輔助力 。 無機離子交換常數(shù) K值多在 110之間 。 有機離子交換時 ， K值可高達 102103。 （三） 其它結(jié)合力：某些樹脂對金屬離子有特殊 的親和力。 羧酸型樹脂 48 五、偶極離子排斥作用： 偶極離子 RSO3-Na+ + H3+NRCOO - RSO3- H3+ NRCOO - +Na+ RSO3- H + + H3+NRCOO - RSO3- H3+ NRCOO H 鈉鹽樹脂 氫型樹脂 與鈉型樹脂相比， 氫型樹脂 有較 大 的有效 交換容量 。 49 氫型與鈉型磺酸基樹脂吸附氨基酸比較 50 第六節(jié) 離子交換操作方法 一 、 樹脂的選擇 目的物是弱酸性或弱堿性的 小分子 物質(zhì)時 ， 宜選用強酸強堿樹脂 （ 氨 基酸的分離 ） 。 蛋白質(zhì)、酶 和 其它生物大分子 的分 離多采用 弱堿或弱酸性樹脂 ，減少 生物大分子的變性，利于洗脫，提 高選擇性。 51 二、樹脂的處理和再生 1、 外觀特征 透明或半透明；顆粒圓整 ， 粒度 均勻 ， 強度 。 2、 樹脂的預(yù)處理 （ 1） 物理處理：去雜 ， 過篩 。 （ 2） 化學處理 ：用 8 10倍 的 1mol/L 鹽酸或氫氧化鈉溶液 交替浸泡 。 52 氨基酸分離前樹脂的處理 53 不同類型樹脂的處理 54 樹脂的再生 樹脂再生： 使用過的樹脂重新獲得使用性能的處理 過程 。 再生過程： （ 1） 去雜 ， 大量水沖洗 ， 除去物理吸附的雜質(zhì) 。 （ 2） 用酸 、 堿處理除去與功能基團結(jié)合的雜質(zhì) 。 (3) 轉(zhuǎn)型： 55 三、基本操作方法 交換： 靜態(tài)交換 動態(tài)交換 洗脫方式：分靜態(tài)洗脫及動態(tài)洗脫兩種 ， pH及離子強度改變 。 洗脫液： 酸、堿、鹽 。 56 酸、堿洗脫液 目的是改變 吸附物的電荷 或 改 變樹脂活性基團 的解離狀態(tài)，以消除靜電結(jié) 合力，迫使目的物被釋放出來； 鹽類洗脫液 是通過高濃度的同種電荷的離子 與目的物 競爭 樹脂上的活性基團，使吸附物 游離。 57 洗脫方式 動態(tài)洗脫： 1、 溶液 pH及離子強度不變 。 2、 分階段改變?nèi)芤?pH及離子強度 。 3、 連續(xù)改變?nèi)芤?pH及離子強度 。 梯度洗脫 ： 自動化的梯度儀 58 梯度洗脫 梯度混合器 : A瓶為低濃度鹽溶液 B瓶為高濃度鹽溶液 C=CA （ CA CB） VAA/AB 濃度梯度曲線 59 第七節(jié) 應(yīng)用實例 分離純化 氨基酸制備 無鹽水制備 60 氨基酸制備、分離 豬血粉水解制備 6種氨基酸 : 61 無鹽水制備 無鹽水制備是利用 氫型 陽離子交換樹脂和 羥 型 陰離子交換樹脂的組合以 除去水中所有的 離子 ， 其反應(yīng)式如下： 62 無鹽水制備 陽離子交換樹脂用 強酸性 樹脂 ， 陰離子交換樹脂可以用 強堿或 弱堿 樹脂 。 強酸 弱堿 或 強酸 強堿； 強酸 弱堿 強酸 強堿 ； 強酸 強堿 混合床 。 63 混合床 混合床系將陽 、 陰兩種樹脂混合而成 ， 脫鹽效果好 。 混合床中所發(fā)生的反應(yīng) : 64 混合床無鹽水 圖 8.20 混合床的操作 (a)為水制備時的情形； (b)為制備結(jié)束，用水逆流沖洗。 