EB病毒進入B淋巴細胞與上皮細胞的機制

EB病毒進入B淋巴細胞與上皮細胞的機制EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)屬于γ皰疹病毒亞科,能夠感染全球90%的人類,是最早被發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的病毒。它與多種人類疾病尤其是惡性腫瘤相關(guān),其中包括單核細胞增多癥、伯基特淋巴瘤、霍奇金病和鼻咽癌。二十世紀九十年代,有研究表明EBV還與胃癌和乳腺癌相關(guān)。而EBV是如何侵入宿主細胞,如何與宿主細胞相互作用,進而影響疾病發(fā)生發(fā)展,這都是研究者一直關(guān)注和研究的。EBV侵入細胞是其感染宿主細胞以致發(fā)生作用的第一步。這一步一般包括病毒到細胞表面的附著和病毒包膜與細胞膜的融合。由于淋巴細胞表面具有EBV感染的受體,EBV能直接感染侵入B淋巴細胞并使其永生化。研究發(fā)現(xiàn),在多種上皮細胞腫瘤中,有EBV的感染,而上皮細胞缺少像B淋巴細胞上的受體。因此,了解EBV是如何感染進入宿主細胞,尤其是上皮細胞,有利于在體外建立合適的細胞模型及深入研究EBV相關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展的機理。盡管對EBV侵入各類細胞的認識仍不全面,但研究者也提出了EBV進入細胞的幾種機制,并確定許多該過程的主要參與者。這里主要闡述EBV進入B淋巴細胞與上皮細胞的機制。1B淋巴細胞EBV原發(fā)性感染通常發(fā)生在童年時期,沒有明顯的臨床癥狀,然而年紀較大的孩子以及青少年在感染EBV后,就有可能導致傳染性單核細胞增多癥,這是一種自我限制性的淋巴組織增生性疾病。靜止期的人類B淋巴細胞是EBV在體內(nèi)和體外都能感染的初始靶細胞。在被感染之后,病毒能夠終生潛伏在B淋巴細胞中。那么,EBV是如何進入B細胞的?多年研究發(fā)現(xiàn),EBV感染B淋巴細胞的機制主要涉及病毒包膜糖蛋白gp350/220與B細胞表面受體CR2的相互作用以及另外幾種病毒糖蛋白gp42、gB、gH和gL的相互作用。EBV附著于B淋巴細胞,主要依賴于EBV表面包膜糖蛋白gp350/220與B淋巴細胞膜上表達豐富的CR2結(jié)合,但它并不是絕對的。EBV借助gp350/220與B淋巴細胞膜上表達豐富的CR2結(jié)合,從而侵入B淋巴細胞的這一過程,是為人所公認的,占有主導位置的侵入方式。EBV基因BLLF1編碼的gp350/220是一種高度糖基化的單跨膜蛋白,對CR2具有高度親和力,gp350/220有三個區(qū)域,分別是多肽11382、11389和11416序列,參與EBV與B淋巴細胞的侵入。成熟的CR2分子量為145kD,單鏈跨膜糖蛋白,其胞外區(qū)域由串聯(lián)重復的序列60到75的氨基酸的結(jié)構(gòu)模塊組成,稱為短同源重復序列SCR(Shortconsensnsrepeats)。SCR1與SCR2上的結(jié)構(gòu)域可以與gp350/220結(jié)合。gp350/220與B淋巴細胞表面受體CR2的相互作用,可以活化許多細胞通路,特別是NK-kB信號通路,能夠引起IL-6上調(diào),也能誘導受體的加帽以及病毒進入B淋巴細胞的胞吞作用,還能在病毒的釋放過程中發(fā)揮作用。