《激光共聚顯微鏡》PPT課件.ppt

激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 樣品要求 原理 功能 在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用 The techniques and application of Confocal Laser Scanning Microscopy 北京大學(xué)醫(yī)藥衛(wèi)生分析中心 何其華 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 人眼分辨率： 0.2mm 光學(xué)顯微鏡分辨率： 0.25mm 電子顯微鏡分辨率： 0.2nm 共焦顯微鏡分辨率： 0.18mm 二 、 原理 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 原理小結(jié) : Confocal 利用放置在光源后的 照明針孔 和放置在檢測 器前的 探測針孔 實現(xiàn) 點(diǎn) 照明 和 點(diǎn) 探測 ， 來自光源的光通過照 明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點(diǎn)上 ， 該點(diǎn)所發(fā) 射的熒光成像在探測針孔上 ， 該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探 測針孔阻擋 。 照明針孔 與 探測針孔 對 被照射點(diǎn) 或 被探測點(diǎn) 來 說是 共軛 的 ， 因此被探測點(diǎn)即共焦點(diǎn) ， 被探測點(diǎn)所在的平面 即共焦平面 。 計算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測點(diǎn)顯示在計算機(jī) 屏幕上 ， 為了產(chǎn)生一幅完整的圖像 ， 由光路中的掃描系統(tǒng)在 樣品焦平面上掃描 ， 從而產(chǎn)生一幅完整的 共焦圖像 。 只要載 物臺沿著 Z軸上下移動 ， 將樣品新的一個層面移動到共焦平 面上 ， 樣品的新層面又成像在顯示器上 ， 隨著 Z軸的不斷移 動 ， 就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像 。 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的 區(qū)別 1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的 區(qū)別 2. 具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)切片 conventional confocal 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的 區(qū)別 3. 增加側(cè)向分辨率 d 2 alc o n v e n t io nc o n f o c a l dd 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的 區(qū)別 4. 由于點(diǎn)對點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 三 . 激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計特點(diǎn) : 1.點(diǎn)照明 2.具有照明 pinhole和探測 pinhole 3.照明 pinhole和探測 pinhole共軛 (共焦 ), 共焦點(diǎn)即 被探測點(diǎn)，被探測點(diǎn)所在的平面為共焦平面 4.具有掃描系統(tǒng) 逐點(diǎn)掃描成像 5.具有多個（四個） 熒光通道，可同時探測多個 被標(biāo)記物 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 技術(shù)指標(biāo) （ Leica TCS SP2) : 1. xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小 1.4x 傳統(tǒng)顯微鏡 : Rxy=0.61/NA （ 0.25 mm ) Confocal: Rxy=0.4/NA（ 0.18 mm ) 2. 樣品的最大厚度 : 取決于 : 物鏡的 NA、 物鏡的 工作距離 激光的穿透力 、 樣品的透明度 Z軸的最大移動范圍 (166mm、 Z-wide) 3. 樣品的最小光切厚度 : (載物臺最小移動距離為 40nm） 取決于 : 物鏡的 NA、針孔大小 Z軸的最小移動步距 : 40nm Z軸的分辨率 : 0.35 mm 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 4. 激光器 Ar激光器 : 458nm, 476nm, 488nm, 514nm GreNe : 543nm; HeNe: 633nm Ar激光器 (UV): 361nm 激光器的特點(diǎn) : 1) 方向性好 : 激光基本延直線傳播 2) 單色性好 :=10-8nm 3) 高亮度 : 激光方向性好 , 其在空間上的能量分布是高度 集中的 。 4) 偏振性 : 激光為平面偏振光 , 光纖耦合 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 5. 四個熒光通道 , 一個透射光通道 即除了可同時采集多標(biāo)記熒光圖像外 還可以同時采集透射光圖像 ,但透射光 圖像為 非共焦圖像 。 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 6.掃描速度 : slow 220lines/s 512512 2-3秒 slow2 440lines/s（ 2：雙向掃描） medium 450lines/s 512512 1.7秒 medium2 900lines/s fast 1000lines/s 512512 0.7秒 128128 0.2秒 fast2 2000lines/s 7. 掃描密度 : 6464 128128 512512 10241024 20482048 激光掃描共焦顯微鏡 技術(shù)的應(yīng)用 The application of Confocal Laser Scanning Microscopy 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 功能 . 1.多熒光標(biāo)記樣品的高清晰度、高分辨率圖像采集 2.