轉(zhuǎn)基因動物與動物生物反應(yīng)器

第 9章 轉(zhuǎn)基因動物 與動物生物反應(yīng)器 一 轉(zhuǎn)基因動物的制備方法 二 轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用 三 乳腺生物反應(yīng)器 四 基因打靶 轉(zhuǎn)基因動物 基因工程技術(shù) 胚胎工程技術(shù) 轉(zhuǎn)基因動物（ transgenic animal） 是指借助 基因工程技術(shù)將外源基因?qū)胧荏w動物染色 體內(nèi)，外源基因與動物基因整合后隨細(xì)胞的 分裂而擴(kuò)增，在體內(nèi)表達(dá)并能穩(wěn)定地遺傳給 后代的動物。 轉(zhuǎn)基因動物 轉(zhuǎn)基因動物的命名 原代轉(zhuǎn)基因動物 :founder G0 G1 G2 擬人化命名 倫理問題 人類在認(rèn)識自然改造自然上的巨大進(jìn)步 潛在的危害 1982年 ,Palmiter生產(chǎn)超級小鼠 世界上第一只轉(zhuǎn)基因動物 :轉(zhuǎn)入了生長激 素基因的巨鼠（ supermouse） 哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要環(huán)節(jié) 1 目標(biāo)基因克隆和體外重組 2 外源基因的導(dǎo)入 3 外源 DNA整合、轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的分子檢測 4 轉(zhuǎn)基因動物品系或品種的建立 哺乳動物生殖生理 哺乳動物受精和妊娠，整 個(gè)過程都在母畜體內(nèi)進(jìn)。 一 轉(zhuǎn)基因哺乳動物的制備方法 顯微注射法 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染 精子載體介導(dǎo)法 胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法 體細(xì)胞克隆技術(shù) 精原干細(xì)胞介導(dǎo)法 YAC介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 ? 1 顯微注射法 Microinjection into the Pronucleus of a Bovine Zygote 受精卵 顯微注射 胚胎移植 后定檢測 顯 微 注 射 法 操 作 流 程 視 頻 a、 轉(zhuǎn)移率較高 、 整合效率達(dá) 20%； b、 外源基因長度可達(dá)數(shù)百 Kb； c、 可得純系動物； d、 周期相對較短 。 顯微注射法的優(yōu)點(diǎn) a、 設(shè)備昂貴 、 操作復(fù)雜； b、 隨機(jī)整合 、 首尾相連的多拷貝； c、 轉(zhuǎn)基因效率較低 ， 約 0.5%-3%; d、 常造成插入位點(diǎn)附近宿主 DNA大片 段缺失 、 重組等突變 ， 出現(xiàn)動物嚴(yán)重 生理缺陷 。 缺 點(diǎn) 2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染法 原理：當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒的 RNA 進(jìn)入細(xì)胞后，逆 轉(zhuǎn)錄成 DNA ，依靠逆 轉(zhuǎn)錄病毒的整合酶及其 末端特異的核苷酸序列， DNA前病毒可整合到 染色體上，從而將其所 攜帶的外源基因插入到 染色體上。 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法特點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： 在各種轉(zhuǎn)基因方法中，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法 的轉(zhuǎn)基因效率是最高的，且為單拷貝隨機(jī)整合。 缺點(diǎn)： 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在設(shè)計(jì)時(shí)雖然缺失了病毒 的復(fù)制功能序列，但是復(fù)制大量載體 DNA所需的輔助 病毒基因組內(nèi)有可能與目的基因一起整合到同一細(xì) 胞核中，就可能大量復(fù)制病毒，造成嚴(yán)重的污染， 故不安全。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體容量有限，只能 轉(zhuǎn)移小片段 DNA（ 10kb），而且逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端 重復(fù)的甲基化狀態(tài)常使轉(zhuǎn)基因的表達(dá)缺失。 