在較低的pH環(huán)境下,gp350/220與CR2結(jié)合,構(gòu)象發(fā)生改變,使得病毒進一步接近宿主細胞,利于EBVgp42與HLA-II(HumanleukocyteantigenclassII)類分子結(jié)合。糖蛋白gp42,為病毒基因BZLF2編碼的產(chǎn)物,能與B淋巴細胞表面的HLA-類分子結(jié)合,將信息傳送給gHgL復合物,從而啟動膜的融合過程,并且這種相互作用可以阻斷T細胞受體對復合物的識別,可能幫助病毒逃避免疫系統(tǒng)的檢測。缺乏HLA-類分子的B淋巴細胞不能受到病毒的重復感染,而在HLA-類分子表達恢復的情況下則可以。類似的,EBV缺乏gp42的表達,不能感染B淋巴細胞,若有可溶性的gp42能再與gHgL結(jié)合形成復合物,則可以感染B淋巴細胞。但又有研究表明,gp42的N-末端多肽氨基酸序列從3681這一區(qū)域,可以抑制膜的融合,這可能與gp42不參與病毒和上皮細胞的融合機制有關(guān)。在病毒包膜與B淋巴細胞膜的融合過程中,病毒糖蛋白gp42,gH和gL以111的比例構(gòu)成穩(wěn)定復合物而發(fā)揮作用。gH是病毒基因BXLF2編碼的產(chǎn)物,參與病毒包膜與宿主細胞膜融合,其尾部的絲氨酸-纈氨酸-脯氨酸(SVP)基序為融合過程所必須。缺少gH的EBV重組體不能發(fā)生細胞膜的融合。gL可能與異源三聚體復合物(gHgLgp42)中的gp42相互作用,對EBV與B淋巴細胞的融合很重要,但更多的研究表明,這一相互作用中g(shù)H起到了主要的決定作用,而由BKRF2編碼的gL,則有助于gH轉(zhuǎn)運與加工,還能活化或招募gB與復合物gHgL的功。此外,在病毒與細胞融合過程中還需要病毒糖蛋白gB的參與。它是皰疹病毒家族中的保守蛋白,含有氨基末端胞外域,其C末端能夠調(diào)節(jié)誘導膜的融合,影響自身在胞內(nèi)的定位。其胞質(zhì)尾區(qū)包含兩個區(qū)域,在膜融合的過程中也有不同的功能。氨基酸序列802至816構(gòu)成的這一區(qū)域?qū)τ行У啬と诤鲜潜仨毜?而序列817至841所包含的區(qū)域則負調(diào)控gB誘導膜融合的功能。PlateAE等研究發(fā)現(xiàn),EBVgB氨基酸序列456至807這一區(qū)域,在EBV與B淋巴細胞融合過程中,會影響gB與gHgL的相互作用。2、上皮細胞EBV相關(guān)的惡性腫瘤可能起源于EBV感染的B淋巴細胞與上皮細胞。眾所周知,在體外,EBV能輕易的感染B淋巴細胞,而對于感染上皮細胞卻很難實現(xiàn)。EBV感染上皮細胞的機制比感染B淋巴細胞的機制要復雜得多。因此,EBV侵入上皮細胞的機制仍是研究熱點。目前,大致有三種EBV感染上皮細胞的模式,以下分別進行闡述。2.1第一種模式:B淋巴細胞或郎罕氏細胞介導的EBV感染上皮細胞模式EBV借助B淋巴細胞感染上皮細胞B淋巴細胞是EBV感染上皮細胞的一種理想媒介。用EBV陽性的淋巴樣干細胞與上皮細胞進行共培養(yǎng),能夠使EBV成功感染上皮細胞。EBV陰性的人鼻咽癌細胞系HONE1、TW-10能通過與EBV感染的Akata細胞共培養(yǎng)來實現(xiàn)EBV對鼻咽癌上皮細胞的感染,并在感染的鼻咽癌細胞系中,能檢測到EBV基因組,如EBNA1、LMP1、LMP2A和LMP2B。新鮮B淋巴細胞或記憶B淋巴細胞有效地介導EBV感染上皮細胞,感染效率達到5%25%。