無損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微“ CT” 3.真正的三維重組 4.假三維圖的顯示 5.可沿 Z軸（ xy平面）和 Y軸（ xz平面）方向進(jìn)行光切 6.定量分析 7.時間序列掃描 : xyt 、 xyzt 和 xt 掃描 8.圖像處理 9. 旋轉(zhuǎn)掃描 10.感興趣區(qū)域掃描 11.光譜掃描 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 應(yīng)用 定位 、 定量 三維重組 動態(tài)測量 活細(xì)胞或組織內(nèi)游離 Ca2+分布和濃度的變化 測量 (Mg2+ 、 Zn+ 、 Na+ 、 K+) 自由基的檢測 藥物進(jìn)入細(xì)胞的動態(tài)過程 、 定位分布及定量 蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 活細(xì)胞內(nèi) H+濃度 （ pH值 ） 的測量 線粒體 膜電位 的測量 熒光漂白恢復(fù) （ FRAP） 的測量 籠鎖解籠鎖的測量 熒光能量共振轉(zhuǎn)移 （ FRET） 的測量 其他應(yīng)用 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 一、定位、定量 免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三 標(biāo)）的定位、 定量：如：細(xì)胞膜受體或抗原的分布， 微絲、微管的分布、 兩種或三種蛋 白的 共存 與 共定位 、蛋白與細(xì)胞器的 共定位、核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位和干細(xì)胞的 增值、分化 細(xì)胞凋亡 : AnnexinV-fitc + PI 末端原位雜交 -fitc + PI 熒光原位雜交： 染色體基因定位 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 定位 、 定量研究中常用熒光探針 1.Amine-Reactive Probes 與抗體耦聯(lián) 、 與配體耦聯(lián) 、 與肽耦聯(lián) 、 與人工合成的寡聚核苷酸 耦聯(lián)的探針 ， 可用于免疫組化 、 熒光原位雜交 、 受體標(biāo)記等 Green Red Fura-red FITC 494/518 TRITC 544/572 Cy5 650/690 (異硫氰基熒光素 ) (四甲基異硫氰基羅丹明 ) Alexa Fluor 488 488/530 PE 565/578 (藻紅蛋白 ) Texas Red 595/615 (德州紅 ) Cy3 558/568 BODIPY FL 503/512 BODIPY TMR 543/569 BODIPY TR 592/618 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 1)細(xì)胞表面抗原 、 胞內(nèi)某種蛋白 免役熒光標(biāo)記： 與抗體耦聯(lián) , 直標(biāo) : 一抗 +熒光探針 間標(biāo) : 二抗 +熒光探針 如 : 微管蛋白 tublin ( 抗 tublin抗體 +熒光探針 ) 肌動蛋白 actin ( Palloidine+熒光探針 ) 2)細(xì)胞膜表面受體 配體 +熒光探針 如 : nAchR、 mAchR、 多巴胺受體 (D1,D2) 標(biāo)記 Gm1: 霍亂毒素受體 霍亂毒素 +FITC 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 2.標(biāo)記 細(xì)胞器 熒光探針 1)線粒體 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活細(xì)胞，陽離子 , 可檢 測線粒體膜電位 , 且在多數(shù)細(xì)胞中停留 時間短 JC1 線粒體膜電位低時為單體 490/527 發(fā)綠光 線粒體膜電位高時為多聚體 490/590 發(fā)紅光 可標(biāo)記活細(xì)胞線粒體，且為檢測線粒體膜電位最 佳探針 Mitotracker Green FM 490/516, 染活細(xì)胞或固定細(xì)胞 , 穩(wěn)定不漏出 Mitotracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型 ) Mitotracker Orange 還原型 , 只能染活細(xì)胞 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 2)溶酶體 Lysosome 中性紅 541/640: 微偏堿性 , 可標(biāo)記溶酶體等酸性器官 為非特異性 AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活細(xì)胞 LysoTracker Blue LysoTracker Red 3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特異性 , 較 高 濃度標(biāo)記 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) , 較 低 濃度標(biāo)記 線粒體 4)高爾基體 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死細(xì)胞 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 細(xì)胞器的單克隆抗體 5)細(xì)胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/RNA 死細(xì)胞 碘化丙啶 EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死細(xì)胞 Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活細(xì)胞 Hochest 33258 352/461 DNA A-T 活細(xì)胞 DAPI 358/461 DNA A-T 半通透細(xì)胞 Chromomycin A3 450/470 DNA G-C AO 500/526 DNA 活細(xì)胞 560/650 RNA TOTO-1 514/533 DNA 死細(xì)胞 SYTO1116 2024 488/ 520 活細(xì)胞 SYTO1116 2024 521/ 556 活細(xì)胞 SYTO 17 621/634 活細(xì)胞 3. GFP 綠色熒光蛋白 GFP的的發(fā)現(xiàn)： 60年代 ， Shimomura等首先從水母中分離出一 種 水母發(fā)光蛋白 (aequoren)， 該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn) 生藍(lán)色熒光 。 