陽、陰樹脂根據(jù)比重不同分層，陽樹脂較重在 下面，陰樹脂在上面； (c)為上部、下部同時通入堿、酸再生，廢液自中間排出； (d)為再生結(jié)束，通入空氣，將陽、陰樹脂混合、準備制水 65 混合床抗生素脫鹽 經(jīng)過第一柱 （ 陽樹脂 ） 時 ， 溶液變酸 ， 而經(jīng)過第二柱 （ 陰樹脂 ） 時 ， 溶液又變 堿 。 鏈霉素脫鹽： 強酸 1 25和弱堿 311 4 樹脂組成混合床 ， 脫鹽效果較好 。 66 第八節(jié) 新型離子交換劑 一 、 大孔 、 均孔樹脂 （ 一 ） 大孔型離子交換樹脂 （ macro porous ,MP） （ 二 ） 均孔型離子交換樹脂 ( IR ) 二 、 多糖基離子交換劑 （ 一 ） 離子交換纖維素 （二） 葡聚糖凝膠離子交換劑 67 大孔型與凝膠型離子交換樹脂物理性質(zhì) 68 （一）大孔型離子交換樹脂的特征 （ 1） 載體骨架交聯(lián)度高 。 （ 2） 孔徑大 。 （ 3） 表面積大 ， 表面吸附強 ， 對大分 子物質(zhì)的交換容量大 。 （ 4） 孔隙率大 。 69 大孔型離子交換樹脂主要特性 70 國產(chǎn)大孔離子交換樹脂的命名 D113是大孔弱酸性丙烯酸系樹脂 D代表大孔型樹脂 第一位數(shù)字代表產(chǎn)品的分類 ： 0 代表強酸性， 1代表 弱酸性， 2代表強堿性， 3代表弱堿性 第二位數(shù)字代表不同的骨架結(jié)構(gòu) ： 0代表苯乙烯系， 1代表丙烯酸系， 2代表酚醛系， 3代表環(huán)氧系等。 第三位數(shù)字為順序號，用以區(qū)別交聯(lián)劑等的差異。 71 國產(chǎn)大孔離子交換樹脂品種 72 （二） 均孔型離子交換樹脂 主要是 陰離子交換樹脂 。 骨架的交聯(lián)度比較均勻 。 代號為 IP或 IR。 交聯(lián)度均勻 ， 孔徑大小一致 ， 交換容 量都較高 ， 膨脹度 、 機械強度好 。 73 二、多糖基離子交換劑 生物大分子對離子交換的要求 : 固相載體具有 親水性 和較大的 交換空間 ; 對其生物活性有穩(wěn)定作用，并便于洗脫。 生物來源穩(wěn)定的高聚物 多糖作載體。 多糖基離子交換劑可以分為： 離子交換纖維素 葡聚糖離子交換劑 74 （一）離子交換纖維素 特點： (1)開放的長鏈骨架， 親水性強 ，表面積大，易 吸附大分子 。 (2)交換 基團稀疏 ，對大分子的實際交換容量大。 (3)吸附力弱， 交換和洗脫條件緩和 ，不宜變性。 (4)分辨率高。 75 常用的離子交換纖維素 羧甲基纖維素（ CM-C）： 弱酸性陽離子交換纖維素， pK=3.6 。 二乙基氨基乙基纖維素 （ DEAE-C）：強堿型陰離 子交換纖維素， pK=9.1。 76 77 離子交換纖維素的制備 78 操作注意點 可靜態(tài)交換，也可動態(tài)交換。 交換基團密度低、吸附力弱。 鹽濃度不宜高 （控制在 0.0010.02 mol/L） 。 79 離子交換纖維素的選擇 解離曲線 80 離子交換纖維素的解吸 洗脫緩和 。 升高環(huán)境的 pH、降低 pH或是增加離子強度都能將 被吸附物質(zhì)洗脫下來。 81 思考題 請以 DEAE-C為例說明離子交換纖維素分離 純化蛋白質(zhì)時的洗脫方法有哪些？并說出各 種方法的洗脫原理。 82 思考題 83 離子交換纖維素的處理和再生 酸堿濃度要適當降低 ， 處理時間也從 4h縮短 為 0.31h。 以交換緩沖液平衡 。 注意： 不耐酸，用酸處理的濃度和時間須小心控制。 84 （二） 葡聚糖凝膠離子交換劑 是將 活性交換基團 連接于 葡聚糖凝膠 上制成的各種 交換劑 。 