CDShannon-Lowe等研究發(fā)現(xiàn)EBVgp350/220與B淋巴細胞表面受體CR2相結(jié)合,觸發(fā)B淋巴細胞與上皮細胞相互接近,在足夠接近的時候,EBV利用自身蛋白gH、gL、gB等與上皮細胞上相應的受體(詳見2.2EBV依賴自身蛋白與上皮細胞上相關(guān)受體相互作用,感染上皮細胞)相互作用,激發(fā)上皮細胞的內(nèi)吞作用,進入上皮細胞。因此,EBVgp350/220與B淋巴細胞表面受體CR2相結(jié)合,觸發(fā)B淋巴細胞與上皮細胞相互接觸,而這種細胞之間的接觸一旦確立,B淋巴細胞上的EBV就能在其介導下侵入上皮細。EBV通過淋巴細胞轉(zhuǎn)移感染上皮細胞,仍為實驗室建立EBV感染的上皮細胞系的一個有效且實用的方法。我們用帶有GFP標記,并含有EBV全基因組的病毒質(zhì)粒建立穩(wěn)定293細胞,再通過共轉(zhuǎn)質(zhì)粒BZLF1、BALF4,使293細胞中的病毒質(zhì)粒由潛伏期轉(zhuǎn)變?yōu)榱呀馄?從而產(chǎn)生重組的EB病毒顆粒,然后借助B淋巴細胞的介導作用,"轉(zhuǎn)移感染"其他鼻咽癌上皮細胞,而成功感染EBV的上皮細胞,能夠表達綠色熒光蛋白。但是在多次傳代過程中,熒光越來越少,表明EBV在逐漸的丟失,而其中的機制也是我們正在探索的一個課題。有研究表明在hTert永生化的鼻咽上皮細胞中,過表達cyclinD1后,能夠促進EBV穩(wěn)定的潛伏感染。EBV通過郎罕氏細胞,感染上皮細胞DennisMWalling等通過對郎罕氏細胞的相關(guān)研究,提出EBV感染上皮細胞的一種新的模型。郎罕氏細胞,是一種樹突抗原遞呈細胞,定居于皮膚和粘膜上皮的基底層。骨髓來源的郎罕氏細胞前體在血液循環(huán)中,能夠遷移至上皮,并分化為郎罕氏細胞。研究發(fā)現(xiàn),部分郎罕氏細胞前體能夠表達CR2,在血液循環(huán)過程中,受到EBV的潛伏感染,從而作為EBV的一種運輸工具,隨其遷移至上皮,分化為EBV感染的成熟的郎罕氏細胞。而這種細胞的觸角存在于上皮組織中,在EBV裂解復制狀態(tài)下,病毒顆粒能夠與CR2陽性的上皮細胞上的CR2結(jié)合,或者利用這些觸角與周圍上皮細胞接觸,類似于B淋巴細胞,通過內(nèi)吞作用侵入上皮細胞,而后者,可能與整合素有關(guān)。2.2第二種模式:EBV依賴自身蛋白與上皮細胞上相關(guān)受體相互作用,感染上皮細胞作為一種有包膜的病毒,EBV侵入細胞是通過它的包膜與細胞膜相融合實現(xiàn)的。前已述及,EBV與B淋巴細胞的進入過程需要gp350/220、gp42、gB、gH和gL四種包膜糖蛋白,而進入上皮細胞的過程中除了涉及其中g(shù)p350/220、gB、gH和gL以外,還有BMRF2、整合素等分子的參與。能夠表達CR2分子的上皮細胞,能以與B細胞類似的方式受到EBV感染某些能夠表達CR2的上皮細胞,可以類似于EBV侵入B淋巴細胞的過程,受到EBV的感染。利用重組EBV毒株感染CR2陽性的人胚腎細胞系(293),發(fā)現(xiàn)EBV成功感染293細胞,但由于該細胞系CR2低表達,其感染效率相較于EBV感染B淋巴細胞的效率要低得多。若293細胞與CR2特異性抗體共同孵育后,重組EBV毒株則不能感染該上皮細胞系,表明EBV對293細胞系的感染是由細胞表面人工表達的CR2分子介導。EBV依賴gHgL、gB,直接侵入上皮細胞gp42能夠觸發(fā)EBV包膜與B淋巴細胞膜的融合,卻阻礙EBV與上皮細胞的融合,即未參與對上皮細胞的感染過程。而且,上皮細胞始終缺乏HLAII類分子組成型表達,其融合過程僅涉及gB和復合物gHgL。