3 精子載體法 1989 年 , Lavitrano等將質(zhì)粒與小鼠的附睪精子，在等滲 溶液中共育 30 min 后進(jìn)行體外受精和移植，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基 因陽性小鼠并能遺傳給后代。 Rottman 等對上述精子載體法進(jìn)行了改進(jìn)，其將外源 DNA 用脂質(zhì)體包埋，再與雞精子共同孵育，然后人工 受精取得成功。 Anthony等嘗試了一種新的方法，預(yù)先將小鼠的精子進(jìn) 行破膜處理，再與外源基因共孵育 1 min ，然后將精 子頭部顯微注射入 M 期的小鼠卵母細(xì)胞，獲得成功。 該項(xiàng)研究揭示，精子膜破損后外源 DNA 穿過外膜吸附 于內(nèi)膜 ,更有利于轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)生。 精子與外源 DNA結(jié)合的機(jī)理 Smdrdora(1998) 的研究結(jié)果表明。只有附 睪精子和經(jīng)洗滌去精清的精子才能有效地 攜帶外源 DNA，這說明精漿中某種因子強(qiáng) 烈抑制外源 DNA的結(jié)合。這些因子可能直 接作用于 DNA分子，也可能競爭結(jié)合在精 子表面的結(jié)合部位而間接起作用。 促進(jìn) DNA與動物精子結(jié)合的方法 1 共孵育法 2 電穿孔法 3 脂質(zhì)體法 精子載體法？ 別人無法重復(fù) 4、胚胎干細(xì)胞法 獲得功能基因 構(gòu)建基因打靶載體 轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞獲得基因剔除細(xì)胞系 制備嵌合體 篩選進(jìn)入生殖系小鼠 轉(zhuǎn)基因小鼠（ F1）表型分析 選擇單系同胞交配產(chǎn)生（ F2）代 篩選純合子的轉(zhuǎn)基因小鼠 胚胎干細(xì)胞法 建立轉(zhuǎn)基因鼠的實(shí)驗(yàn)程序 與傳統(tǒng)育種方法相比較， ES細(xì)胞在生產(chǎn) 轉(zhuǎn)基因動物方面表現(xiàn)其獨(dú)特的優(yōu)勢： （ 1）打破了物種的界限，突破了親緣關(guān)系的限制，加快 了動物群體遺傳變異程度； （ 2）可以進(jìn)行定向變異和育種，利用同源重組技術(shù)對 ES細(xì)胞進(jìn)行遺傳操作，通過細(xì)胞核移植生產(chǎn)遺傳修飾 性動物，有可能創(chuàng)造新的物種； （ 3）利用 ES細(xì)胞技術(shù)，可在細(xì)胞水平對胚胎進(jìn)行早期 選擇，這樣可以提高選擇的準(zhǔn)確性，縮短育種時(shí)間。 近年來的研究表明，利用 ES細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物在動 物生產(chǎn)中發(fā)揮著極為重要的作用。 基因打靶 5 體細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺 Cloned sheep has human gene POLLY DOLLY Korea： Production of transgenic cloned pigs transgenic cloned pigs with the green fluorescent protein (GFP) on June 8, 2003. 導(dǎo)入人乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因的克隆奶 牛 2005年初在唐山降生 6 精原干細(xì)胞介導(dǎo)法 generation of transgenic rats Which gene transfer technique involves a tiny needle which is used to inject DNA into a cell lacking that DNA sequence? A) spermatogonial stem cells transplantation B) liposome transfer C) microinjection D) gene targeting of embryo stem (ES) cells Genetic engineering manipulates gene products at the level of the A) protein. B) amino acid. C) DNA. D) RNA. 轉(zhuǎn)基因雞 現(xiàn)在的工作：轉(zhuǎn)基因魚 二 轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用 （ 1）動物品種改良； （ 2）生物制藥 (乳腺生物反應(yīng)器 )； （ 3）建立人類疾病的動物模型； （ 4）生產(chǎn)可移植用的動物器官； （ 5）基因治療 (動物模型 )； （ 6） 基因打靶 。 （ 1）動物品種改良 抗病育種 生長性狀 （ 2）生物制藥 (乳腺生物反應(yīng)器 ) 如荷蘭的 GenPharm公 司用轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)乳鐵 蛋白，預(yù)計(jì)每年從牛奶 生產(chǎn)出來營養(yǎng)奶粉的銷 售額是 50億美元。 （ 3）建立人類疾病的動物模型 已建立的部分人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型 _ 疾病模型 基因轉(zhuǎn)移方法 轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因 _ 老年性癡呆征 顯微注射 淀粉樣蛋白基因 型糖尿病 顯微注射 胰島淀粉樣多肽基因 地中海貧血癥 顯微注射 人 珠蛋白基因 鐮刀形細(xì)胞貧血癥 顯微注射 人 和 珠蛋白基因 唐氏綜合癥 顯微注射 Cu/Zn-SOD酶基因 卡氏肉瘤 反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染 HIV tat基因 成骨不全癥 顯微注射 突變的 1膠原蛋白前體基因 自毀容貌癥 ES細(xì)胞同源重組 突變 HGPRT基因 _ 4） 生產(chǎn)可移植用的動物器官 我國每年有 150萬人需要器官移植，但是 僅僅不到 1萬人能夠得到供體。 豬的臟器移植給人，會發(fā)生超急性排斥反 應(yīng)。 轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)能降低或掩蓋半乳糖基轉(zhuǎn) 移酶活性的轉(zhuǎn)基因豬。 如何用細(xì)胞工程解決移植器官的來源問題 ? Science (2002). 295, 10891092 （ 5）基因治療 上世紀(jì)九十年代初，一位因 ADA(腺苷酸脫氨酶 )基因缺陷導(dǎo) 致嚴(yán)重免疫缺損的四歲女孩，由 美國國立衛(wèi)生研究院用 ADA基因 治愈?！盎蛑委煛毖芯繜釓拇?波及全世界，起而效顰，為保障 人類健康展現(xiàn)了美好的前景。 （ 6）基因打靶 基因打靶 (Gene targeting)是一種在胚胎干細(xì) 胞 (ES)技術(shù)和同源重組技術(shù)的基礎(chǔ)之上 ,定向 改變生物活體遺傳信息的實(shí)驗(yàn)手段。 基因敲除 (gene knockout)：定向敲除 基因敲入 (gene knockin)：定向替代 基因打靶的研究意義 基因功能研究 人類疾病動物模型的研制 經(jīng)濟(jì)動物遺傳物質(zhì)的改良 三個(gè)主要環(huán)節(jié) 打靶載體的構(gòu)建 靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選 由中靶細(xì)胞制備轉(zhuǎn)基因動物 基因打靶技術(shù) 根據(jù)打靶細(xì)胞的不同，基因打靶主要分為 : 1 胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)的基因打靶技術(shù) 2 體細(xì)胞克隆介導(dǎo)的基因打靶技術(shù) 3 精原干細(xì)胞介導(dǎo)的基因打靶技術(shù) 胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)的基因打靶技術(shù) 首先獲得 ES細(xì)胞系，利用同源重組技術(shù) 獲得帶有研究者預(yù)先設(shè)計(jì)突變的中靶 ES 細(xì)胞。通過顯微注射將經(jīng)過遺傳修飾的 ES細(xì)胞引入受體胚胎內(nèi)。經(jīng)過遺傳修飾 的 ES細(xì)胞仍然保持分化的全能性，可以 發(fā)育為嵌合體動物的生殖細(xì)胞，使得經(jīng) 過修飾的遺傳信息經(jīng)生殖系遺傳。 體細(xì)胞克隆介導(dǎo)的基因打靶技術(shù) 家畜的體細(xì)胞克隆技術(shù)已取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展， 為轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)提供了一條新途徑。 直接在體細(xì)胞中進(jìn)行基因同源重組，體外篩選 中靶細(xì)胞，再以之為核供體獲得轉(zhuǎn)基因后代， 是當(dāng)前家畜基因打靶的一條有效途徑。但是， 由于體細(xì)胞體外培養(yǎng)的有限性和同源重組概率 低，使體細(xì)胞克隆途徑的基因打靶效率比胚胎 干細(xì)胞途徑大為降低。 