然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色 ， 后經(jīng)證實 在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即 綠色熒光蛋白 GFP, 后 經(jīng)研究表明 ， 在水母體內(nèi) Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后 ， 水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍(lán)色熒光 ， GFP在藍(lán)光的激發(fā)下 ， 產(chǎn)生綠色 熒光 。 將外源基因與 GFP DNA 相連 , GFP可作為外源基因的報告基 因?qū)崟r監(jiān)測外源基因的表達(dá) . 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 GFP主要應(yīng)用 : 對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動態(tài)觀察 可實時原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長、分裂、分化過程中 或外界刺激因子的作用下的時空表達(dá) , 如某種轉(zhuǎn)錄因子的 核 轉(zhuǎn)位 、蛋白激酶 C的 膜轉(zhuǎn)位 等。 GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞 , 可動態(tài)觀察 該分泌蛋白分泌到細(xì)胞外的過程 GFP基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因相連 ,就能顯 示活細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器 的結(jié)構(gòu)及病理過程 可用于觀察分子的運(yùn)動（ FRAP） 蛋白之間的相互作用（ FRET） 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 三 .動態(tài)測量 Physiology:細(xì)胞內(nèi)離子動態(tài)變化測量 1).游離 Ca2+測量 檢測游離 Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為 Ca2+螯合劑，不與 Ca2+結(jié)合時不發(fā)熒光，通常也不能進(jìn)入細(xì)胞膜，只有與乙酰甲酯 AM相 連方可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒 光。 Kd值為 Ca2+解離常數(shù)，表明檢測 Ca2+濃度的范圍 :0.1xKd-10 xkd, Kd 和很多因素有關(guān)，如 pH、 Mg2+、與蛋白的結(jié)合、溫度等。細(xì)胞內(nèi)生理 Ca2+濃度值 (10-100n M)，細(xì)胞內(nèi) Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ) Ca2+濃度的 10倍 左右） 熒光探針 激發(fā)波長 發(fā)射波長 Kd FLuo3-AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nM Fluo4 506nm 525nm Calcium Green-1 507nm 530nm 190nM Calcium Green-2 507nm 535nm 550nM Fura red 420/480nm 637nm 140nM Oregon Green 488 494nm 520nm 20,000nM Calcium Crimson 583nm 602nm 328nM Indo-1 356nm 405/458nm 230nM Fura-2 340/380 476nm 145nM 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 程序化測量：用 timelapse中的編程按鈕可進(jìn)行不同時間序列的掃描測 量 。 F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG) Ca2+濃度絕對測量 1） 單波長公式法 Fluo3: 530nm Kd=450nM Ca2+I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F) Fmin: 細(xì)胞內(nèi)無鈣時的熒光強(qiáng)度 ( MnCl2) Fmax：細(xì)胞內(nèi)鈣飽和時的熒光強(qiáng)度 (A23187) 測量時切記細(xì)胞內(nèi)靜息 Ca2+濃度的相對熒光強(qiáng)度值不能太低 （ F值 不低于 40） 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 細(xì)胞內(nèi)生理 Ca2+濃度值（ 10-8 -10-7 M） 細(xì)胞內(nèi) Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ) Ca2+濃度的 10倍左右） 2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法 根據(jù)儀器條件和負(fù)載條件，以不同 Ca2+濃度的 Buffer(EGTA- Ca2+)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫軸為 Ca2+濃度，縱軸為熒光強(qiáng)度 3）比例熒光的測量 .雙波長 (比例熒光： ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440) Ca2+I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 快速 Ca2+變化的測量 1.改變掃描速度 2.采用雙向掃描 3.減少采樣點(diǎn)數(shù) (犧牲空間分辨率） 4.