gH有利于EBV附著與進入上皮細胞,而且gHgL上的KGD模序,是一個具有雙重功能的區(qū)域,其突變體能夠降低與B淋巴細胞和上皮細胞的融合,也能夠降低gHgL與上皮細胞和gp42的結(jié)合。gH的抗體對B淋巴細胞的轉(zhuǎn)化沒有影響,但能夠影響對上皮細胞的感染。在gH殘基594處,將丙氨酸替換為甘氨酸,可以徹底阻礙EBV與B細胞和上皮細胞的融合,但在殘基595處,將丙氨酸替換為谷氨酸,則只是減少與上皮細胞的融合,且能加強與B淋巴細胞的融合。EBVgB在EB病毒包膜與上皮細胞膜的融合過程中有重要的作用。它的CTD(C-terminalCytoplasmicTailDomain)不僅能夠影響病毒糖蛋白gB的表達以及其在細胞內(nèi)的定位,而且能夠調(diào)節(jié)gB促進EBV與宿主細胞的融合功能。突變CTD某一區(qū)域后發(fā)現(xiàn),病毒蛋白的細胞內(nèi)定位發(fā)生了變化,不同的宿主細胞,在融合過程中,與野生型的進行比較,也表現(xiàn)出了不同的實驗結(jié)果。而且結(jié)構(gòu)保守的糖蛋白gB,在缺少異質(zhì)二聚體gHgL的情況下不能介導融合過程。但在gB缺少的情況下,gHgL可以介導膜的半融合。EBVBMRF2與整合素,參與病毒進入宿主細胞EBV侵入不同類型的宿主細胞,要求不同的糖蛋白的參與,gHgL與gHgLgp42的相對含量會影響EBV感染的趨性。缺乏gH的病毒顆粒不能感染上皮細胞,可溶的gHgL可以結(jié)合到上皮細胞上,表明上皮細胞上存在著相應的gHgL受體。然而,上皮細胞表面究竟是哪一種或一類分子能與gHgL相結(jié)合,來觸發(fā)融合過程還不是很明確。有文獻報道,EBV的另一種糖蛋白,BMRF2蛋白,能與整合素β1、α3、α5和αν相結(jié)合,但整合素與BM-RF2蛋白相應的抗體只能部分阻斷EBV與極化上皮細胞的融合。BMRF2與β1整合素可以介導EBV的附著與進入。其中,β1整合素的糖基化對發(fā)揮其功能,非常關(guān)鍵,只有它的成熟形態(tài)才能結(jié)合GST-BMRF2RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)和純化的病毒體到達細胞表面,在EBV的附著與進入起到一定的作用。隨后ChesnokovaLS等人發(fā)現(xiàn),整合素ανβ5、ανβ6和ανβ8能夠作為與gHgL相結(jié)合的特殊受體,觸發(fā)病毒與上皮細胞質(zhì)膜的融合。gH上的亮氨酸殘基序列中有能與ανβ6和ανβ8相結(jié)合的區(qū)域,使gHgL的構(gòu)象發(fā)生改變,進而影響gHgL與gB的相互作用。然而,BMRF2與整合素的相互作用是否直接參與EBV的附著或其隨后的事件,則需要進一步的研究才能證實。Sc與IgA相互作用,通過內(nèi)吞作用,使得EBV進入宿主細胞EBV衣殼蛋白的抗體多聚IgA,有可能介導EBV侵入上皮細胞。多聚IgA普遍存在于人類唾液中,可結(jié)合Sc蛋白,來促進EBV內(nèi)吞,轉(zhuǎn)移至上皮細胞。Sc(Secretorycomponent)蛋白是一種橫跨膜蛋白,在上皮細胞,假復層上皮細胞及中間鱗狀上皮細胞的基地外側(cè)表面表達。來自單核細胞增多癥患者的IgA與EBV相互作用,形成EBV-IgA復合物,而后感染HT29惡性腺癌細胞系,研究發(fā)現(xiàn),細胞中有BZLF1和早期抗原(EAD),同時,PCR也檢測到EBVDNA。因此,EBV-IgA-Sc復合物可以介導EBV通過內(nèi)吞作用進入上皮細胞。