命名 : 交換活性基團 -Sephadex C (A)-編號。 具有 離子交換和分子篩 的雙重作用，對生物分子有 很高的分辨率。 85 常用離子交換葡聚糖 86 瓊脂糖凝膠離子交換劑 瓊脂糖凝膠上引入功能基 DEAE sepharose CL-6B CM sepharose CL-6B DEAE Toyopearl CM Toyopearl 87 多糖基離子交換劑應(yīng)用 尿激酶分離純化 88 L-門冬酰胺酶 (L-asparaginase) 能專一地水解 L-門冬酰胺生成 L-門冬氨酸和氨。 外源門冬酰胺被降解，蛋白質(zhì)合成過程中氨基酸的 缺乏，導致腫瘤細胞的死亡。 L-門冬酰胺酶是一種重要的抗腫瘤藥物。 大腸桿菌能產(chǎn)生 2種天冬酰胺酶，即 L-門冬酰胺酶 和 L-門冬酰胺酶 。 重組 L-門冬酰胺酶 pI為 4.85。 89 重組門冬酰胺酶 的純化 90 離子交換劑 弱酸 陽離子交換 樹脂 724 強酸 陽離子交換 樹脂 732 強堿 陰離子交換 樹脂 717 D113 大孔弱酸性丙烯酸系樹脂 CM-C DEAE-C CM-Sephadex C DEAE-Sephadex A 91 第九節(jié) 離子交換聚焦色譜 色譜聚焦 （ chromatofocusing） : 是一種高 分辨的新型的蛋白質(zhì)純化技術(shù) 。 是根據(jù)蛋白 質(zhì)的等電點 ， 結(jié)合離子交換技術(shù)的大容量色 譜 ， 能分離幾百毫克蛋白質(zhì)樣品 ， 洗脫峰被 聚焦效應(yīng)濃縮 ， 分辨率高 。 適用 水溶性的兩性分子 ，如蛋白質(zhì)、酶、多 肽、核酸等。 92 一、色譜聚焦的原理 （ 一 ） 自動形成 pH梯度 。 （ 二 ） 蛋白質(zhì)的色譜行為 （三） 聚焦效應(yīng) 93 PH梯度溶液的形成 在 聚焦層析 中，當 洗脫液流進 多緩沖 交換劑 時，由于交 換劑帶有緩沖能力 的電荷基團，故 PH梯度溶液可以 自動形成 。 94 PBE94柱聚焦色譜的 pH梯度 （ 1） 柱內(nèi)每點的 PH 值從高到低逐漸下降 。 （ 2）從層析柱頂部到 底部就形成了 PH6 9 的梯度。 （ 3） PH梯度會逐漸 向下遷移。 （ 4） 底部流出液的 PH由 9逐漸降至 6。 95 蛋白質(zhì)的色譜行為 當柱中 PH低于蛋白質(zhì)的 PI時 ， 蛋白質(zhì)帶 正電荷 ， 不與陰離 于交換劑結(jié)合 ,隨洗脫液向下移動 。 當?shù)鞍踪|(zhì)移動至環(huán)境 PH高于其 PI時 ， 蛋白質(zhì) 由帶正電荷變 為帶負電荷 ， 并與 陰離子交換劑結(jié)合 。 由于洗脫劑的通過 ， 蛋白質(zhì)周圍的環(huán)境 PH 再次低于 PI時 ， 它又帶 正電荷 ， 并 從交換劑解吸下來 而下降 。 移至 pH大于 PI時又重新結(jié)合 ， 直至蛋白質(zhì)從柱下流出 。 不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點 ， 在被離子交換劑結(jié)合以前 ， 移動距離 是不同的 ， 洗脫出來的先后次序是按等電點排列的 。 96 聚焦效應(yīng) 當一種蛋白質(zhì)在柱上隨洗脫液下移 至等電點處時，移動速度明顯減慢。 此時加上 相同 的 第二個樣品 ，它將 以洗脫液移動的速度下降，直至追 到正在慢移的第一個樣品（ 聚焦 ）。 如果加入的第二個樣品的等電點比 第一個樣品高，它可以越過第一個 樣品區(qū)先被洗脫出來。 