用熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)及觀察口腔上皮細(xì)胞的DNA

實(shí)驗(yàn) 熒光顯微鏡結(jié) 構(gòu)及口腔粘膜上皮細(xì) 胞 DNA的觀察 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理 儀器、材料與試劑 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)報(bào)告及思考題 實(shí) 驗(yàn) 目 的 了解熒光顯微鏡的基本構(gòu)造和基本光路 了解熒光探針 Hoechst33258或 33342與細(xì) 胞成分的結(jié)合特性和光譜特性 熒 光 顯 微 鏡 什么是熒光 ? 物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn) 變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。 即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長(zhǎng)波光。 一種光化熒光 熒光的種類(lèi) 自發(fā)熒光 次生熒光 自發(fā)熒光：物質(zhì)受光激發(fā)產(chǎn)生的固有熒光 次生熒光：物質(zhì)借熒光色素受光激發(fā)產(chǎn)生的熒光 熒光的性質(zhì) 吸收光 保持固有的熒光特性 熒光波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)（ STOKES 法則） 熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度 有不同程度的衰減 熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、 熒光效率 落射熒光顯微鏡的構(gòu)造 吸收濾色鏡 激發(fā)濾色鏡 分色鏡 汞燈 紫外線保護(hù)罩 孔徑光欄 （ FS） 視場(chǎng)光欄 （ AS） 落射熒光顯微鏡各部件特性和作用 汞燈光源 : 提供激發(fā)光 (UV、 B、 G) 激發(fā)濾色鏡 : 波長(zhǎng)選擇 nm T% BAND PASS 落射熒光顯微鏡原理 汞 燈 激發(fā)濾色鏡 分色鏡 吸收濾色鏡 物 鏡 標(biāo) 本 濾色鏡的選擇 熒光素 激發(fā)波長(zhǎng) 發(fā)射波長(zhǎng) DAPI 372 456 AMCA 350 450 Hoechst 33258 365 465 FITC 490 520 Acridine Orange 490 590 Acridine Yellow 470 550 CY3 552 565 TRITC 541 572 Propidium Iodide 530 615 熒光素的特性 濾色鏡的特性 激發(fā) 分色 吸收 根據(jù)熒光素和濾色鏡的特性選擇濾色鏡 實(shí) 驗(yàn) 原 理 熒光顯微鏡技術(shù)是利用一定波長(zhǎng)的光 （ 通常是波長(zhǎng) 短的紫外光和藍(lán)紫光 ） 照射被檢樣品 ， 樣品獲得能量 ， 產(chǎn)生能量躍遷 ， 從基態(tài)到汽激發(fā)態(tài) ， 再?gòu)募ぐl(fā)態(tài)回到原 態(tài) ， 放出光和熱能 ， 產(chǎn)生的光為波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光 （ 相對(duì)于 激發(fā)光波長(zhǎng) ） ， 此可見(jiàn)光稱(chēng)為熒光 。 通過(guò)物鏡 、 目鏡的 成像 、 放大 ， 以供觀察 、 檢測(cè)和拍攝 。 熒光顯微鏡要求有特殊的光源提供足夠強(qiáng)度和 較短波長(zhǎng)的激發(fā)光，誘發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的 熒光。視野中所看到的像，主要是樣品的熒光映像。 熒光顯微鏡技術(shù)是在光學(xué)顯微鏡水平上對(duì)蛋白質(zhì)和 亞細(xì)胞組分進(jìn)行定位的最常用的方法之一。非免疫 熒光探針可用來(lái)直接標(biāo)記許多特殊的亞細(xì)胞組分及 生物大分子。這些探針大多數(shù)能被活細(xì)胞直接攝取 并摻入和聚集在特定的細(xì)胞器中，因此我們就可以 通過(guò)熒光顯微鏡對(duì)這些細(xì)胞器進(jìn)行觀察。 Hoechst33258是一種親脂性物質(zhì)，可跨 膜進(jìn)入活細(xì)胞，與 DNA特異性結(jié)合，它主要 結(jié)合在富含 AT區(qū)域的 DNA小溝部分。結(jié)合 DNA后熒光大大增強(qiáng)，最大激發(fā)光波長(zhǎng)約為 350nm, 最大發(fā)射光波長(zhǎng)約為 461nm?？捎?于活細(xì)胞觀察，不需要對(duì)細(xì)胞作固定及透化 處理。 儀器、材料與試劑 儀器：熒光顯微鏡， 材料：口腔粘膜上皮細(xì)胞，載玻片，牙簽 試劑： PBS(pH 7.4) Ho.33258 or H.33342（ 10g/mL，溶于 PBS) 實(shí) 驗(yàn) 步 驟 在 1張載玻片上分別滴加一滴 PBS溶液 用牙簽刮取口腔上皮細(xì)胞，分別涂于載玻片上（牙簽 在液滴中攪勻） 在涂細(xì)胞處分別滴加 10 g/mL的 Hoechst.33342蓋 片 室溫暗處孵育 2-3分鐘 用紫外光激發(fā)，觀看細(xì)胞 DNA熒光 注 意 事 項(xiàng) 蓋片時(shí)防止產(chǎn)生氣泡 滴加的染料不宜太多 ， 否則背景太深 ， 影響觀察 注意避光 ， 包括制片 、 熒光觀察和探針保存 操作時(shí)防止污染皮膚和環(huán)境 口腔粘膜上皮 .jpg