隨后的研究發(fā)現(xiàn),在鼻咽癌中,有Sc的存在。通過這一復合物,可以實現(xiàn)EBV感染的鼻咽癌細胞系的建立。但是,在這一過程中,是否還有其他蛋白的參與,則需要進一步的研究。2.3第三種模式:已感染EBV的上皮細胞,可以將產(chǎn)生的病毒顆粒傳遞給鄰近的細胞與EBV誘導的淋巴樣干細胞共培養(yǎng)的上皮細胞能夠被EBV感染,同時,游離的EBV病毒顆粒經(jīng)口咽部上皮細胞基底外側(cè)膜直接感染這些細胞。因此,來自于已感染病毒的上皮細胞釋放的EBV也能直接通過細胞側(cè)膜感染鄰近的上皮細胞,這種細胞與細胞之間的感染也是EBV感染細胞的一種方式。而這一過程,可能涉及EBV其他蛋白以及宿主細胞上相應受體的相互作用,如EBVBMRF-2與整合素的相互作用。然而,這一方式備受爭議。EBV在原發(fā)性感染上皮細胞時,是依賴于B淋巴細胞的接觸感染,且在感染鄰近上皮細胞時,病毒顆粒的復制產(chǎn)出是在初始感染的上皮細胞中發(fā)生的。但是,感染病毒的B淋巴細胞所釋放的EBV顆粒,缺乏gp42,能夠有效地感染上皮細胞,而對于感染B淋巴細胞效率相對較低。相反地,在EBV感染的上皮細胞中,gp42可以重新定位在病毒囊膜上,所釋放的病毒顆粒能夠高效感染B淋巴細胞,不利于EBV與上皮細胞的融合。3、小結(jié)與展望EBV侵入宿主細胞后,會潛伏在宿主細胞中,或是立即進行裂解性復制,其基因組以隨機整合或游離的形式存在于細胞中。越來越多的證據(jù)表明,EBV潛伏感染基因組的存在在相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。血清學和組織病理學的檢查也表明,EBV基因組在腫瘤細胞或組織中的存在伴隨著腫瘤的整個發(fā)生過程,尤其是在低分化和未分化的NPC上皮腫瘤組織中,幾乎所有腫瘤細胞中含有EBV基因組。作為一種外來的病毒抗原,盡管在其感染靜止期的B淋巴細胞后,會激發(fā)B淋巴細胞的大量擴增,并引起一種有效地T細胞反應來抵抗病毒抗原,從而控制感染的B細胞。但是,這種免疫反應,并不能清除病毒。那么在這些異常的鼻咽組織細胞中,是否又有某些免疫因子能夠促進EBV進入宿主細胞;在EBV再次進入已感染的宿主細胞時,EBV在細胞中表達的產(chǎn)物是否對EBV的再次進入有促進作用;以及在微環(huán)境中,是否有更多的未知其他分子協(xié)助該過程的發(fā)生等。這都可以作為進一步研究其機制的思考方向。因此,了解EBV感染進入宿主細胞的方式和機制,對于及早切斷其在細胞內(nèi)發(fā)生作用的途徑具有重要意義。同時,EBV感染上皮細胞的第一種模式中,通過B淋巴細胞轉(zhuǎn)移感染的方式已成為應用于實驗室建立EBV感染的上皮細胞模型的有效手段,這解決了一大實驗難題。所以,了解EBV感染模式也為相關(guān)的機制研究提供了重要的理論依據(jù)。隨著研究的越來越深入,研究者發(fā)現(xiàn)EBV參與更多的腫瘤發(fā)生發(fā)展,對其的研究也更為關(guān)注。EBV是如何與細胞相互作用、如何影響EBV相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展、以及如何尋找針對EBV的相關(guān)腫瘤的診斷和治療的分子標志物,一直都是當前相關(guān)領(lǐng)域中的國際前沿科學問題。這些問題的探討與研究,都是從了解EBV進入宿主細胞的機制開始的。而要徹底的弄清楚這一機制,則需要研究者們付出更大的努力。