采用線掃描 (xt) 細(xì)胞器的 Ca2+測量 1.線粒體內(nèi)游離 Ca2+測量 Fluo-3 + TMRM(線粒體熒光探針 ， 紅色 ） 2. 特異定位的重組水母發(fā)光蛋白 水母發(fā)光蛋白與 Ca2+結(jié)合后發(fā)藍(lán)光 用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細(xì)胞器蛋白的表達(dá)載體 轉(zhuǎn)染細(xì)胞 ， 可測定亞細(xì)胞器內(nèi)的游離 Ca2+變化 目前已商品化的探針可檢測：線粒體 、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 、 細(xì)胞核 內(nèi)的游離 Ca2+， 因生物發(fā)光很弱不能使用 Confocal檢測 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+測量的應(yīng)用 鈣的特性 1 細(xì)胞內(nèi)外的電化學(xué)梯度 103-104倍 2 細(xì)胞膜滲透性稍有改變或鈣庫釋放稍有增加 ， 導(dǎo)致 胞內(nèi)鈣明顯升高 3 細(xì)胞內(nèi)鈣為細(xì)胞激活 “ 開關(guān) ” 細(xì)胞內(nèi)鈣的生理作用 1 肌肉的興奮收縮 -收縮偶聯(lián) 2 神經(jīng)遞質(zhì)的釋放 3 學(xué)習(xí)記憶的增強(qiáng) 4 卵子受精 5 細(xì)胞分裂和再生 6 細(xì)胞調(diào)亡 7 細(xì)胞間通訊 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 8 細(xì)胞信號傳導(dǎo) 9. DNA合成 10. 基因表達(dá) 細(xì)胞內(nèi)鈣超載與疾病 1 高血壓 、 腦缺血 、 心臟病 、 內(nèi)分泌病 胞內(nèi)鈣濃度異常 2 糖尿病 、 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 、 多發(fā)性硬化病 胞內(nèi)鈣濃度增高 3 人體缺鈣 骨鈣大量丟失 ， 神經(jīng)細(xì)胞的鈣濃度增高 4 老化和老年性癡呆 -神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增高 細(xì)胞內(nèi)生理 Ca2+濃度值（ 10-8 -10-7 M） 細(xì)胞內(nèi) Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ) Ca2+濃度的 10倍左右） 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 電刺激引起骨骼肌 細(xì)胞的 Ca2+振蕩 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 pH值的檢測： BCECF-AM 490nm 530nm 6.5-7.5 Snarf-1-AM 488nm 580/640nm 7.0-8.0 自由基的檢測 熒光探針： H2DCF-DA（ 504nm/529nm） 2-氫， 2氯熒光素乙酰乙酸鹽 胞外 H2DCF-DA 擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi) 酯酶脫乙酰 DCF-H(不熒發(fā)光） DCF（發(fā)熒光 ） *樣品不能在鏡下用汞燈照射及觀察 Dihydrorhodamine 123（ 507nm/529nm） H2rhod123 被動擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi) 在細(xì)胞內(nèi)被氧化成 rod123（發(fā)光） 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 藥物進(jìn)入細(xì)胞的動態(tài)過程及定位分布 xyzt 掃描 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 四 . 膜電位的測量 標(biāo)記膜電位探針 (慢反應(yīng)）： JC1 510nm 530/590nm Dioc5(3) 548nm 573nm Dioc6(3) 484nm 500nm 快反應(yīng)探針： Di-4-ANEPPS 496nm 703nm Di-4-ANEPPS 498nm 713nm 細(xì)胞膜靜息膜電位： -70mV 線粒體膜電位： -150mV 以上均屬于陽離子探針，更容易與線粒體親和，為線粒體膜電位探針 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 七 熒光能量共振轉(zhuǎn)移 ( fluorescence Resonance Energy Transfer) 能量轉(zhuǎn)移：能量從分子的一個部位向另一個部位的傳遞 ， 或能量從一個分子向另一個分子傳遞 。 能量的提供者 叫能量供體 ， 能量的接受者叫能量受體 。 熒光能量共振轉(zhuǎn)移的 條件： 兩個熒光分子： 供體 -FL1， 受體 -FL2 供體與受體的距離在 2-7nm 供體的 發(fā)射波長 與受體的 激發(fā)波長 一致 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 樣品要求 ： 1.經(jīng)熒光探劑標(biāo)記 (單標(biāo)、雙標(biāo)、三標(biāo)） 2.固定的或活的組織 3.固定的或活的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)培養(yǎng)在 Confocal專用小培養(yǎng)皿或蓋玻片上 4.懸浮細(xì)胞，甩片或滴片后，用蓋玻片封片 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 激光掃描共焦顯微鏡的發(fā)展 趨勢 ： 連續(xù)光譜型 Confocal 多光子激光掃描顯微鏡 Multiphoton Laser Scanning Microscopy 雙 (多 )光子激光掃描顯微鏡的 優(yōu)勢 多光子激光掃描顯微鏡簡介 1. 多光子激光器波長從 700-1000nm 連續(xù)可調(diào) 雙光子波長： 350-500nm 連續(xù) 三光子波長： 230-330nm 連續(xù) 應(yīng)用：可直接清晰活體觀察某些 非標(biāo)記 神經(jīng)遞質(zhì)的分 泌 (5-HT) 或 NADPH的分布 例 4 長時間觀察活體阿爾茨海默病模型 小鼠 淀粉蛋白形成的狀況