精原干細(xì)胞介導(dǎo)的基因打靶技術(shù) 日本研究人員 Kanatsu-Shinohara等（ 2006） 首次利用 SSCs技術(shù)平臺進(jìn)行了基因打靶研究。 他們構(gòu)建了封閉蛋白 Occludin基因敲除載體， 電穿孔法轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的小鼠 SSCs，經(jīng)過篩 選，獲得了二株中靶 SSCs集落；再選擇一株 中靶 SSCs移植進(jìn)不育小鼠曲細(xì)精管內(nèi)能夠重 塑精子發(fā)生并產(chǎn)生了雜合后代，雜交后獲得 了純合的基因打靶后代。 基因打靶的必備條件 胚胎干細(xì)胞 (ES細(xì)胞 ) 能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性 打靶載體 Neo（新霉素）陽性篩選標(biāo)志 HSV-tk陰性篩選標(biāo)志：單純皰疹病毒 (herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶 (thymidine kinase) 基因敲除的基本程序 打靶載體的構(gòu)建 打靶載體導(dǎo)入 ES細(xì)胞：重組置換 基因敲除 ES細(xì)胞注射入胚泡 胚泡植入假孕小鼠的子宮中 嵌合體的雜交育種 同源重組 同源重組 (Homologous recombination) ，是指相似 的 DNA交換遺傳信息的過程 , 外源 DNA片段可與宿 主基因組的相應(yīng)片段發(fā)生交換（即重組）。 基因打靶通常是指用含已知序列的 DNA片段與受體 細(xì)胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組， 整合至受體細(xì)胞基因組中并得以表達(dá)的一種外源 DNA導(dǎo)入技術(shù)。 （ 6）基因打靶 正負(fù)雙向選擇系統(tǒng) (positive-negative-selection, PNS) 同源重組時(shí)，只有載體的同源區(qū)以內(nèi)部分發(fā)生重組， 同源區(qū)以外部分將被切除。隨機(jī)整合時(shí)，是在載體 的兩端將整個(gè)載體連入染色體內(nèi)。置換型載體含有 正負(fù)選擇基因各一，正選擇基因多為 neo基因，位于 同源區(qū)內(nèi)，其在隨機(jī)整合和同源重組中均可正常表 達(dá)。負(fù)選擇基因在靶基因同源區(qū)之外，位于載體的 3 末端，常用 HSV-tk基因，在同源重組時(shí)， tk基因?qū)?被切除而丟失，相反在隨機(jī)整合時(shí)，所有的序列均 保留（包括 tk）。 胸苷激酶蛋白（ TK）可使無毒的丙氧鳥苷 （ GANC）轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘院塑账?，而殺死?xì)胞，因而 可用丙氧鳥苷篩選排除隨機(jī)整合的細(xì)胞株。故同源 重組時(shí)， G418和 GANC都有抗性，隨機(jī)整合時(shí)對 G418有抗性，但對 GANC敏感，細(xì)胞將被殺死，無 整合的將被 G418殺死。用 G418作正篩選，選出含 有 neo基因的細(xì)胞株，再用丙氧鳥苷作負(fù)篩選淘汰 含有 tk基因的細(xì)胞株，保留未含有 tk基因的同源重 組細(xì)胞株。此方法是目前應(yīng)用較廣泛的一種策略。 正向篩選標(biāo)記基因 Neo具有雙重作用，一方面導(dǎo)致 靶基因的插入突變；同時(shí)作為重組細(xì)胞的正向篩選 標(biāo)志，該基因產(chǎn)物可使細(xì)胞在含有新霉素的培養(yǎng)基 中生長。 實(shí) 驗(yàn) 流 程 Gene targeting is done on a(an) A) sperm cell. B) egg cell. C) fertilized ovum. D) embryonic stem cell. 應(yīng)用舉例 肌肉生長抑制素基因 Myostatin基因敲除 Myostatin基因是一種特異性骨骼肌生長發(fā)育 的抑制因子。該基因與動物骨骼肌總量的調(diào) 節(jié)有關(guān)，其序列在進(jìn)化過程中高度保守，所 有哺乳動物和鳥類均有很高的同源性。 Myostatin基因在功能上也是非常保守的，其 功能的缺失會造成可導(dǎo)致肌肉異常肥大。 比利時(shí)藍(lán)牛肌肉增加表型 皮埃蒙特牛肌肉增加表型 雙 肌 左圖為德國 “ 娃娃超人 ” 未滿月時(shí)的照片， 右圖為他 7個(gè)月時(shí)的照片。