97 二、多緩沖劑 多緩沖劑是一種兩性電解質(zhì)緩沖劑，是 分子 量大小不同的多種組分的多羧基多氨基化合 物 。 Polybuffer96 PBE94 Polybuffer74 PBE94 98 三、多緩沖交換劑 PBE94是以 交聯(lián)瓊脂糖 6B（ Sepharose 6B） 為載體 ， 并在糖基上通過醚鍵偶合上配基制成的 多緩沖交換劑 ， 是 陰離子交換劑 。 當 Polybuffer96流進多緩沖交換劑時 ， PH梯度 溶液可以自動形成 （ 9 6） 。 99 四、操作步驟 （一）凝膠和緩沖劑的選擇 PBE94 Polybuffer96 PBE94 Polybuffer74 pH間隔為 3個單位。 pH范圍應(yīng)包含要分離樣品各組分等電點 ， 并使其有 2/31/2柱長的吸附解吸時間。 100 （二）凝膠柱的準備 （ 1） 凝膠按 1 1懸浮于 起始緩沖液 中 ， 除氣泡 。 （ 2） 在柱中放 23ml起始緩沖液 ， 攪拌下緩緩倒 入 。 （ 3） 打開柱底部開關(guān) ， 待凝膠沉降后將柱頂部接 頭裝好 。 （ 4） 用 1015個柱床體積 起始緩沖液平衡 。 101 （三）、樣品的準備 100mg蛋白質(zhì) /10ml床體積。 樣品體積不超過 0.5個床體積 。 102 （四）、上樣和洗脫 樣品均勻平整地加到床面上； 上樣前應(yīng)先加 5ml洗脫液 。 用洗脫緩沖液淋洗 ， pH梯度自動形成 。 梯度的 pH上限由起始緩沖液確定 ， 其 下限由淋洗緩沖液的 pH決定 。 103 去除多緩沖劑的方法 （ 1） 沉淀法 （ 2） 凝膠過濾 （ 3） 親和色譜法 （ 4） 疏水色譜法 104 多緩沖離子交換劑的再生 多緩沖交換劑的再生可以在柱上進行。 用 23個床體積的 1mol/L NaCl淋洗。 用 0.1mol/L HCl洗滌。 105 106 五、應(yīng)用實例 -蛋白質(zhì)模擬混合物分離 PBE94柱 ，床高 15cm。 樣品 :4ml洗脫緩沖液含有馬肌 紅蛋白 ， 碳酸酐酶和白蛋白 . 起始緩沖液 :0.025mol/L咪唑 HCl， pH7， 洗脫緩沖液 ：多緩沖劑 74， pH4。 107 離子交換劑 弱酸 陽離子交換 樹脂 724 強酸 陽離子交換 樹脂 732 強堿 陰離子交換 樹脂 717 D113 CM-C DEAE-C CM-Sephadex C DEAE-Sephadex A ？ -Sepharose A （ 聚焦色譜 PBE94 ） 108 思考題 1、 影響樹脂性能的因素有離子交換樹脂具有的 、 和 。 2、 寫出下列離子交換劑類型： 732 ， 724 ， 717 ， D113 ,CM-C ,DEAE-C ， PBE94 。 3、 在采用多緩沖陰離子交換劑作固定相的離子交換聚焦色譜過程中 ， 當 柱中某位點之 pH值下降到蛋白質(zhì)組分 值以下時 ， 它因帶 正電荷而 ， 如果柱中有兩種蛋白組分 ， pI值較 者會 超過另一組分 ， 移動至柱下部 pH較 的位點進行 。 4、 影響離子交換選擇性的因素主要有 、 、 、 、 等 。 5、 用鈉型陽離子交換樹脂處理氨基酸時 ， 吸附量很低 ， 這是因為 （ ） A. 偶極排斥 B.離子競爭 C. 解離低 D. 其它 6、 在尼柯爾斯基方程式中 ， K值為離子交換常數(shù) ， K 1說明樹脂對交 換離子吸引力 （ ） 。 A. 小于平衡離子 B.大于平衡離子 C. 等于平衡離子 D. 其它