白色和黑色的箭頭 指示著他超凡的小腿和大腿肌肉 Myostatin基因敲除“超級鼠” 美培育轉(zhuǎn)基因鱒魚：腹肌有 6塊 ,肉多 15% 2007年生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)諾貝爾獎(jiǎng) 美國猶他大學(xué) Eccles 人類遺傳學(xué)研究所科學(xué)家 Mario R. Capecchi 、美國北卡羅來納州大學(xué)教 會山分校醫(yī)學(xué)院教授 Oliver Smithies 與英國科學(xué) 家卡迪夫大學(xué)卡迪夫生命科學(xué)學(xué)院 Martin J. Evans因 胚胎干細(xì)胞和基因打靶 研究獲得此獎(jiǎng)項(xiàng)。 http:/ 3 乳腺生物反應(yīng)器 mammary gland bioreactor: Protein Factory of the Future 1987年美國科學(xué)家戈登（ Gordon）等人 首次在小鼠的奶中生產(chǎn)出一種醫(yī)用蛋白 tPA（組織型纖溶酶原激活物），展 示了用動物乳腺生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的可 能性。利用動物乳腺生產(chǎn)高價(jià)值產(chǎn)品的 方式稱為 乳腺生物反應(yīng)器 。 轉(zhuǎn)基因山羊 -活動的制藥廠 Mammary epithelial cells 動物 多肽藥物 用途 綿羊 a1抗胰蛋白酶蛋白 治療氣腫 綿羊 CFTR 治療 囊腫性纖維化 綿羊 組織型纖溶酶原活化因子 治療血栓 綿羊 凝血 VIII因子、 IX因子 治療血友病 綿羊 纖維蛋白原 傷口愈合 豬 組織型纖溶酶原活化因子 治療血栓 豬 凝血 VIII因子、 IX因子 治療血友病 山羊 人蛋白質(zhì) C 治療血栓 山羊 抗血栓因子 3 治療血栓 山羊 谷氨酸脫羧酶 治療 I型糖尿病 山羊 Pro542 治療愛滋 病 牛 a-乳清白蛋白 抗炎癥 牛 凝血 VIII因子 治療血友病 牛 纖維蛋白原 傷口愈合 牛 膠原蛋白 I, II 組織修復(fù) , 治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 牛 乳鐵蛋白 治療腸道感染 , 感染性關(guān)節(jié)炎 牛 人血清白蛋白 維護(hù)血液體積 雞 , 牛 , 山羊 單克隆抗體 用于疫苗生產(chǎn) 前 景 轉(zhuǎn)基因動物制藥（乳腺生物反應(yīng)器）是 21世 紀(jì)生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的一種新的藥物生產(chǎn)模式。 2010年世界上動物乳腺生物反應(yīng)器的年產(chǎn)值 達(dá)到 500億美元 研究展望 轉(zhuǎn)基因技術(shù)是近年發(fā)展很迅速的 一項(xiàng)新技術(shù) ， 尚有許多問題存在 ， 有待進(jìn)一步完善 ， 但是該技術(shù)在醫(yī) 學(xué)和藥學(xué)等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前 景 ， 相信轉(zhuǎn)基因動物研究將極大的 推動醫(yī)藥科學(xué)的發(fā)展 。 攜帶人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因 試管?！疤咸稀?著名科學(xué)家談家楨院士（左）、著名老中醫(yī)徐蔚霖教授與 曾溢滔院士在轉(zhuǎn)基因牛 “ 滔滔 ” 模型前留影 曾溢滔院士與世界克隆羊 “ 多利 ” 之父威爾穆特博 士進(jìn)行學(xué)術(shù)交流 美國公司研制出可當(dāng)寵物出售的 轉(zhuǎn)基因熒光魚 GloFish The GloFish is a patented and trademarked brand of genetically modified (GM) fluorescent zebrafish with bright red, green, orange-yellow, blue, and purple fluorescent colors. Although not originally developed for the ornamental fish trade, it is one of the first genetically modified animals to become publicly available as a pet. 夢幻之畜 轉(zhuǎn)基因動物 GFP 轉(zhuǎn)基因花菜棉羊 雞冠花公雞頭變異 小老鼠獼猴桃綠色血 思考題 名詞解釋 : Gene targeting, mammary gland bioreactor 簡介轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的應(yīng)用 簡介轉(zhuǎn)基因哺乳動物的制備方法 請闡述胚胎干細(xì)胞途徑的基因打靶的基 本原理及實(shí)驗(yàn)流程 請查閱資料，簡介轉(zhuǎn)基因動物最新研究 進(jìn)展